Name: measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers
Uploaded: 2015-06-16T13:00:00.000+00:00
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Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration.</a> J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).</li><li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculator+programs+for+computing+the+composition+of+the+solutions+containing+multiple+metals+and+ligands+used+for+experiments+in+skinned+skeletal+muscle+cells.">Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells.</a> Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).</li><li>Chase, P. B., Kushmerick, M. 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透過性の単一骨格筋線維の収縮特性の評価は、コンテキストの多種多様な筋機能を調査するために使用されます。例としては、繊維構造と機能に12、運動10,13,14、宇宙飛行15、傷害2,3,16、薬物治療17,18、疾患19および遺伝子操作20,21の老化の影響を評価した研究があります。による直接ネイティブ構成で筋原線維の収縮性能を評価する能力に、この技術は、信号伝送と励起誘発性カルシウム放出神経筋に存在する潜在的な交絡効果の筋原繊維の機能は存在しないの理解を形成するのに魅力的なプラットフォームを提供します研究中のシステムに含まれています。また、単繊維の機能テストは、これらのような収縮タンパク質同定の結果を補完するために使用することができ免疫組織化学またはゲル電気泳動+ウエスタンブロット22を経て得られました。 骨格筋の主要な機能の一つは、力を生成することです。したがって、SF 0、収縮システムの固有の力発生能力の尺度は、筋肉の生理学に大きな関心があります。 SF o の信頼性の推定値は、繊維CSAとF Oの両方の正確な措置を必要とします。繊維は、断面において、一般的に、円形でもない、またその長さに沿ってCSAが均一であるので、CSAを推定する際に、細心の注意を払うべきです。この目的のために、測定は、90°で分離された2つの観点から、それぞれの位置で、繊維の長さに沿ったいくつかの場所で作られています。 F o の信頼性の尺度は、カルシウム濃度Tと活性化溶液を用い、厚い及び薄いフィラメントの重なりを最大にするために、筋節の長さを調整する、受動的な力を占めを含むいくつかの詳細に注意を必要とします最大活性化ハット結果は、所望の実験温度に維持し、実験の日の前の繊維の最適な保存条件（温度及び時間）を維持します。 ここで説明する手順は、最大等尺性力を評価するための手順を説明しているが、それは骨格筋線維の他の重要な機能の品質を評価することがしばしば望ましいです。これは、繊維の追加の機械的操作を含むように実験プロトコルを拡張することによって達成することができます。例えば、繊維は、異なる負荷の一連に対して短縮する速度の測定は、力のパワーおよび速度パワー関係は10,23,24を計算することが可能な力-速度関係の決意を可能にします。また、無負荷短縮の速度は、弛み誘発短縮一連の工程を適用することから成る「たるみ試験」25、及びmeasuriを用いることによって決定することができますたるみを除去するために、ファイバによって必要な時間をngの。頻繁に報告されている別の運動パラメータが一時的にすべてのクロスブリッジ26を切り離し機械的摂動次力再開発のためのK TR、速度定数です。最後に、カルシウム濃度と活性力発生（「強制-PCAの関係」）との間の関係は、多くの場合、興味18であり、収縮を活性化するための閾値以下の範囲のカルシウム濃度を有する一連の溶液に繊維を曝すことによって決定することができます最大活性化とそのための最大の力（FのO）を誘発するのに十分なものにシステム。 上記の機器の多くは単繊維の収縮性を評価するために必要とされているが、他の機器では絶対に必要というわけではありません。長さコントローラは、例えば、繊維の急速なまたは正確な延長または短縮を必要とする任意の実験プロトコルのために不可欠です、（力レコード内のゼロ力レベルはまだいくつかの手段によって識別されなければならないが）が、最大等尺性力を評価するために絶対に必要ではありません。実験室内に繊維を配置するときの断面積を評価するのに有用ながら、側面からの繊維の観察を可能にするプリズムは、絶対に必要ではありません。さらに、種々の実験の溶液に繊維を露出させるための代替手段は、チャンバーの手動操作系または溶液の迅速な充填および排出を可能にする単一のチャンバを工夫するなど、使用することができます。このような15°Cのサブ生理学的実験の温度は一般的に機械的な測定1,2,3,5,8,12,17,27の再現性を改善するために使用される最後に、それは他の温度23に有効なデータを生成することができます溶液特性（ 等カルシウム濃度、pH）に対する温度の影響を考慮する限り、28。 </P&gt; 試験液の組成は、ここで説明する透過処理繊維技術の最も重要な側面の一つです。溶液組成物に関する検討事項は複雑であり、この記事の範囲を超えています。プロトコルセクションの手順5で説明したソリューションは、一定のイオン強度、陽イオン組成、および浸透圧6,29を維持しながら解決策を活性化に事前に活性化からの転送時に、透過性繊維の急速な活性化に重点を置いて設計されています。溶液組成物への他のアプローチは、他の研究グループによる顕著な成功を収めて使用され、一般的に公開された結合定数と計算ツール27,30,31を利用することがされています。様々な活性化溶液中のカルシウムイオンの濃度は、このような力-PCAの評価として最大下の活性化を含む研究において特に重要です。そのようなもののような繊維が完全に活性化された実験について説明しますDここで、活性化溶液中のカルシウム濃度は、典型的には、その正確な知識があまり重要で作る最大の力を達成するために必要な余裕によって越えます。クレアチンリン酸の添加は、そうでない場合は、収縮活性に関連するであろうintramyofibrillar ATPおよびADPの変動を緩衝するために重要です。クレアチンキナーゼは、ADPのクレアチンリン酸からのリン酸転移を触媒するために必要とされます。高温での作業や高速ファイバ32の高速短縮を測定するなど、高いATP離職率につながる実験条件の下では、クレアチンキナーゼは、繊維に結合したままで、内因性のクレアチンキナーゼを補充するために溶液に添加されなければなりません。あまり厳しい実験条件のために、ATP再生系27はあまり重要です。 透過性単繊維技術の制限は、以下のものが挙げられます。これらのテストによって生成されたデータは、定義します実験装置に取り付けられた特定の筋原繊維ユニットの収縮特性。したがって、これは、セグメントが順番に、筋肉内の繊維の総数のごく一部を表す、取得された全体多核繊維のごく一部を捕捉します。研究者らは、このように、慎重に実験から引き出された任意の結論をサポートするために必要なサンプリングを検討する必要があります。さらに、繊維機能の運動トレーニングの介入の影響を評価する評価した繊維が実際にトレーニング中に動員されたことを前提としています。プロトコルは、繊維の自然な細胞内環境を模倣しようとしたが、筋細胞膜の透過化処理は、非特異的であり、必ずしも可溶性の細胞内成分が自由に入浴液中に拡散することができます。膜透過性のさらなる結果は、繊維体積33に腫脹によって証明浸透圧バランスの変化です。ザ繊維の膨潤は、筋フィラメントシステム34,35の減少カルシウム感受性の結果、アクチンとミオシンフィラメントの間の距離が大きくなりますが、大規模な、浸透活性化合物34の導入によって逆転させることができます。考慮すべき最後の制限は、実験装置に繊維を取り付けるために使用される技術の結果です。これは、常に機能欠損に出席して、取付点で近くフィラメントシステム内の空間的関係を歪める必要です。具体的には、時の繊維および取り付け点に隣接する領域は、機能的に侵害され、それによって、測定システムへの人為シリーズ弾性を貢献しています。 要約すると、我々は、 インビトロで化学的に透過性骨格筋線維の力発生能力を評価する手段を記載しています。この記事の焦点は、最大等尺性力の評価になっているがgeneratinヒト骨格筋線維gの容量、実験的なアプローチは、修飾された哺乳動物または他の種の範囲にわたって速度パラメータとの関係の多様を決定するために拡張することができます。

