Name: label-free single molecule detection using microtoroid optical resonators
Uploaded: 2015-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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This research was supported in part by a National Research Service Award (T32GM07616) from the National Institute of General Medical Sciences.

1。実験のセットアップとサンプルの調製<ol><li>以前に6説明したように、リソグラフィ、エッチング、および融解手順を使用して、マイクロトロイドを製作。一般的に80〜100ミクロンの主要な直径を有するシリコンウェハ（チップ）の上にマイクロトロイドを製作し、2μmの短径。 </li><li>その繊維スプールからおよそシングルモード光ファイバ（125μmのクラッド、4.3ミクロンのモードフィールド径）のメーターをおくつろぎください。 </li><li>光ファイバの巻き出し部分の途中に、ワイヤーストリッパーを使用して光ファイバの周りにポリマーコーティングの小部分（2.5センチ）ストリップ。注：これは、マイクロトロイドにエバネッセント光を結合するために使用される光ファイバの一部です。 </li><li>イソプロパノールアルコールとフリーワイプリントでストリップ繊維をきれいにしてください。 </li><li>磁気クランプ製のファイバホルダを使用して所定の位置に光ファイバのこの部分を持ってください。 </li><li> MELTINによって〜500 nmの薄い取り除か繊維グラム水素トーチ60ミクロン/分の速度で反対方向に動く2ステッピングモータを使用して引っ張ります。 〜10ミリメートル背が高くあるべきである炎の上部、内部に光ファイバを配置します。ファイバを通して送信は（オフに繊維点滅から横方向に散乱した光を見て）、またはオシロスコープに接続されているフォトダイオードに光ファイバを接続することにより、視覚的に監視することのできる、変動停止したときに、繊維を引っ張って停止。 </li><li>光ファイバの一端を切断し、裸ファイバアダプタに挿入します。受光の入力に繊維のこの端を置きます。 </li><li>光ファイバカプラを使用してレーザーのファイバーカップル繊維スプールのもう一方の端を。 </li><li>エポキシ又は両面テープのいずれかを使用して試料ホルダーの上にマイクロトロイドチップ（ステンレス鋼37.8ミリメートル×6.4ミリメートルX 3.2ミリメートル）を配置します。 </li><li> 3軸ナノポジショニング（Nで構成位置決めステージの上に試料ホルダーをマウント3軸マイクロメータの上anocube）ステージ（機器リストを参照してください）​​。振動を最小限に抑えるために、空気圧で分離された光学テーブル上のすべての実験を行います。 </li><li>粗位置3軸マイクロメータを使用して、サンプルチップ。 </li><li>ナノポジショナーを使用して光ファイバにマイクロトロイド含有チップ並列の位置を合わせます。注：入力光（〜633 nm）での1波長の距離内にマイクロトロイドの位置を合わせます。このプロセスの可視化のための2つの撮像列使用上、チップの側に位置する（対物レンズとカメラとチューブを、機器リストを参照してください）​​。 </li><li>偏光を調整するつまみで（機器のリストを参照）、インライン偏光制御器を用いた光ファイバを介して照射されるレーザ光の偏光を最適化します。注意：光ファイバの伝送で測定されたディップが狭く表示されたときに最適な偏光が達成されます。 （詳細については、ステップ2.2を参照）、オシロスコープ上でこのディップを守ってください。 </li><li>構成しますスペーサーとしてガラス顕微鏡スライドを用いて、試料ステージの上にカバーガラスをepoxyingにより試料室。注：全体のセットアップを覆うプレキシグラスエンクロージャは、空気の流れを最小化するために有用であり得ます。小さな開口部は、チューブを使用してポンピングするためのソリューションを可能にするようにしておく必要があります。 </li><li>熱RT水浴（〜500 mL）中≥1時間粒子懸濁液または単一分子の水性溶液を平衡化。注：サンプルは、メーカー、 例えば 、PBSまたはHEPESから指定された関連したバッファを使用してマイクロ遠心チューブに所望の濃度に希釈します。いかなる結合事象が検出されない場合、緩衝液の塩濃度を増加させます。 </li><li> 〜2秒のためのソリューション（1ミリリットル）を簡単に含む渦粒子。 </li><li> 1mlシリンジポンプを用いて1ml /分で試料チャンバに溶液を含む粒子を注入します。 </li><li>試料室を充填した後、シリンジポンプをオフにします。 </li><li>最小限に抑えるために、データを記録する前に30秒待ってください測定に影響を与えることができ、流体の流れに起因する機械的振動の影響。 </li></ol> 2.周波数のロック<ol><li>カップリングが原因で流体の注入に邪魔されるため、ナノポジショナーと試料ホルダーを移動させることにより、光ファイバに再結合しトロイド。 </li><li>様々な波長を介してコンピュータ制御入力レーザを走査することにより、マイクロトロイドの共振波長の位置を確認します。レーザの波長を調整するレーザコントローラ内の圧電素子に三角波電圧信号を送信することによって、この手順を実行します。この波長での水の光の低い吸収があるため、可視光（2.5 nmの±635 nm）を用いた実験を行います。 </li><li>オートバランス受光に光ファイバの出力を接続することにより、光ファイバを介して光透過率を測定します。 BNCケーブルを使用して、オシロスコープに受光の出力を接続します。 O観察nはマイクロトロイドの共振波長において、光ファイバを介して伝送が低下オシロスコープ。 </li><li>ケーブルを介して（機器のリストを参照）、周波数ロックフィードバック制御装置の主入力に受光の出力を接続します。 </li><li> 2 kHzから19 FMの波長振動の振幅のディザリング周波数を持つトップのピークロックを使用して、オートロックモードでフィードバック制御をロックする周波数を実行します。経験的に、チーグラー・ニコルスのチューニング規則14を使用して、ソフトウェアのウィンドウで、比例・積分・微分設定値を設定します。注：これらの値は、すべての実験の開始時に一度設定するだけで済みます。 </li><li>マイクロトロイドの共振波長に対するレーザの波長を自動ロック。試料室を充填した後、この手順を実行します。注：波長シフトが大きすぎる場合には、フィードバック制御がロックを失うことになると自動的に共振波長の位置を見つけるために走査モードに切り替えます。このOC波長に対するCURSは約1線幅（ここでは調査したすべてのシステムのために少なくとも600 FM）よりも大きくシフトします。 </li><li> 24ビットのデータ・アクイジション・カードを使用して、20 kHzでフィードバック制御器の出力を記録します。データ収集ソフトを経由してテキストフ​​ァイルとしてデータをエクスポートします。 </li></ol> 3.データ処理と解析<ol><li>フーリエ変換は、MATLABのデータを変換します。 </li><li>ローは、2 kHzで課されるディザ周波数を除去するために、1 kHzでカットオフを持つ「ブリックウォール」フィルターを使用してデータを渡す（補足コードスクリーンショット1ファイルを参照してください）​​。 </li><li>計算ノッチ16ヘルツのウィンドウサイズを使用してデータをフィルタリングします。注意：これは、この場合には、ノイズの既知のソースを除去するために行われ、60 Hzの電子線ノイズとその高調波、（レーザドライバからの）だけでなく、100ヘルツとその高調波（補足コードスクリーンショット1ファイルを参照してください）​​。 </li><li>逆フーリエ変換は、時間領域に戻ってデータを変換します。 </li><li>メディアンフィルタウィンドウを使用してデータ1,001サンプルの大きさ（補足コードはスクリーンショット2ファイルを参照してください）​​。 </li><li> Kerssemakers ら 15のステップ発見アルゴリズムを用いて、共振波長のステップ変化を探します。 </li><li>各結合工程の振幅のヒストグラムを生成します。 </li><li>式を使用して粒子サイズを計算します。 （1）（説明を参照）。 </li></ol>

