Name: an optimized enrichment technique for the isolation of arthrobacter bacteriophage species from soil sample isolates
Uploaded: 2015-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
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このプロトコルの開発のための資金は、高等教育のための南東ペンシルベニア州コンソーシアムとカブリーニカレッジ科学部によって提供されました。追加の資金と支援はアルカディア大学とImmaculata大学から来ました。我々は、特に親切に私たちの孤立したファージの電子顕微鏡画像を撮影するために、セントジョセフ大学で博士カレンSnetselaarに感謝。追加のサポートは、ゲノミクスと進化科学（SEA-のファージ）プログラムを推進ハワード·ヒューズ医学研究所の科学教育連盟ファージハンターによって提供された。

ファージを単離するためのArthobacter細胞の作製<ul><li>文化アースロバクター·エスピー KY3901コロニーは2〜3日間30℃でインキュベートルリアBertaini（LB）寒天プレート上にストリーク。コロニーを採取し、バッフル培養フラスコ中のLBブロス250ミリリットルに追加し、30℃で225rpmで振盪インキュベーター中でインキュベートし、滅菌ループを使用。 </li><li>ファージ感染実験のために後半早い/指数関数定常期の細胞を得るための成長の約24時間を許可します。後半定常成長状態に真ん中に入るから細胞を防ぐために密接に細菌増殖の状態を監視します。 注：細胞増殖は、後述するファージの単離および精製手順/ステップのために0.5-.0.7間の光学濃度OD 600で構成する必要があります。 </li></ul>土壌サンプルからのファージの2コレクション<ol><li>目的の場所から土壌の200〜400グラムを収集します。注：Arthroba中の細菌以来CTER属は、それらを感染させるファージに見出され、土壌のほとんどの種類に普及していることができる一般的な土壌細菌である。 </li><li>土壌へのファージバッファ（PB）[68 mMの塩化ナトリウム、10mMのMgSO 4を、10mMのTris-CL液（pH7.5）]の少なくとも400 mlを加えPBの少なくとも200ミリリットルになるように十分な大きさのフラスコ内で混合上清中および抽出することが可能である。 </li><li>土壌が中断されるまで、静かに撹拌または旋回により混合し、土壌の堆積物は、典型的には30分を決済することができます。 </li><li>土壌堆積物の破片を除去する重力濾過により濾紙を通して「土壌抽出」を渡す。 </li><li> LB粉末を追加して、2％溶液（200ミリリットル土壌抽出物中の4グラムLB粉末）を作るために混合する。 </li><li>無菌の濾液を得、真空濾過により0.22μmのフィルターを通して溶液を通過させる。可能な場合は、すぐに2.7のステップに進みます。必要性は、4℃で、店舗フィルタリングされたサンプルは、しかし、生存可能なファージ粒子の数を進める前に、一週間までのためである場合削減されます。 </li><li>一定分量の複数の無菌技術を使用してバッフル培養フラスコを振っ滅菌個々の250ミリリットルにフィルター滅菌LB /土壌抽出液の50ミリリットル部分。異なるアースロファージが異なるのCaCl 2の条件で最適に成長するので、最終的な所望の濃度（0-50 mM）を滅菌2.0 M CaCl 2溶液を追加します。 注：私達は私達によって識別アースロファージの大半が1 MM-2.5のCaCl 2の範囲内であることを見つける。しかし、単離されたファージのいくつかは非常に高いのCaCl 2濃度で0のCaCl 2 .ORで独占的に我々が成長した。 3.1すぐにステップ進んでください。 </li></ol> 3.ファージの単離<ol><li>フラスコのそれぞれに1後半早い/指数関数定常期の細菌培養物を2.5ミリリットルに追加します。 0.5から0.7 OD 600のために、細胞の1ミリリットルを使用しています。 0.7のODよりも高いOD 600の場合の2.5ミリリットルを使用細胞。 注：指数関数的増殖期の細胞は、通常より多くのファージは、固定相成長の細胞よりも高い力価が得られる。 </li><li>振盪インキュベーター中で約24時間、30℃、250rpmで振盪フラスコ。 </li><li> 24時間のインキュベーション期間の後、振盪インキュベーターから濃縮フラスコを取り除き、濃縮サンプルをファージ緩衝液中で10倍に希釈する。 </li><li>後半早い/指数関数定常期の細菌培養物0.5ミリリットルで培養管を設定し、培養管に集積培養の様々な量（PBで10 -1希釈液500μlに5μl）を追加します。 注：これは、それぞれの土壌サンプルを濃縮した後に別のファージ力価を生成するので広範囲の濃度をテストすることをお勧めします。 </li><li>オリジナルの濃縮フラスコに存在する濃度に最終濃度が等しくなるように培養管に塩化カルシウムを追加します。 W多くのファージを選択するために異なるのCaCl 2濃度の範囲を使用してくださいi番目のCaCl 2の依存関係を変化させる。 注：ほとんどのファージは1〜2.5 mMとのCaCl 2の範囲内で分離されますが、0〜50のCaCl 2濃度からどこでも最も最適に分離されたファージがある。このためには、ユニークな孤立したアースロファージの数を最大化するのCaCl 2濃度の範囲を確認するのが最善です。 </li><li>培養管にLBトップアガーの4.5ミリリットルを混合し、LB寒天プレート上に混合物を注ぐ。均等にプレート全体に分散し、約15分間固化するトップアガーを可能にするために穏やかに渦巻。 注：トップ寒天は、より大きなバッチ（250ml）中で調製する​​ことができ、余分なトップ寒天を室温で保存し、少なくとも2週間、その後の実験のために再利用することができる。トップ寒天を作るために使用される様々な式がありますが、私たちは、LBと混合した寒天の7グラム/ Lを使用して寒天トップを作る実験の過程で液体状態を保持するための60°Cの水浴中でトップアガーを置く。 </li><li>反転トン彼プレートと48時間に（温度30℃）でO / N所望の温度でインキュベートする。これらの条件が存在するファージのために最適化することが異なります。ほとんどの単離されたファージを、24時間のインキュベーション期間の後に1〜2.5のCaCl 2濃度で30℃でインキュベートしたプレートから来る。 </li></ol> 4.ファージ精製<ol><li>プレート上のプラーク形成のための24時間のインキュベーションのチェックの後。全くプラークが明らかでない場合には最大72時間のインキュベーションを続行するか、追加のプラークが表示されますかどうかを判断する。週間まで4℃で前に進むのための推定プラークと、店のプレートを必要に応じて。 注：それは一つのプレート上の異なるプラークの形態の多様を見つけることは珍しいことではありません。インキュベーションの3日後にプラークを見つけることは可能ですが、まれである。 </li><li>ストリークプラーク法を用いて明らかに単離されたプラークから、所望のファージを精製する。無菌木製の棒でプラークをタッチします。炎を通して木の棒を実行することにより、ストリークプラークを、allowin簡潔に冷却した後、 図1に示すように、穏やかな運動で寒天プレート上の棒をこすりするGスティック。各パスのためのクリーンスティックを使用してこれを繰り返します。 </li><li>また、個々のファージプラークを分離するために、伝統的なプラーク力価アッセイを使用しています。プラーク力価アッセイは、LB寒天LB上層寒天と、ファージプラークを単離するためのペトリ皿のような材料として、複数の試薬の使用を必要とする。我々は、ストリークプラーク法を用いて非常に成功しているが、それは、プラーク力価アッセイを用いて、個々のプラークを単離することが技術的に容易である。 </li><li> LB寒天プレートを少なくとも3回に画線すると、推定上のファージ粒子の最低濃度領域をマークし、GENTLY母板として塩化カルシウムの同じ濃度を含む（ アルスロ 0.5mlの溶融LBトップアガー4.5mlの適用）、それは、プレート全体に均等に分散することができます。 </li><li>プレートO / Nを反転し、インキュベートする。ストリークプラークを繰り返します純粋なファージ種を確保するために、少なくとも3回の反復のための技術が単離される。ファージの生存率の有意な損失なしにすじの間で、必要に応じて週まで4℃で保存プレート。 </li><li>一度希望するプラークが、最終的なストリークプレート上で増殖させ、単離されている、マイクロピペットの先端で1よく孤立したプラークをタッチし、100μlのPBで再サスペンド。シリアルに新鮮なPBの180μLにサンプルを20μlを渡すことで、10 -8希釈にこの10 0ソリューションを希釈する。 </li><li> CaCl 2を同じ濃度で含有する溶融LBトップアガー4.5 mlの感染細菌を混合して5〜10室温で分およびプレート培養チューブ中で増殖させたアルスロ 0.5mlの各希釈物10μlを追加するファージを単離するために使用元の土壌サンプルから。次の日まで4℃で行われたすべての希釈液を保存します。 </li><li>伝統的なプラーク力価としてを使用してWebパターンを作るために必要なファージの連続希釈を決定します言う。プラーク力価アッセイの目的は、ウェブパターン板を得るために必要なファージ力価を決定することである。として主に細菌を欠いたが、まだのファージによって溶解されていない細菌の残骸を含むWebパターンプレートを識別します。無菌の50ミリリットル培養フラスコに後半早い/指数関数的に静止アルスロ文化の 5ミリリットルを追加します。 <ol><li>培養フラスコ内（ アースロ文化にウェブパターンを与えた）希釈液100μlを加え、ファージを室温で5から10分間細菌細胞に感染することができます。最初に10新鮮なLBプレート上にプレートし、ファージをこの混合物を5mlを識別するために使用されるのCaCl 2の同じ濃度を含む溶融LB上層寒天と混合する。固化し、30℃で反転したプレートをインキュベートすることを許可する。 </li></ol></li><li>次の日は、4℃または室温で4時間後にPBや店舗O / N 5mlのウェブパターンプレートをあふれさせる。 </li><li> 0.22μmのシリンジフィルターを通してファージ溶解物をフィルターそして4℃で保存する。ファージ粒子の電子顕微鏡像、標準的な手順を用いてDNAの制限酵素分析およびゲノム配列決定のためのファージゲノムDNAの分離のような追加の実験のために、この最後のファージストックを使用する。ファージストックの長期保存のため、-80℃でストック·アーカイブ用の小さなバイアルに無菌グリセロールにファージ溶解等量のを追加します。 注：これらのファージ技術で経験していない人のために、偉大なリソースがオンラインでアクセスwww.phagesdb.orgサイトです。 </li></ol>