骨格筋の主要な機能は、力を生成することです。筋力は運動神経活動電位、神経筋伝達、筋線維の活動電位、細胞内カルシウムの放出、および規制と収縮タンパク質の系の活性化が含まれる事象の複雑なシーケンスをin vivoで誘発されます。力発生は、この配列の最終的な結果であるので、力の赤字は、個々のステップのうちの1つまたは複数の障害が原因で発生することが。透過処理繊維の準備の重要な属性は、筋原線維装置が残りに関連した唯一の規制および収縮機能を、in vivoでの力発生のために必要な手順のほとんどを排除することです。研究者は、カルシウムとエネルギー（ATP）を活性化の配信の制御を想定しており、それらの天然の共同で、単離された規制や収縮構造の評価を可能にする簡略化したシステムで報われますnfiguration。 in vivoで観察された筋機能の変化を評価する際に透過性骨格筋線維を用いた力の測定は、このように有用です。例えば、私たちは、ミオスタチン欠損マウス1から繊維の力発生能力を特徴づけるために持続的な筋力低下の原因を評価するためにこの技術を使用している慢性腱板涙2,3次を示しました。 現代の透過処理繊維の方法論は、初期の影響力の研究4,5にトレースし、多数の研究グループによって現在使用中であることができます。技術は、文献に記載されているが、それらはまだビデオフォーマットで提示されていません。この記事の目的は、化学的に透過性に骨格筋試料から単繊維の最大の力を発生する能力を測定するための更新、有効かつ信頼性の高い技術を説明することです。これを達成するために、個々の繊維セグメントは、（本明細書で言及しました̶0;繊維」）繊維のプレ透過性バンドルから抽出され、リラックスした溶液、&lt;10nmのカルシウム濃度となっている決定的な特徴を含む実験用チャンバ内に配置されています。繊維は、次に、力変換器の一方の端部と、長さ制御の他方の端部に取り付けられています。最適なサルコメア長で開催された繊維では、最大活性化し、それによって最大の等尺性収縮力を誘発するのに十分なカルシウム濃度を有する活性化溶液に移されます。力データは、取得された格納されたパーソナルコンピュータを用いて分析します。