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	<li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities.">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li><li>Su, J., Goldberg, A. F. 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R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform.">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li><li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators.">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li><li>&#197;str&#246;m, K. J., Murray, R. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

粒子が結合するように、トロイドは増加の共鳴波長（λ）。粒子がアンバインドした場合、共振波長は、それに応じて（ステップダウンイベント）を減少させます。粒子径（d）は、各波長ステップの振幅のヒストグラムを介して決定することができます。各波長ステップの高さは、結合した粒子の大きさの変化に起因し、粒子が結合マイクロトロイドの位置により変化。粒子が電界（E 0、MAX）は最大でマイクロトロイドの赤道に結合すると共鳴波長（ステップ高さ）の最大変化が起こります。この最大ステップ高さ（Δλ）は 、式を通じて粒子径に関連しています。 （1）8、粒子半径であり、Dは、結合した粒子の屈折率と周囲の媒体に基づいて、誘電率、V mはガーゼのモード体積でありますマイクロトロイドの中tは、有限要素シミュレーション2を通じて決定し、E 0（R s）はまた、有限要素シミュレーションを介して決定粒子赤道での電界の振幅であり： <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/53180/53180eq1.jpg" width="500" />式を反転。 （1）信号強度（Δλ）は粒子体積（3）に比例することを示しています。私たちの誘電率は以下のように定義されます： <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/53180/53180eq2.jpg" width="150" />ここで、周囲の媒体の屈折率であり、粒子の屈折率の屈折率です。式（1）と同様に、追加のヒストグラムおよびサイズ​​的に基づいて、粒子サイズの理論的見積もりculationsは、16 2に示されています。 FLOWERは、フィードバックコントローラをロックする周波数は、マイクロトロイドの波長を追跡する頻度を増加させることによって、より高速な追跡のために変更することができます。しかしながら、メディアンフィルタは、ステップエッジがよりよく保存されるようになり、データ処理の手順ではなく、メディアンフィルタの移動平均を使用して変更することができ、そして結合事象がまだ回復させることができます。この技術の制限は、粒子結合の際にマイクロトロイドの波長シフトがどこに共振器の粒子の土地に依存するという事実があります。このように、単一の粒子の結合の確認は、多くの別々の結合事象のヒストグラムの生成に依存しています。明確な結合事象が検出されない場合、溶媒の塩濃度を増加させることに役立ちます。 既存の方法に関して、この技術の重要性にはラベルが標的分子を調べるために必要とされないことです。選択的結合は、しかし、抗体を用いたセンサーを官能必要です。他の利点は、マイクロトロイドの共振器は高感度表面プラズモン共鳴法に比べてより大きな捕捉面積を有するので、粒子結合事象が発生する可能性が高いという事実が挙げられます。花は光退色も蛍光タグを必要としないためまた、花は高速（ミリ秒）の時間分解能で長い（&gt; 10秒）の測定が可能です。 プロトコル内の重要なステップは、マイクロトロイドと光ファイバテーパを揃えるあります。トロイドを液体中に浸漬されると、液体を介して繊維のあまり動きは、このような実験を終了する、破壊するテーパーを引き起こす可能性があります。現在の製剤中の花は時間の時間スケールでの実験のために不適当です。マイクロトロイドを液体に浸漬した粒子が結合された後に加えて、品質係数（Q）は、回復不可能時間ピークLの時間スケールにわたって低下しますockingは、最終的に不安定になることがあります。この状況では、新しいデバイスが必要とされます。私たちは、共振ピークの周りに非常に小さな範囲で、当社のレーザ周波数をディザリングするので、花が同時に全体の共鳴スペクトルを横切って走査されず、粒子が結合しそのため、リアルタイムでの品質係数の変化を測定しません。前とわずか数粒子の結合後の品質係数を見ると、私たちはかなりのQ値の低下が表示されません。我々は、元の自然のままのトロイドが比較的低いQ値（〜1×10 5 -5x10 6の水にロードされたQ）を持っているので、これがあることを期待しています。 我々は、レーザー誘起変動ノイズが自動バラン​​ス受光を用いて差し引かれることに注意してください。私たちは、直接接触してマイクロトロイドの繊維を配置することによって、トロイドに対する光ファイバの変動を最小限に抑えることができます。 PIDパラメータが正しく設定されていない場合はさらに、変動は、 すなわち 、表示されますシステムしません迅速かつaccuratエリー波長シフトを追跡します。チーグラー・ニコルスチューニングルールが正しくPID設定値14を設定するために使用することができます。ここで概説した手順に従うことで、それは数百ナノメートルから単一の生物学的分子を含む、数ナノメートル、まで及ぶナノ粒子を検出し、サイズが可能であるべきです。