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	<li>Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Catabolic+Pathways:+Genomic+Insights+into+Microbial+s-Triazine+Metabolism.">Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism.</a> J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).</li><li>Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Atrazine+Degrading+Arthrobacter+sp.+AD26+and+Use+of+this+Strain+in+Bioremediation+of+Contaminated+Soil.">Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil.</a> J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).</li><li>Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+an+Arthrobacter+sp.+Strain+HB-5+that+Transforms+Atrazine.">Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine.</a> Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).</li><li>Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+Enrichment+from+Soil+and+Water.">Bacteriophage Enrichment from Soil and Water.</a> Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).</li><li>Fullner, K. J., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteriophage+L5+Infection+of+Mycobacterium+bovis+BCG:+Implications+for+Phage+Genetics+in+the+Slow-growing+Mycobacteria.">Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).</li><li>Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Growth+Characteristics+on+Stationary+Phase+Achromobacter+cells.">Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells.</a> J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).</li><li>Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+Bacteriophage+Average+Burst+Size+Varies+with+Escherichia+coli+B23+Cell+Culture+Age.">T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age.</a> Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).</li></ol>

著者は競合する経済的利益を宣言していない。

アルスロホストに感染することができるファージを単離するための多くの以前の試みにもかかわらず、私たちは、標準的な濃縮手順を使用してほとんど成功していた。環境サンプルからファージを豊かにするバンTwestとKropinski 10によって開発され、適合した細菌の濃縮の一般化された方法は、濃縮手順の大多数のための基礎のまま。以前の研究からの証拠は、ダイレクトプレ?...