<table><tbody><tr><td>Polystyrene culture test tube with cap</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-956-3D</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml screw cap microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-681-334</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml microcentrifuge caps with o-ring</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-681-358</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge cryobox</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>5055-5005</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Mettler-Toledo</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Nonsterile-suture 10-0 monofilament</td><td>Ashaway Line Twine</td><td>S30002</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Forceps - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Micrometer drives</td><td>Parker Hannifin</td><td>3936M</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>Water bath circulator&amp;nbsp;</td><td>Neslab Instruments</td><td>RTE-111</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>Aplha Omega Instruments</td><td>Series 800</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW software</td><td>National Instruments</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Varied</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Chamber system</td><td>Aurora Scientific</td><td>802D</td><td></td></tr><tr><td>Length-controller</td><td>Aurora Scientific</td><td>312C</td><td></td></tr><tr><td>Force-transducer</td><td>Aurora Scientific</td><td>403A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>K-proprionate</td><td>TCI America</td><td>P0510</td><td></td></tr><tr><td>Imadizole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Brij 58</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ATP&amp;bull;0.56H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>MgO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529699</td><td></td></tr><tr><td>HDTA (acid)</td><td>TCI America</td><td>D2019</td><td></td></tr><tr><td>CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>KOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>35113</td><td></td></tr><tr><td>HCL (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CrP&amp;bull;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>pH 10 standard</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB115</td><td></td></tr><tr><td>pH 7 standard</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB107</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

