This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).

注：すべての本実験は（クイーンズランド大学、解剖学的バイオサイエンス倫理委員会によって承認された）クイーンズランド大学のロー​​カル動物倫理手順に従って実施しました。 1.膵島単離<ol><li>試薬調製<ol><li>酵素の混合物<ol><li>膵臓消化のために、リベラーゼおよびコラゲナーゼIV型の混合物を使用しています。リベラーゼTL DMEMの26ミリリットルとの5mg（低サーモリシン）1バイアル（ダルベッコ改変イーグル培地）を希釈します。 </li><li> 5mMのHEPES、0.5mMのCaCl 2を、は0.1mg / mlのDNA分解酵素とは​​1mg / mlウシ血清アルブミンを補充した0.5mgの/ mlであり、濃度のハンクス緩衝液中のコラゲナーゼIV型を準備します。 </li><li> すなわち 、（体積で）1 4ミリリットルのLiberase TL + 1ミリリットルのコラゲナーゼ：4の割合でリベラーゼTLとコラゲナーゼ溶液を混合。 -20℃でそれぞれ店舗を2.5ミリリットルする酵素の混合物を分取。 注：組織のインキュベーション時間は、V酵素のバッチ間のビット（30秒〜1分差）ARY。したがって、バッチ試験が必要とされ得ます。 </li></ol></li><li> RPMIアイソレーションメディア<ol><li>室温で水1LにRPMI 1640粉末の1つのバイアルを溶解し、2グラムのNaHCO 3、4.02グラムのHEPESで補います。 </li><li> 、マグネチックスターラーで混ぜ、大きな三角フラスコにRPMI分離媒体を組み合わせてNaOHでpHを7.4に調整し、フィルターを滅菌し、4℃で保存。 </li></ol></li><li> RPMI培養培地</li><li> 10％ウシ胎児血清および1％抗生物質（ 例えば 、ペニシリン100 U / mlのストレプトマイシンを100μg/ ml）を、RPMI培地を使用します。 </li></ol></li><li>膵島単離および培養<ol><li>動物のいけにえ<ol><li>地元の機関の倫理手順に従って、頸椎脱臼またはCO 2窒息によりマウスを生け贄に捧げます。 70％エタノールで徹底的にマウス本体スプレー。 </li></ol></li><li>膵臓灌流<ol><li> UV字状のフラップを作るために腹部の皮膚と腹膜を通って横方向に2長いカットをSE。 、全体の腹腔を明らか腸を脇に置くと、総胆管（ 図1および図2）を明らかにする折り畳まれたティッシュペーパーによって所定の位置に肝臓を維持するために皮膚のフラップを引き上げます。その結果、外科医に向かって頭と尾離れ外科医から動物を置きます。 </li><li>十二指腸（ 図1）に入るから注入された酵素をブロックするために十二指腸壁に膨大部で血管クランプを適用します。 注：それは注入された酵素が膵管に入ると（クランプ以上）注射部位に膵臓や逆流を灌流または十二指腸に入るかどうかを決定し、これは（クランプの下）重要なステップです。 </li><li>共通の肝管と胆嚢管（ 図1）の接合部付近31 G針で総胆管にカニューレを挿入し、二回目の注射のための余地を残す番目の場合Eの膵臓は初めてを灌流することができません。ゆっくりと（〜10秒以上）マウス総胆管に冷たい酵素混合物の約2mlを注入。 注：クランプが正しい位置にある場合に膵臓が急速に灌流されます。 </li><li>針が総胆管の内部にあるが、膵臓を灌流することができない場合（ すなわち 。クランプを超える場合は肝臓から少し離れてクランプを移動したり、クランプの下であれば肝臓に少しそれを下に移動）クランプ位置を調整します。 注：針が時々周囲のカプセルではなく、ダクトの内腔に入ります。注入する際、針が総胆管の内側にあるかどうかを確認するのに便利な記号は、ダクトの拡張です。膵臓が灌流するために失敗した場合、代替は、酵素混合物が予想より低い収率で膵臓の複数の部位に注入することができたです。膵臓（脾臓ローブ）の左サイトの灌流は、膵島収量の最大化のために重要です。 </li><li>膵臓は、pした後erfused、すぐに、膵臓を除去バイアル（〜20ミリリットル、ガラス）に入れ、37℃の水浴中で〜19分間インキュベートします。 注：インキュベーション時間は、マウス株と年齢に応じてビットを変化させることができます。 </li><li>インキュベーション時間の後、〜冷分離培地を20mlを添加することによって、消化プロセスを停止します。膵臓を破壊し、滅菌50mlチューブに、通常の茶ふるい（1mmの孔径）を介して、それを注ぐ穏やかにバイアルを振ります。ブレーキをオフにして、4℃で1分間、400×gで分離培地と遠心でチューブをトップ。 </li><li>再び分離培地でペレットを溶解した後、ブレーキをオフにして、4℃で1分間、400×gで遠心分離し、2 15ミリリットルチューブに移します。吸引上清後、ボルテックスまたはピペッティングによりチューブあたり密度勾配細胞分離媒体の6ミリリットル（ヒスト1077溶液）とよく2ペレットを混合します。そしてそっとの上にチューブの側面に分離培地の〜6ミリリットルを追加ブレーキをオフにして、4℃で15分間100×gでの密度勾配分離媒体および遠心分離機。 </li><li>上部（分離媒体）に上清を収集し、3つの別々の皿の中央と下部（密度勾配細胞分離媒体）の層。解剖顕微鏡下でピペットを用いて、これら3つの皿で膵島を自分に都合の良いように選びます。 注：中間層は、島のほとんどが含まれています。膵島のサイズは約50〜500μmのコンパクトな構造（ 図3）として認識されています。我々は、WTマウスにおける〜200の島とされたdb / dbマウスにおける300- &lt;100膵島を得ます。 </li></ol></li><li>膵島培養<ol><li>島はライブ前に2日間酵素消化、5％/ 95％CO 2 / O 2、37℃、で6ミリリットルRPMI培地（10mMのグルコース）と25センチメートルシャーレで40島の文化·グループからの回復を支援するために、 2光子イメージングを-cell。毎日の培地を変更します。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2。ライブセル2光子イメージング<ol><li>試薬の調製<ol><li>外バッファ<ol><li> 140のNaCl、5mMのKCl、2.5mMのCaCl 2を、1mMのMgCl 2、5mMのNaHCO 3および10mMのHEPESと2光子アッセイのためのナトリウムの豊富な細胞外のバッファを準備します。 </li></ol></li><li>外色素<ol><li> 2光子アッセイのために、細胞外のバッファの株式SRB 8ミリメートル、-20℃での小さなチューブやストアにアリコートを準備します。 0.8mmの作業濃度を得るために、新鮮な外のバッファにストックSRB 1:10に希釈します。 </li></ol></li></ol></li><li>光子撮像<ol><li>まず、30分間3 mMのグルコースの細胞外緩衝液中で2日間培養した膵島を前インキュベートします。 注：私たちは、文化の中で2〜5日の間の島を使用しています。 </li><li>その後、顕微鏡ステージ上に搭載サーモ制御室にスライドガラスを配置します。液の漏れを防止するために、グリースを使用します。 </li><li> extracellの500μlのチャンバーをカバー異なるグルコース濃度0.8 mMのSRB（3ミリモル、6ミリモル、15ミリモル、20 mMグルコース）を含有する緩衝液ウラル。 </li><li>次に、チャンバーの中央にプレインキュベート膵島を配置し、げっ歯類の小島で、インスリンについて免疫染色すると、ほとんどの細胞は、β細胞であることを示し、島に3-4細胞層に焦点を当てています。 注：SRBはすぐに島のすべての細胞膜を概説し、膵島は、画像への準備ができています。 </li><li> （ 例えば 、11のscanimage）60X油浸対物レンズ（NA 1.42）およびイメージングソフトウェアで2光子顕微鏡を使用して4は、典型的な顕微鏡の構成を示す図 。蛍光を有する膜880 nmのフェムト秒レーザーパルスによって励起された非透過性蛍光細胞外マーカーとしてSRBを使用して画像エキソサイトーシスのイベントは、550〜650 nmで検出しました。刺激に対する膵島の応答を記録します。 </li><li>小さな蛍光スポットの突然の出現によって、単一の細胞外のイベントを識別（解像度10ピクセル/1; m）および関心領域（〜0.78μmの2）の上に、蛍光信号の高速立ち上がり段階で確定してください。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035.">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li><li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell:+The+last+ten+years.">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes.">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li><li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+hyperglycemia,+independent+of+plasma+lipid+levels,+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db/db+mouse+model+of+diabetes.">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li><li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models.">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li><li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+a+new+mutation+in+mouse.">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretory+deficit+in+islets+from+db/db+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells.">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell.">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li><li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet.">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature.">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