単一分子検出実験は、疾患の早期発見のために、及び分子 3の基本特性を調べるために、バイオセンサーに使用される分析物の量を減少させるために有用です。このような実験は通常、ラベルを使用して実行されますが、ラベルは、特定のタンパク質を得ることが常に可能ではない、コストを増加させ、オンサイト実験やポイント・オブ・イベントが検討されて乱すことができ、かつ不便であることができ、特にリアルタイムのためのケア診断。 無標識バイオセンシングのための現在のゴールドスタンダードは、表面プラズモン共鳴4であり、ただし、商業表面プラズモン共鳴システムは、典型的には、nMの程度の検出の典型的な下限を有します。最近では、光共振器は、ラベルフリー単一分子の生物学的検出のための5有望な技術として浮上しています。光共振器は、光6,7の長期（NS）閉じ込めに基づいて動作します。光がエバネッセントです一般的に光ファイバを介してこれらのデバイスに結合されました。光ファイバを通過する光の波長が共振器の共振波長と一致すると、共振器に効率的にカップルを点灯。この結合された光は、全内部共振器の周付近にエバネッセント場を発生させる共振器の空洞内に反映されます。粒子は、共振器、 粒子 8の体積に比例して共振器の変化の共振波長にエバネセント場とバインドを入力します。 検出能力の点で、微小球共振器は、以前の（100 nm）の9,10ウイルス粒子の単一のインフルエンザを検出するために使用されてきました。最近、plasmonically増強微小球光共振器は、 分子 11と8マーのオリゴヌクレオチド12を 、単一のウシ血清アルブミンを検出するために使用されている、しかし、このアプローチは、デ0.3ミクロン2に粒子捕捉領域を制限します副。大きなキャプチャエリアのバイオセンサーは、粒子検出の可能性を最大化するための理想的です。 （&gt; 100μmの2）大と現在のソリューションベースのラベルフリーバイオセンシング技術領域をキャプチャポリスチレン粒子≥25 nmの検出に限られていました。 我々は、溶液中の単一分子の時間分解検出が可能な周波数ロック光ウィスパリングエバネッセント共振器（フラワー）13（ 図1）として知られている光共振器技術に基づくラベルフリーバイオセンシングシステムを開発しました。花がダウンして、単一のタンパク質分子に小さな粒子を検出するために、周波数ロックフィードバック制御、バランス検出、計算フィルタリングと組み合わせたマイクロトロイドの光共振器の長い光子寿命を使用しています。周波数ロックの使用は、掃引またはレーザ波長を走査する必要なしに、粒子を結合するように、システムは、常に、マイクロトロイドのシフト共鳴を追跡することができ大規模な範囲です。 FLOWERの原理は、プラズモン増強を含む​​他の技術の検出能力を向上させるために使用することができます。以下では、FLOWERを実行するための手順が記載されています。

<table><tbody><tr><td>Tunable diode laser</td><td>Newport</td><td>TLB-6300</td><td></td></tr><tr><td>Laser controller</td><td>Newport</td><td>TLB-6300-LN</td><td></td></tr><tr><td>Frequency locking feedback controller</td><td>Toptica Photonics</td><td>Digilock 110</td><td></td></tr><tr><td>Auto-balanced photoreceiver</td><td>Newport</td><td>Model 2007</td><td></td></tr><tr><td>In-line polarization controller</td><td>General Photonics</td><td>PLC-003-S-90</td><td></td></tr><tr><td>24-bit data acquisition card</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-4461</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human interleukin-2</td><td>Pierce Biotechnology</td><td>R201520</td><td></td></tr><tr><td>20 nm polystyrene beads</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020A</td><td></td></tr><tr><td>NanoCube XYZ Piezo Stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-611.3</td><td></td></tr><tr><td>Optical table</td><td>Newport</td><td>VH3660W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens for imaging column</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Imaging column (adaptor tube)</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>High-Res CCD camera for imaging column</td><td>Edmund Industrial Optics</td><td>NT39244</td><td></td></tr></tbody></table>

label-free single molecule detection using microtoroid optical resonators

ダウン単一分子の限界に分子の低濃度を検出することは、そのような疾患の早期発見、および分子の挙動に関する基礎的研究などの分野に影響を与えています。単一分子検出技術は、一般に、蛍光タグまたは量子ドットなどのラベルを使用し、しかし、ラベルは常に利用可能ではない、コストと複雑さが増大し、研究されているイベントを乱すことができます。光共振器は、ラベルを使用せずに単一分子を検出するための有望な手段として浮上しています。現在、溶液中の非plasmonically増強裸光共振器システムによって検出された最小粒子が25nmのポリスチレン球1です。私たちは、この制限を超えると水溶液2のラベルフリーの単一分子検出を達成することができ、周波数ロック光ウィスパリングエバネッセント共振器（フラワー）と呼ばれる技術を開発しました。信号強度は粒子体積に比例するように、私たちの仕事は、&gt; 100倍improvemeを表しNT現在の技術水準を超える信号対雑音比（SNR）です。ここFLOWERの背後にある手順は、フィールドでの使用を高めるために提示されています。