健康、化学的に透過性に単繊維の形状が均一に表示され、高倍率で見たときに、一貫した線条の間隔を持っている必要があります。鉗子で操作したときに柔軟性がないか、明らかな構造的損傷を持っている繊維は、廃棄されるべきです。 ステップ15の間に採取高倍率のデジタル画像は、繊維の中央部に沿って5対の直径の測定のために分析されます。繊維CSAは、 図7（a）に示すように楕円形の断面を仮定し、5個々のCSAの測定値を平均。 図7Bはまた、1つのビューの繊維寸法は、他のビューでペアリングの寸法と比較して有意に異なることができる方法を説明するのに役立つ（すなわち、クロス推定されていますセクション）は、一般的には、丸くなっていません。 人間の低速および高速の繊維からの代表的な力のトレースは、それぞれ、 図8Aおよび8Bに示されています。 VOLTAG力変換器の電子出力は、テスト中に取得され、データ収集および分析ソフトウェア（LabVIEWの）を使用して（Mn）を強制的に変換される。 図9は、減算することにより算出された最大活性力（F o を ） を評価するために使用する方法を示しれます最適な筋節長で繊維を維持するのに必要な力弛緩状態にある間に（受動的な力、F P）、最大繊維活性化の間に開発され、最大等尺力（合力、F T）から。ゼロの力に対応する力変換器の出力は、一般的に、別の入浴室の各々のために異なるので、我々は簡単で、ゼロ力レベルを捕捉するために、両方のプレ活性化し、活性化溶液中で繊維を緩め実験記録。繊維CSAによる最大活性力の正規化は、特定の力（SF 0）のより有益な値を生成するために使用されます。それは考慮に入れ、繊維のCSAがかかるので、SFのO </sUB&gt;これにより、異なるサイズの繊維との間の機能の比較を可能にする、繊維の収縮装置の固有の力発生能力の尺度を提供します。しかしながら、CSAの測定は、他の細胞内構造占める割合対収縮フィラメントにより占有繊維の割合を区別することができないことに留意すべきです。 クラフリンらから健康な成人の繊維の代表的な特性。人間のために2011年10、Mendias らマウスとGumucio ら 2011 1。ラットの2012年2 表3に示すデータはすべて使用して生成された表3に詳述されています。この資料に記載された技術。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> 人間 （外側広筋） </stronG&gt; </td><td> マウス （EDL） </td><td nowrap="nowrap"> ラット （棘） </td></tr><tr><td colspan="2">男性</td><td colspan="2">女性</td><td>男性</td><td>男性</td></tr><tr><td>タイプ1 </td><td>タイプ2A </td><td>タイプ1 </td><td>タイプ2A </td><td> （型付きではありません） </td><td> （型付きではありません） </td></tr><tr><td> CSA（μmの2） </td><td> 6900 - 4880 </td><td> 8380 - 5270 </td><td> 5470 - 3870 </td><td> 5610 - 4010 </td><td> 3080 - 1850 </td><td> 8010 - 5290 </td></tr><tr><td> FのO（MN） </td><td> 0.79から1.17 </td><td> 1.02から1.54 </td><td> 0.64から0.97 </td><td> 0.71から1.07 </td><td> 0.14から0.25 </td><td> 0.55から0.97 </td></tr><tr><td> SFのO（キロパスカル） </td><td> 142から182 </td><td> 165から210 </td><td> 156から193 </td><td> 172から214 </td><td> 67から94 </td><td> 102から131 </td></tr><tr><td> N </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> 人間広筋からの健康な成人の繊維の表3.一般的な特性は10 lateralis、マウス長指伸筋1およびラット棘は2筋肉。最適な筋節の長さは、両方のマウスのためのヒト繊維7,8 2.7ミクロンと2.5ミクロン（36に設定しました37）およびラット繊維（38）。実験L Fの範囲 （25 番目と75 番目の四分位数）は、それぞれ1.39〜1.73ミリメートル、1.17〜1.53ミリメートルとヒト、マウス、ラットのための1.32〜1.59ミリメートルでした。示された範囲は、25 番目と75 番目の四分位数を示し、nは試験された繊維の数です。 テスト中に経験した最も一般的な問題は、力RESPONSになる縫合糸ループスリップを含み、このような図10（a）に示すような「キャッチ」し、急に向かってまたは（中断）に戻る力応答をもたらす繊維の部分的または完全な厚さの涙、ゼロの電子繊維はまだ解決策を活性化中に浸漬されている間（ 図10B）。スリップ、涙やブレークが実験中に発生した場合、繊維の失敗の記録を維持することも11有益であることができるが、繊維が破棄されるべきであり、データは除外しました。発生する可能性のある他の否定的な結果は、事前活性化溶液（ 図10C）にある間に繊維の早期活性化です。