土壌環境でのロバクター種の普遍性は、宿主細菌のこの種から単離されることができるファージの膨大な数と多様性を提供しています。 Acintobacteriaceaeファミリーの細菌メンバーは、アトラジン、様々な他の殺虫剤や除草剤の1,2,3のような扱いにくい化合物を分解することが彼らの異化経路のための最も注目すべきである。ほとんどの研究は、 アルスロバクターの環境の株を用いて行われたが、この属の臨床分離株は、血液、尿、目、すべての系統発生異質4を表示する他の多くのヒト供給源において見出される。 アースロバクター菌の研究のかなり大規模なボディがありますが、唯一の少数の研究は、この多様な属のメンバーに感染することができるのファージについて報告する。興味深いことにしかし、 アルスロで以前に行われた作業は、土壌のタイピングなど、いくつかの重要な個別のトピックにタッチをファージを&lt;em&gt;のアルスロバクター種5、活性汚泥処理プラント6、及び作業強調部位特異的組換えおよびインテグラーゼ遺伝子7において有害な泡の低減を目的と工業用途。 様々な濃縮技術プロトコルは、純粋なファージは、 アルスロバクター種において単離生成するために使用されてきた。初期の手順は、1年以上8の期間のためのニコチン塩のような追加された有毒物質しかA.に感染することができるのファージを生じさせるとともに、土壌のインキュベーションを含むスロバクター 。不安定な有機物が長い潜伏期間を8を省略し 、プラークアッセイ技術により検出可能なファージを生成するために登場して土を使用して行われた研究は、パーコレート。興味深いことに、ダイレクトプレーティングに似た手法は、低い成功率の過去の研究を引用して、まだ研究者5によって著しく低い成功率を有しながら、いくつかのファージを生じる過去に使用した<s&gt; 8まで。 全体的に、過去に使用される分離技術は、最も一般的な好気性土壌を表すロバクター属にもかかわらず、実際にはほとんど効 ​​果を持つために注目すべきであったが、自然4,9に隔離する、水や土壌からファージを単離するためのヴァンTwestとKropinski 10現在の濃縮方法環境細菌分離株が、これらの濃縮技術を豊かにするために使用される以前の技術から適応は、 アルスロファージを単離する非効率的な証明した。ここで説明する方法の目的は、初期の濃縮方法は、この細菌属からファージを単離することに関連した以前の技術的な課題を克服し、一貫して効果的にアースロファージを分離するように適合させることができることを「コンセプトの証明」を示すことです。

<table><tbody><tr><td>LB Broth powder</td><td>Fisher</td><td>BP9722-2</td><td>It&#039;s best to order these in bulk.</td></tr><tr><td>Granulated Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>It&#039;s best to order these in bulk.</td></tr><tr><td>0.22 um syringe filters</td><td>Fisher</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um buchner filters</td><td>Fisher</td><td>430320</td><td>More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipets individual</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Fisher</td><td>76002844</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Fisher</td><td>76002845</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipets individual</td><td>Fisher</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipets individual</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Whatman qualitative filter paper</td><td>Fisher</td><td>1001-824</td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized enrichment technique for the isolation of arthrobacter bacteriophage species from soil sample isolates

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

アースロファージのための改善された濃縮技術の再現性を実証するために、30種類の土壌サンプルは、固有のアースロファージは、この濃縮を使用して採取した土壌サンプルの22から得られたこれらの30の土壌サンプルの2014年の春と夏の間、異なる時間と場所で使用した手順。標準濃縮手順は、同じ土壌試料の3からユニークなファージを得た。濃縮サンプルは、プラークまたは?...

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An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

の単離のための最適化された濃縮技術<em&gt;アルスロ</em&gt;バクテリオファージ種土壌サンプルの分離株から

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Environment

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

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Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous catalytic enzymes and are naturally capable of metabolizing hydrocarbons. Scientists harness biodiversity in aquatic ecosystems to isolate bacteria with biodegradation and bioremediation potential. Such isolates from the environment provide a rich set of metabolic pathways and enzymes, which can be further utilized to scale up the degradation process at an industrial scale. In this article, we outline the general process of isolation, propagation, and identification of bacterial species from aquatic habitats and screen their ability to utilize hydrocarbons as the sole carbon source in vitro using simple techniques. The present protocol describes the isolation of various bacterial species and their subsequent identification using the 16S rRNA analysis. The protocol also presents steps for characterizing the hydrocarbon degrading potential of bacterial isolates. This protocol will be useful for researchers trying to isolate bacterial species from environmental habitats for their biotechnological applications.