粒子結合事象は明らかに時間をかけてマイクロトロイドの共振波長の階段状の変化（ 図2A）と見られています。これらのステップの高さは。 図2Bのグラフとして示さ2-4はそれぞれ、代表エキソソームの結合からのトレース（nanovesicles）、5 nmのシリカビーズ、および単一のヒトインターロイキン2分子を示しています。階段状のイベントは、粒子サイズにスケーリングするということは、技術が正しく行われたことを示しています。以下に説明するように、これは、ステップの高さ（ 図2B）のヒストグラムを生成し、理論的な予測に観察された最大ステップ高さを比較することによって分析することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53180/53180fig1.jpg" /> トロイドセンシングシステムの 図1 のブロック図。波長可変ダイオードレーザーからの光はワット分割され<html>カップルがトロイドとオートバランス受光の一方の入力に直接送られ、他の部分に光を光ファイバを介して送信される部分番目。光ファイバの出力はオートバランス受光の第二の入力に送信されます。受光器の出力は、マイクロトロイドの共振波長の値を検索するために、レーザ光を変調フィードバック制御装置に送信されます。粒子は、トロイド、共振周波数シフトに結合しています。レーザの波長とマイクロトロイドの共振波長との差は、レーザーが早くかつできるだけスムーズトロイドの波長を合わせることができ、比例・積分・微分コントローラに送信されます。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53180/53180fig1large.jpg" target="_blank">拡大表示はこちらをクリックしてくださいこの図のバージョン。</a> <html> p_upload / 53180 / 53180fig2.jpg &quot;/&gt; 図 経時 2 共鳴波長の変化を20nmのビーズは、マイクロトロイドの表面に結合するように経時マイクロトロイドの共振波長における（A）シフトは20nmビーズが表 ​​面に結合します。 （B）それぞれの共振波長ステップイベントの高さ（振幅）のヒストグラム。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53180/53180fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53180/53180fig3.jpg" /> 時間の経過とともに図3.共鳴波長変化個々のエキソソームは、マイクロトロイドの表面に結合している。個々の結合事象は、時間の経過とともに、共振波長の離散的な変化（ステップ）と見られています。&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53180/53180fig4.jpg" /> 5 nmのシリカビーズのような時間をかけて、図4共振波長の変化は、マイクロトロイドの表面に結合する。粒子は、受動的吸着を介しトロイドの表面に付着します。粒子結合事象は、時間の経過にトロイドの共振波長の離散的なステップとして見られています。粒子の脱着は下向きのステップとして見られている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53180/53180fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53180/53180fig5.jpg" /> IL-2分子のような時間をかけて、図5共振波長の変化は、マイクロトロイドの表面に結合する。高分子結合事象を時間をかけて、共振波長の離散的なステップとして見られています。これらのステップは、2種類の粒子がほぼ同じサイズであるとして、図4のものと似ています。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53180/53180fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.2K ビュー.  California Institute of Technology. We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented. 

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Fabrication of Silica Ultra High Quality Factor Microresonators