予備活性化溶液中の部分的な活性化は、（ すなわち、中のカルシウム濃度の意図しない上昇よくプレ活性化）有意な交差ウェル汚染を示唆しています。この例では、すべての浴は、吸引されるべきであり、脱イオン水で十分にすすぎました。チャンバ間の分割面を乾燥することもrecommenですこれらの領域中の水分や結露などのDEDは風呂の間、溶液のウィッキングにつながる可能性があります。データを含めるか除外するかどうかは、最終的には実験的な焦点に依存し、調査を設計する際にこのように考慮されるべきです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> 図1：縫合糸ループ（10-0モノフィラメントナイロン縫合糸）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> 図2：バンドル切開鉗子は左手にあるが、顕微解剖はさみは右手にあります。赤い線は、繊維の縦軸と手首とはさみの良好な姿勢を示しています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> 図3： </stron標識されたコンポーネントとG&gt;（A）試験装置。 （a）は、透明な底部との実験室。 （b）は長さコントローラ。 （C）フォース·トランスデューサ。 （d）の光源。デジタル表示（e）の長さコントローラのxyzマイクロドライブ。デジタル表示（F）ステージマイクロドライブ。 （G）フォーストランスデューサのxyzマイクロドライブ。 （H）に較正レーザー回折ターゲットスクリーンのためのプラットフォーム。 （I）除振台。 （B）は、実験室のクローズアップビュー。 （j）の長コントローラから延びるステンレス取付面。 （k）は 、力変換器から延びるステンレス取付面。 （L）サイドビュープリズム。 （m）は 、熱電冷却モジュール用ハウジング。室TEを報告するための（n）の熱電対mperature。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> 図4：実験室に解剖皿から繊維を転送するために使用される改変された100μlのピペットチップ。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> 図5：実験装置の上に単繊維のマ ​​ウント（A）を調製した縫合糸ループは、ステンレス製の取付面にねじ込ま。 （B）光ファイバは、実験室に移しました。 （C）光ファイバを除去し、過剰な縫合糸で縫合糸ループの最初のペアによってステンレス鋼取付面に固定します。縫合糸ループの（D）第二の対は、第1の縫合糸ループの上にねじ山及び場所に結びました。 <img alt="図6"SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; 図6：サルコメア長さを較正ターゲットスクリーン上にレーザー干渉パターンを投影することによって評価される（a）は、レーザ光 ​​源。 （b）のミラー。 （c）の画面を対象とします。 （d）のレーザー干渉パターン。 <img alt="図7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="図7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> 図7：最適な筋節長（人間= 2.7ミクロン）で繊維断面積の（A）決意。楕円形の断面を想定すると、CSAは、繊維中央部に沿って5箇所のそれぞれについて計算され、5個々の測定値の平均を繊維CSAとして報告されます。図2aは、トップビューの直径を表し、あります<html>楕円の一方の軸は、図​​2（b）は側面直径を表し、楕円の他方の軸です。 （B）は上面と側面の両方で撮影した5相当径測定のそれぞれを示す代表的なファイバ像。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> 図8：健康なヒト外側広筋からの代表的な力トレースは筋線維をlateralis（A）1繊維（CSA：5710μm2で、FのO：0.89 MnおよびSFのO：156キロパスカル）を入力します。。 （B）は図2（a）繊維（：9510μm2で、F O：1.66 MnおよびSFのO：174キロパスカルCSA）を入力します。繊維ミオシン重鎖タイプは、電気泳動分離及び銀染色技術22を使用することによって決定しました。 OAD / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; 図9：最大活性力（F 0）の計算前活性化溶液中に開始長コントローラのたるみ誘導移動中の繊維の力応答の（a）の拡大図。 F Pは、安静時に繊維と2.7ミクロンの筋節の長さを維持するために必要な力です。 （b）は長さコントローラたるみ誘導運動の拡大図。 F P -そのF 0 = F Tに注意してください。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> 図10：力の立ち上がり時に力トレースで「キャッチ」によって証明（A）縫合糸ループスリップ、。ループは、繊維を活性化する前に、安全であるかどうかを確認してください。 （B）活性化中の繊維の休憩。縫合糸ループの場所の間に乏しい繊維の完全性や積極的な繊維処理が原因である可能性がありメント。原因のCa 2+とのプレ活性化チャンバーの汚染を（C）早期の部分的な繊維の活性化。