We present the process of isolating, propagating, and characterizing hydrocarbon-degrading bacteria from aquatic habitats. The protocol outlines bacterial isolation, identification by the 16S rRNA method, and testing of their hydrocarbon-degrading potential. This article would help researchers in characterizing microbial biodiversity in environmental samples, and specifically screen for microbes with bioremediation potential.

水生生物生息地からの炭化水素代謝特性を有する細菌種の単離・増殖・同定

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous ...

環境学

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

免疫・感染学

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

ソフト寒天オーバーレイ技術の使用は、細菌産生阻害する化合物をスクリーニングするために

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of Massachusetts (USA). Since then MTB have been discovered in stratified water- and sediment-columns from all over the world2. One feature common to all MTB is that they contain magnetosomes, which are intracellular, membrane-bound magnetic nanocrystals of magnetite (Fe3O4) and/or greigite (Fe3S4) or both3, 4. In the Northern hemisphere, MTB are typically attracted to the south end of a bar magnet, while in the Southern hemisphere they are usually attracted to the north end of a magnet3,5. This property can be exploited when trying to isolate MTB from environmental samples.
One of the most common ways to enrich MTB is to use a clear plastic container to collect sediment and water from a natural source, such as a freshwater pond. In the Northern hemisphere, the south end of a bar magnet is placed against the outside of the container just above the sediment at the sediment-water interface. After some time, the bacteria can be removed from the inside of the container near the magnet with a pipette and then enriched further by using a capillary racetrack6 and a magnet. Once enriched, the bacteria can be placed on a microscope slide using a hanging drop method and observed in a light microscope or deposited onto a copper grid and observed using transmission electron microscopy (TEM).
Using this method, isolated MTB may be studied microscopically to determine characteristics such as swimming behavior, type and number of flagella, cell morphology of the cells, shape of the magnetic crystals, number of magnetosomes, number of magnetosome chains in each cell, composition of the nanomineral crystals, and presence of intracellular vacuoles.

We demonstrate a method to collect magnetotactic bacteria (MTB) that can be applied to natural waters. MTB can be isolated and enriched from sediment samples using a relatively simple setup that takes advantage of the bacteria's natural magnetism. Isolated MTB can then be examined in detail using both light and electron microscopy.

当然のことながら環境から磁性細菌の発生の収集、分離、濃縮

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

生物学

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This process has notably lower efficiencies in the Lyme disease spirochete relative to other, better-characterized Gram-negative bacteria. The rate of success of transformation is highly dependent upon having concentrated amounts of high-quality DNA from specific backgrounds and is subject to significant strain-to-strain variability. Alternative means for introducing foreign DNA (i.e., shuttle vectors, fluorescent reporters, and antibiotic-resistance markers) into B. burgdorferi could be an important addition to the armamentarium of useful tools for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. Bacteriophage have been well-recognized as natural mechanisms for the movement of DNA among bacteria in a process called transduction. In this study, a method has been developed for using the ubiquitous borrelial phage &#966;BB-1 to transduce DNA between B. burgdorferi cells of both the same and different genetic backgrounds. The transduced DNA includes both borrelial DNA and heterologous DNA in the form of small shuttle vectors. This demonstration suggests a potential use of phage-mediated transduction as a complement to electroporation for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. This report describes methods for the induction and purification of phage &#966;BB-1 from B. burgdorferi, the use of this phage in transduction assays, and the selection and screening of potential transductants.

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

The ability of bacteriophage to move DNA between bacterial cells makes them effective tools for the genetic manipulation of their bacterial hosts. Presented here is a methodology for inducing, recovering, and using &#966;BB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi, to transduce heterologous DNA between different strains of the Lyme disease spirochete.