膵島単離の中で最も重要な要因は、膵臓の初期灌流です。かなり低い膵島収量の灌流膵臓結果の下に。他の要因も、このような消化時間と部分的に灌流のレベルを補うことができる振とうのレベルとして分離の質に影響を与えます。例えば、完全に灌流膵臓を静かに振盪しながら下には、膵臓が困難に振盪しながら〜20分の消化を必要とする可能性が消化対照的に、18分30秒〜37℃でインキュベートする必要があります。私たちの手に2つの消化酵素の混合物は、いずれか単独よりも優れ膵島単離を提供します。コラゲナーゼ唯一の方法は、消化時間は決定的に膵島収量とわずか30秒の時間差劇的に品質に影響を与える可能性に影響を与えます。歩留まりが許容可能であるが、下の消化が時々起こるリベラーゼの場合のみ、我々は、コラゲナーゼの添加がより良い結合組織を消化するのに役立つと考えています。 膵島を単離した後に行うことができる可能な多くの実験があります。単離された膵島を直ちに単離後、パラホルムアルデヒドまたはメタノールで固定し、10関心のあるタンパク質の位置を決定するために、免疫蛍光染色に使用することができます。単離された膵島は、単一細胞に分散させることができます。これは、膵島単離の同日に、または膵島培養の数日後に行われ得ます。単一細胞は、その後、プレーティングされ、それは、そのようなパッチクランプと全反射顕微鏡のような技術のための主力となっているこの製剤です。測定実験ではインスリン分泌、ならびに生細胞2光子イメージングのために、我々は、膵島が再現可能なデータを得るために培養物中で2日を必要とすることを見出しました。どの文化で起こっていることは十分に理解されていないが、分離と消化プロセスからの回復の期間であると考えられています。 ここで紹介する2光子技術は、無傷の膵島内の多くの細胞からの個々の顆粒の融合のレベルで画像にインスリン分泌プロセスを研究者を可能にします。我々は、顆粒の融合事象の数及びそれらのタイミングが量およびインスリン分泌8の時間プロファイルと一致していることを見出しました。これは、方法は、インスリン顆粒の融合事象の大部分を検出している示唆しています。定着顆粒の中の染料エントリは、我々はβ細胞において、インスリン顆粒融合を実証するために対照実験を行うために偉大な長さに行っているインスリン顆粒融合事象を検出するための具体的な方法ではないことを考えると7,8を検討されています</sup&gt;。しかし、この証拠の構成要素は、β細胞が膵島のコアに濃縮されるげっ歯類膵島の構造に依存しています。別の内分泌細胞は膵島ボリュームに散在しているヒト膵島の異なる構造は、ベータ細胞を同定するために追加の方法が必要となります。 全てのイメージング手法に汎用されている2光子顕微鏡を用いて技術的な問題がいくつかあります。例えば、我々は慎重に私たちは、検出器のゲインを減少させるため、我々は、細胞の損傷を引き起こす膵島にあまり光を置くと、ノイズを低減することができるように膵島に十分な光を取得しようとしているの反対の要素のバランスをとります。我々のシステムでは、ポッケルスセルは、パルスレーザ（ 図3）を減衰させるために使用されます。すべての商用システムは、試料へ落ちる光の強度を変化させる機構を有しています。 要約すると、DB / Dの慎重な分離の組み合わせB膵島と全膵島インスリン分泌の過程を研究し、2型糖尿病における重要な欠陥素子を決定するために、2光子顕微鏡存在新たな機会。