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Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

化学的に皮を剥がれ、または透過化、骨格筋線維の収縮特性の分析は、単一の筋細胞のレベルでの筋機能を評価することにより、強力な手段を提供しています。この記事では、製造するのに有効かつ信頼性の高い技術の概要を説明し、試験は、in vitroでの骨格筋線維を透過処理しました。

透過性に骨格筋線維によって生成される最大等尺性力の測定

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.3K ビュー.  University of Michigan Medical School. 化学的に皮を剥がれ、または透過化、骨格筋線維の収縮特性の分析は、単一の筋細胞のレベルでの筋機能を評価することにより、強力な手段を提供しています。この記事では、製造するのに有効かつ信頼性の高い技術の概要を説明し、試験は、in vitroでの骨格筋線維を透過処理しました。 

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

単離骨格筋のミオ - 機械的分析

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

医学

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

の応用<em&gt;インビボ</em組織工学骨格筋の修復を評価するためのラット前脛骨の&gt;機能テスト

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

生物工学

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

神経筋接合部機能を測定

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

神経科学

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

ラットのための手順<em&gt;その場で</em&gt;骨格筋収縮特性

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

生物学

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Critical to the evaluation of potential therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological assessments of muscle function. Because many pre-clinical trials rely on mouse models for these diseases, isolated muscle function has become one of the standards for Go/NoGo decisions in moving drug candidates forward into patients. We will demonstrate the preparation of the extensor digitorum longus (EDL) and diaphragm muscles for functional testing, which are the predominant muscles utilized for these studies. The EDL muscle geometry is ideal for isolated muscle preparations, with two easily accessible tendons, and a small size that can be supported by superfusion in a bath. The diaphragm exhibits profound progressive pathology in dystrophic animals, and can serve as a platform for evaluating many potential therapies countering fibrosis, and promoting myofiber stability. Protocols for routine testing, including isometric and eccentric contractions, will be shown. Isometric force provides assessment of strength, and eccentric contractions help to evaluate sarcolemma stability, which is disrupted in many types of muscular dystrophies. Comparisons of the expected results between muscles from wildtype and dystrophic muscles will also be provided. These measures can complement morphological and biochemical measurements of tissue homeostasis, as well as whole animal assessments of muscle function.

Muscle function measurements contribute to the evaluation of potential therapeutics for muscle pathology, as well as to the determination of mechanisms underlying physiology of this tissue. We will demonstrate the preparation of the extensor digitorum longus and diaphragm muscles for functional testing. Protocols for isometric and eccentric contractions will be shown, as well as differences in results between dystrophic muscles, representing a pathological state, and wildtype muscles.