ライム病スピロヘータ・ボレリア・ブルグドルフェリのファージ媒介遺伝子操作

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

インタラクトーム Seq: Domainome ライブラリーの構築、検証およびバクテリオファージの表示と次世代シーケンシングによる選択のプロトコル

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular fungi such as molds and unicellular fungi, broadly defined as yeasts, fulfill essential roles in soil ecosystems as decomposers of organic material and as food sources for other soil dwellers. Fungal species diversity in soil is dependent on a multitude of climatic factors such as rainfall and temperature, as well as soil properties including organic matter, pH, and moisture. Lack of adequate environmental sampling, especially in regions of Asia, Africa, South America, and Central America, hinders the characterization of soil fungal communities and the discovery of novel species. 
We characterized soil fungal communities in nine countries across six continents using ~4,000 soil samples and a protocol developed in the laboratory for the isolation of yeasts and molds. This protocol begins with separate selective enrichment for yeasts and the medically relevant mold Aspergillus fumigatus, in liquid media while inhibiting bacterial growth. Resulting colonies are then transferred to solid media and further processed to obtain pure cultures, followed by downstream genetic characterization. Yeast species identity is established via sequencing of their internal transcribed spacer (ITS) region of the nuclear ribosomal RNA gene cluster, while global population structure of A. fumigatus is explored via microsatellite marker analysis. 
The protocol was successfully applied to isolate and characterize soil yeast and A. fumigatus populations in Cameroon, Canada, China, Costa Rica, Iceland, Peru, New Zealand, and Saudi Arabia. These findings revealed much-needed insights on global patterns in soil yeast diversity, as well as global population structure and antifungal resistance profiles of A. fumigatus. This paper presents the method of isolating both yeasts and A. fumigatus from international soil samples.

This protocol is an effective, speedy method of culturing yeasts and the mold Aspergillus fumigatus from large sets of soil samples in as little as 7 days. The methods can be easily modified to accommodate a range of incubation media and temperatures as needed for experiments.

土壌からの培養酵母・カビの分離による菌群構造調査

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

低MW遺伝子の濃縮による環境AMR評価の効率的化技術

Enhanced Extraction of Low-Molecular Weight DNA from Wastewater for Comprehensive Assessment of Antimicrobial Resistance

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has emerged as the source of choice to sample pathogen burdens in the environment. Wastewater from open drains and community water treatment plants is a reservoir of both pathogens and antimicrobial resistance (AMR) genes, and frequently comes in contact with humans. While there are many methods of tracking AMR from water,&#160;isolating good-quality DNA at high yields from heterogeneous samples remains a challenge. To compensate, sample volumes often need to be high, creating practical constraints. Additionally, environmental DNA is frequently fragmented, and the sources of AMR (plasmids, phages, linear DNA) consist of low-molecular-weight DNA. Yet, few extraction processes have focused on methods for high-yield extraction of linear and low-molecular-weight DNA. Here, a simple method for high-yield linear DNA extraction from small volumes of wastewater using the precipitation properties of polyethylene glycol (PEG) is reported. This study makes a case for increasing overall DNA yields from water samples collected for metagenomic analyses by enriching the proportion of linear DNA. In addition, enhancing low-molecular-weight DNA overcomes the current problem of under-sampling environmental AMR due to a focus on high-molecular-weight and intracellular DNA. This method is expected to be particularly useful when extracellular DNA exists but at low concentrations, such as with effluents from treatment plants. It should also enhance the environmental sampling of AMR gene fragments that spread through horizontal gene transfer.

著者スポットライト:培養ベースの技術とゲノミクスの組み合わせによる環境中の抗菌薬耐性の理解と検出

Here, we present a simple technique to assess environmental antimicrobial resistance (AMR) by enhancing the proportion of low-molecular-weight extracellular DNA. Prior treatment with 20%-30% PEG and 1.2 M NaCl allows detection of both genomic and horizontally transferred AMR genes. The protocol lends itself to a kit-free process with additional optimization.

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化 

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has ...

の単離のための最適化された濃縮技術

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水生生物生息地からの炭化水素代謝特性を有する細菌種の単離・増殖・同定

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

ソフト寒天オーバーレイ技術の使用は、細菌産生阻害する化合物をスクリーニングするために

当然のことながら環境から磁性細菌の発生の収集、分離、濃縮

ライム病スピロヘータ・ボレリア・ブルグドルフェリのファージ媒介遺伝子操作

インタラクトーム Seq: Domainome ライブラリーの構築、検証およびバクテリオファージの表示と次世代シーケンシングによる選択のプロトコル

土壌からの培養酵母・カビの分離による菌群構造調査

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化