疾患におけるβ細胞機能不全の役割が広く3,4認識されています。このようなMIN6及びINS-1などの細胞株は、β細胞の挙動の生物学を理解するための便利なツールです。しかし、インスリン分泌の生理学的制御は、ランゲルハンス島内で起こります。これらの島は密に詰まったβ細胞の数千、ならびに血管および他の内分泌細胞型を含みます。膵島内のこの環境は、インスリン分泌に影響を与え、糖尿病において重要である可能性があります。したがって、インスリン分泌の生理学的制御、および疾患の病態生理を理解するためには、無傷島を研究することが必須です。 膵島単離ヒト膵島ライブ及び、特に、2型糖尿病患者からのヒト膵島を得ることが困難です。また、ヒト膵島は、実験分子操作のための限られた可能性があります。研究者はそのためである使用してきました動物や2型糖尿病の動物モデルからすることができます。そのような疾患モデルは、DB / dbマウスです。これは、モデルが密接にヒトの疾患5,6と平行した表現型の進行と2型糖尿病自然突然変異です。糖尿病のdb / dbマウスの膵島単離のためにここで紹介するプロトコルは、より良好な収率、精製および強化された膵島の生存のためのいくつかの改良と、他のグループと共通の多くのステップがあります。 2光子イメージング生細胞2光子アッセイは、ここで説明した数を定量化し、糖尿病7の多くの細胞および野生型の島8,9から単一のインスリン含有顆粒の特性を評価するために研究者を可能にします。