筋ジストロフィーのマウスモデルから分離された骨格筋の等尺性と偏心力発生アセスメント

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Maximum Isometric Tetanic Force Measurement of the Tibialis Anterior Muscle in the Rat

Traumatic nerve injuries result in substantial functional loss and segmental nerve defects often necessitate the use of autologous interposition nerve grafts. Due to their limited availability and associated donor side morbidity, many studies in the field of nerve regeneration focus on alternative techniques to bridge a segmental nerve gap. In order to investigate the outcomes of surgical or pharmacological experimental treatment options, the rat sciatic nerve model is often used as a bioassay. There are a variety of outcome measurements used in rat models to determine the extent of nerve regeneration. The maximum output force of the target muscle remains the most relevant outcome for clinical translation of experimental therapies. Isometric force measurement of tetanic muscle contraction has previously been described as a reproducible and valid technique for evaluating motor recovery after nerve injury or repair in both rat and rabbit models. In this video, we will provide a step-by-step instruction of this invaluable procedure for assessment of functional recovery of the tibialis anterior muscle in a rat sciatic nerve defect model using optimized parameters. We will describe the necessary pre-surgical preparations in addition to the surgical approach and dissection of the common peroneal nerve and tibialis anterior muscle tendon. The isometric tetanic force measurement technique will be detailed. Determining the optimal muscle length and stimulus pulse frequency is explained and measuring the maximum tetanic muscle contraction is demonstrated.

Evaluation of motor recovery remains the benchmark outcome measure in experimental peripheral nerve studies. The isometric tetanic force measurement of the tibialis anterior muscle in the rat is an invaluable tool to assess functional outcomes after reconstruction of sciatic nerve defects. The methods and nuances are detailed in this article.

ラットにおける脛表筋前筋の最大等角体テタニック力測定

Traumatic nerve injuries result in substantial functional loss and segmental nerve defects often necessitate the use of autologous interposition nerve ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

In Vivo Measurement of Hindlimb Dorsiflexor Isometric Torque from Pig

Reliable assessment of skeletal muscle strength is arguably the most important outcome measure in neuromuscular and musculoskeletal disease and injury studies, particularly when evaluating regenerative therapies&#39; efficacy. Additionally, a critical aspect of translating many regenerative therapies is the demonstration of scalability and effectiveness in a large animal model. Various physiological preparations have been established to evaluate intrinsic muscle function properties in basic science studies, primarily in small animal models. The practices may be categorized as: in vitro (isolated fibers, fiber bundles, or whole muscle), in situ (muscle with intact vascularization and innervation but distal tendon attached to a force transducer), and in vivo (structures of the muscle or muscle unit remain intact). There are strengths and weaknesses to each of these preparations; however, a clear advantage of in vivo strength testing is the ability to perform repeated measurements in the same animal. Herein, the materials and methods to reliably assess isometric torque produced by the hindlimb dorsiflexor muscles in vivo in response to standard peroneal electrical stimulation in anesthetized pigs are presented.

In Vivo Measurement of Hindlimb Dorsiflexor Isometric Torque from Pig

The present protocol describes concise experimental details on the evaluation and interpretation of in vivo torque data obtained via electrical stimulation of the common peroneal nerve in anesthetized pigs.

インビボ ブタからの後肢背筋アイソメトリックトルクの測定

Reliable assessment of skeletal muscle strength is arguably the most important outcome measure in neuromuscular and musculoskeletal disease and injury ...

透過性に骨格筋線維によって生成される最大等尺性力の測定

要約

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単離骨格筋のミオ - 機械的分析

の応用

神経筋接合部機能を測定

ラットのための手順

隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

筋ジストロフィーのマウスモデルから分離された骨格筋の等尺性と偏心力発生アセスメント

ラットにおける脛表筋前筋の最大等角体テタニック力測定

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

インビボブタからの後肢背筋アイソメトリックトルクの測定

透過性に骨格筋線維によって生成される最大等尺性力の測定

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の応用

神経筋接合部機能を測定

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筋ジストロフィーのマウスモデルから分離された骨格筋の等尺性と偏心力発生アセスメント

ラットにおける脛表筋前筋の最大等角体テタニック力測定

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

インビボ ブタからの後肢背筋アイソメトリックトルクの測定

インビボブタからの後肢背筋アイソメトリックトルクの測定