Whispering gallery resonant cavities confine light in circular orbits at their periphery.1-2 The photon storage lifetime in the cavity, quantified by the quality factor (Q) of the cavity, can be in excess of 500ns for cavities with Q factors above 100 million. As a result of their low material losses, silica microcavities have demonstrated some of the longest photon lifetimes to date1-2. Since a portion of the circulating light extends outside the resonator, these devices can also be used to probe the surroundings. This interaction has enabled numerous experiments in biology, such as single molecule biodetection and antibody-antigen kinetics, as well as discoveries in other fields, such as development of ultra-low-threshold microlasers, characterization of thin films, and cavity quantum electrodynamics studies.3-7
The two primary silica resonant cavity geometries are the microsphere and the microtoroid. Both devices rely on a carbon dioxide laser reflow step to achieve their ultra-high-Q factors (Q&gt;100 million).1-2,8-9 However, there are several notable differences between the two structures. Silica microspheres are free-standing, supported by a single optical fiber, whereas silica microtoroids can be fabricated on a silicon wafer in large arrays using a combination of lithography and etching steps. These differences influence which device is optimal for a given experiment.
Here, we present detailed fabrication protocols for both types of resonant cavities. While the fabrication of microsphere resonant cavities is fairly straightforward, the fabrication of microtoroid resonant cavities requires additional specialized equipment and facilities (cleanroom). Therefore, this additional requirement may also influence which device is selected for a given experiment.
Introduction
An optical resonator efficiently confines light at specific wavelengths, known as the resonant wavelengths of the device. 1-2 The common figure of merit for these optical resonators is the quality factor or Q. This term describes the photon lifetime (&tau;o) within the resonator, which is directly related to the resonator's optical losses. Therefore, an optical resonator with a high Q factor has low optical losses, long photon lifetimes, and very low photon decay rates (1/&tau;o). As a result of the long photon lifetimes, it is possible to build-up extremely large circulating optical field intensities in these devices. This very unique property has allowed these devices to be used as laser sources and integrated biosensors.10
A unique sub-class of resonators is the whispering gallery mode optical microcavity. In these devices, the light is confined in circular orbits at the periphery. Therefore, the field is not completely confined within the device, but evanesces into the environment. Whispering gallery mode optical cavities have demonstrated some of the highest quality factors of any optical resonant cavity to date.9,11 Therefore, these devices are used throughout science and engineering, including in fundamental physics studies and in telecommunications as well as in biodetection experiments. 3-7,12
Optical microcavities can be fabricated from a wide range of materials and in a wide variety of geometries. A few examples include silica and silicon microtoroids, silicon, silicon nitride, and silica microdisks, micropillars, and silica and polymer microrings.13-17 The range in quality factor (Q) varies as dramatically as the geometry. Although both geometry and high Q are important considerations in any field, in many applications, there is far greater leverage in boosting device performance through Q enhancement. Among the numerous options detailed previously, the silica microsphere and the silica microtoroid resonator have achieved some of the highest Q factors to date.1,9 Additionally, as a result of the extremely low optical loss of silica from the visible through the near-IR, both microspheres and microtoroids are able to maintain their Q factors over a wide range of testing wavelengths.18 Finally, because silica is inherently biocompatible, it is routinely used in biodetection experiments.
In addition to high material absorption, there are several other potential loss mechanisms, including surface roughness, radiation loss, and contamination loss.2 Through an optimization of the device size, it is possible to eliminate radiation losses, which arise from poor optical field confinement within the device. Similarly, by storing a device in an appropriately clean environment, contamination of the surface can be minimized. Therefore, in addition to material loss, surface scattering is the primary loss mechanism of concern.2,8
In silica devices, surface scattering is minimized by using a laser reflow technique, which melts the silica through surface tension induced reflow. While spherical optical resonators have been studied for many years, it is only with recent advances in fabrication technologies that researchers been able to fabricate high quality silica optical toroidal microresonators (Q&gt;100 million) on a silicon substrate, thus paving the way for integration with microfluidics.1
The present series of protocols details how to fabricate both silica microsphere and microtoroid resonant cavities. While silica microsphere resonant cavities are well-established, microtoroid resonant cavities were only recently invented.1 As many of the fundamental methods used to fabricate the microsphere are also used in the more complex microtoroid fabrication procedure, by including both in a single protocol it will enable researchers to more easily trouble-shoot their experiments.

We describe the use of a carbon dioxide laser reflow technique to fabricate silica resonant cavities, including free-standing microspheres and on-chip microtoroids. The reflow method removes surface imperfections, allowing long photon lifetimes within both devices. The resulting devices have ultra high quality factors, enabling applications ranging from telecommunications to biodetection.

シリカ超高品質ファクターMicroresonatorsの作製

Whispering gallery resonant cavities confine light in circular orbits at their periphery.1-2 The photon storage lifetime in the cavity, quantified by the ...

工学

Optical Trapping of Nanoparticles

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping and manipulating small biological particles. Ashkin and co-workers first demonstrated optical tweezers using a single focused beam1. The single beam trap can be described accurately using the perturbative gradient force formulation in the case of small Rayleigh regime particles1. In the perturbative regime, the optical power required for trapping a particle scales as the inverse fourth power of the particle size. High optical powers can damage dielectric particles and cause heating. For instance, trapped latex spheres of 109 nm in diameter were destroyed by a 15 mW beam in 25 sec1, which has serious implications for biological matter2,3.
A self-induced back-action (SIBA) optical trapping was proposed to trap 50 nm polystyrene spheres in the non-perturbative regime4. In a non-perturbative regime, even a small particle with little permittivity contrast to the background can influence significantly the ambient electromagnetic field and induce a large optical force. As a particle enters an illuminated aperture, light transmission increases dramatically because of dielectric loading. If the particle attempts to leave the aperture, decreased transmission causes a change in momentum outwards from the hole and, by Newton's Third Law, results in a force on the particle inwards into the hole, trapping the particle. The light transmission can be monitored; hence, the trap can become a sensor. The SIBA trapping technique can be further improved by using a double-nanohole structure.
The double-nanohole structure has been shown to give a strong local field enhancement5,6. Between the two sharp tips of the double-nanohole, a small particle can cause a large change in optical transmission, thereby inducing a large optical force. As a result, smaller nanoparticles can be trapped, such as 12 nm silicate spheres7 and 3.4 nm hydrodynamic radius bovine serum albumin proteins8. In this work, the experimental configuration used for nanoparticle trapping is outlined. First, we detail the assembly of the trapping setup which is based on a Thorlabs Optical Tweezer Kit. Next, we explain the nanofabrication procedure of the double-nanohole in a metal film, the fabrication of the microfluidic chamber and the sample preparation. Finally, we detail the data acquisition procedure and provide typical results for trapping 20 nm polystyrene nanospheres.

The following setup approach details low power optical trapping of dielectric nanoparticles using a double-nanohole in metal film.

ナノ粒子の光トラッピング

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

Synthesis and Operation of Fluorescent-core Microcavities for Refractometric Sensing

This paper discusses fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic analysis setup. These structures are based on the formation of a fluorescent quantum-dot (QD) coating on the channel surface of a conventional microcapillary. Silicon QDs are especially attractive for this application, owing in part to their negligible toxicity compared to the II-VI and II-VI compound QDs, which are legislatively controlled substances in many countries. While the ensemble emission spectrum is broad and featureless, an Si-QD film on the channel wall of a capillary features a set of sharp, narrow peaks in the fluorescence spectrum, corresponding to the electromagnetic resonances for light trapped within the film. The peak wavelength of these resonances is sensitive to the external medium, thus permitting the device to function as a refractometric sensor in which the QDs never come into physical contact with the analyte. The experimental methods associated with the fabrication of the fluorescent-core microcapillaries are discussed in detail, as well as the analysis methods. Finally, a comparison is made between these structures and the more widely investigated liquid-core optical ring resonators, in terms of microfluidic sensing capabilities.

Fluorescent-core microcavity sensors employ a high-index quantum-dot coating in the channel of silica microcapillaries. Changes in the refractive index of fluids pumped into the capillary channel cause shifts in the microcavity fluorescence spectrum that can be used to analyze the channel medium.

Refractometricセンシング用蛍光コアマイクロキャビティの合成と操作

This paper discusses  fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic  analysis setup. These structures are based on the ...

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing its free spectral range (FSR), the module is put in parallel with a fiber taper-microcavity system and then calibrated through isolating and eliminating random shifts in the laser frequency (i.e. laser jitter noise). To realize the taper-microcavity junction and to maximize the optical power that is transferred to the resonator, a single-mode optical fiber waveguide is pulled. Solutions containing polystyrene nanobeads are then prepared and flown to the microcavity in order to demonstrate the system&#8217;s ability to sense binding to the surface of the microcavity. Data is post-processed via adaptive curve fitting, which allows for high-resolution measurements of the quality factor as well as the plotting of time-dependent parameters, such as resonant wavelength and split frequency shifts. By carefully inspecting steps in the time-domain response and shifting in the frequency-domain response, this instrument can quantify discrete binding events.

A reference interferometer technique, which is designed to remove undesirable laser jitter noise for nanodetection, is utilized for probing an ultra-high quality factor microcavity. Instructions for assembly, setup, and data acquisition are provided, alongside the measurement process for specifying the cavity quality factor.

Nanodetectionのリファレンス干渉計の実装

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing ...

Fabrication and Testing of Microfluidic Optomechanical Oscillators

Cavity optomechanics experiments that parametrically couple the phonon modes and photon modes have been investigated in various optical systems including microresonators. However, because of the increased acoustic radiative losses during direct liquid immersion of optomechanical devices, almost all published optomechanical experiments have been performed in solid phase. This paper discusses a recently introduced hollow microfluidic optomechanical resonator. Detailed methodology is provided to fabricate these ultra-high-Q microfluidic resonators, perform optomechanical testing, and measure radiation pressure-driven breathing mode and SBS-driven whispering gallery mode parametric vibrations. By confining liquids inside the capillary resonator, high mechanical- and optical- quality factors are simultaneously maintained.

Parametric optomechanical excitations have recently been experimentally demonstrated in microfluidic optomechanical resonators by means of optical radiation pressure and stimulated Brillouin scattering. This paper describes the fabrication of these microfluidic resonators along with methodologies for generating and verifying optomechanical oscillations.

作製とマイクロ流体光力学発振器のテスト

Cavity optomechanics experiments that parametrically couple the phonon modes and photon modes have been investigated in various optical systems including ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

シランカップリング剤を用いた石英系光バイオセンサーへの生物学的プローブの取り付け

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

生物工学

Fabrication and Operation of a Nano-Optical Conveyor Belt

The technique of using focused laser beams to trap and exert forces on small particles has enabled many pivotal discoveries in the nanoscale biological and physical sciences over the past few decades. The progress made in this field invites further study of even smaller systems and at a larger scale, with tools that could be distributed more easily and made more widely available. Unfortunately, the fundamental laws of diffraction limit the minimum size of the focal spot of a laser beam, which makes particles smaller than a half-wavelength in diameter hard to trap and generally prevents an operator from discriminating between particles which are closer together than one half-wavelength. This precludes the optical manipulation of many closely-spaced nanoparticles and&#160;limits the&#160;resolution of optical-mechanical systems. Furthermore, manipulation using focused beams requires beam-forming or steering optics, which can be very bulky and expensive. To address these limitations in the system scalability of conventional optical trapping our lab has devised an alternative technique which utilizes near-field optics to move particles across a chip. Instead of focusing laser beams in the far-field, the optical near field of plasmonic resonators produces the necessary local optical intensity enhancement to overcome the restrictions of diffraction and manipulate particles at higher resolution. Closely-spaced resonators produce strong optical traps which can be addressed to mediate the hand-off of particles from one to the next in a conveyor-belt-like fashion. Here, we describe how to design and produce a conveyor belt using a gold surface patterned with plasmonic C-shaped resonators and how to operate it with polarized laser light to achieve super-resolution nanoparticle manipulation and transport. The nano-optical conveyor belt chip can be produced using lithography techniques and easily packaged and distributed.

The scalability and resolution of conventional optical manipulation techniques are limited by diffraction. We circumvent the diffraction limit and describe a method of optically transporting nanoparticles across a chip using a gold surface patterned with a path of closely spaced C-shaped plasmonic resonators.

ナノ光学コンベヤーベルトの作製と運用

The technique of using focused laser beams to trap and exert forces on small particles has enabled many pivotal discoveries in the nanoscale biological ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

光ファイバを用いて、液滴マイクロフルイディクスのための多色蛍光検出

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.

1分子研究のためのデュアル光ピンセットとマイクロ流体工学の使用

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

生化学

Optical Biosensing

Optical biosensors utilize light to detect the binding of a target molecule. These sensors can utilize a label molecule, which produces a measurable signal such as fluorescence,&#160;or these sensors can be label-free&#160;and use the changes in optical properties, such as refractive index, to sense for the binding of the target molecule. This video introduces both label and label-free optical biosensors, demonstrates their use in the laboratory, and shows some applications of the technology.

Types of Optical Biosensing; Surface Plasmon Resonance SPR

Optical biosensors utilize light to detect the binding of a target molecule. These sensors can utilize a label molecule, which produces a measurable signal such as fluorescence, or these sensors can be label-free&#160;and use the changes in optical properties, such as refractive index, to sense for the binding of the target molecule. This video introduces both label and label-free optical biosensors, demonstrates their use in the laboratory, and shows some applications of the technology.

光によるバイオセンシング

Optical biosensors utilize light to detect the binding of a target molecule. These sensors can utilize a label molecule, which produces a measurable ...