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td>Roche</td><td>-5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>to prepare isolation media</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>to prepare cultured media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>to prepare cultured media&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>to prepare cultured media</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>to dilute the liberase</td></tr><tr><td>Metamorph program</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>to analyze the 2-photon images</td></tr></tbody></table>

leprdb mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets

2型糖尿病は、過去20年の間に、2型糖尿病におけるβ細胞機能不全の役割が明確に2を確立されている。2013年382万人に影響を与える慢性疾患であり、2035年15.92億に上昇すると予想されます。研究の進歩は、膵島の単離のための方法が必要でした。野生型および糖尿病LEPR デシベル （DB / DB）マウスの両方から分離された膵島の収量と品質を向上させるためにいくつかの変更を加えて、ここでは他のグループからのプロトコルと共有多くの共通の手順を提示膵島単離のプロトコル。生細胞2光子イメージング方法は、次いで、膵島内のインスリン分泌の制御を研究するために使用することができるが提示されます。

膵島収量および精製正常な野生型マウスの場合、約200膵島が期待されます。健康な島は、明るく見える丸い形と滑らかな境界線を持っています。アンダー消化バッチが少ない膵島と腺房細胞取り付け膵島（ 図3）を有し、一方の上に消化分離バッチは通常小さく、ファジー島を持っています。より良い血糖マウスは100の下半透明の外観（と小さい島を持っているより悪い血糖マウスと比較して、より大きなより明るく膵島（最大300島を）持っていると糖尿病のdb / dbマウスは、膵島収量および外観は、疾患の進行に依存します膵島） 2光子アッセイ 2光子イメージングは​​、単一インスリン顆粒の融合のレベルでのインスリン分泌を測定するための間接的アッセイです。例えばグルコースまたは高カリウムなどの刺激に応答して、インスリン顆粒は、原形質膜と融合し、細胞外色素SRBは番目に入ります直径の急激な蛍光スポット〜400nmの外観をもたらす電子顆粒（ 図5）。様々な実験は、インスリン分泌の予想量と顆粒の融合事象の数を増加させる依存性グルコース用量のようなインシュリン含有顆粒の融合の測定値として2における応答細胞の一貫したサイズをこのアッセイを検証するために実施されていますβ細胞、2光子及び電子顕微鏡で測定類似の顆粒径、色素の取り込みおよびインスリン染色8の共局在化のそれと光子。 記録時間内に、刺激に応答して、すべてのエキソサイトーシスのイベントが（識別され、イベントの位置、出現時間、キス·アンド·ランまたは完全な融合のような融合事象の期間や種類を特徴としています図5、図6）。融合プロセスのこれらの特性は、評価するための価値があります<html> 2型糖尿病のモデルにおける顆粒融合の欠陥。この方法を使用して、我々の以前の報告は、糖尿病のdb / dbの小島に欠陥が完全顆粒融合の損失ではなく、個々の顆粒融合7の動態の特性変化であることを示しています。さらに、我々は疾患におけるインスリン分泌の低下の最大の要因は、応答性細胞7の数の減少であることを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52632/52632fig1.jpg" /> 図1：クランプ及び注射部位の図は、一般的な肝管と胆嚢管の接合部付近総胆管に酵素を注入します。膵管に注入された酵素を容易にするために、血管クランプによってバルターの膨大部をクランプ。 2632fig2.jpg &quot;/&gt; 図2：マウスにおける射出工程 。トップ図は、バルターの膨大部で適用血管クランプで総胆管内部に針を示しています。一番下の図は、注射後リベラーゼ灌流膵臓を示しています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52632/52632fig3.jpg" /> 図3：野生型とDB / DB孤立島の代表的な画像（A）野生型孤立した島。 （B）のdb / dbの単離された島。付着した腺房細胞（矢印）で膵島を消化アンダー（C）。 （D）小とファジー膵島（矢印）とオーバー消化小島。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52632/52632fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" sRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52632 / 52632fig4.jpg&quot; /&gt; 図4：カスタムメイド2光子顕微鏡の主な構成要素は、 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52632/52632fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52632/52632fig5.jpg" /> 図5：2光子顕微鏡を用いて記録として単一インスリン顆粒融合事象の例左図は、（A）の前と後（B）のセルを表し15mMのグルコース刺激に応答して、エキソサイトーシス事象（矢印）の外観。それは細胞膜と融合するとき（C）は 、顆粒外に染料SRBの進入とSRB標識を示しています。 （D）は、エキソサイトーシスイベントの関心領域にわたって蛍光強度だけでなく、続唱を示していますこのエキソサイトーシスイベント（スケールバーは1μm）のL画像。ドゥら 2014 7から変更されたイメージ。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52632/52632fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52632/52632fig6.jpg" /> 図6：外染料としてSRBと2光子顕微鏡下で、野生型および糖尿病のdb / dbの膵島の応答これらの実験では、15mMのグルコース刺激に応答したインスリン顆粒融合イベントが記録されています。黄色の円は、記録の20分の間、エキソサイトーシスのイベントのサイトです。画像は、DO ら 2014 7から変更します。

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Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

LEPR<sup&gt; DB</sup&gt; 2型糖尿病のマウスモデル：無傷の膵島の膵島単離およびライブセル2光子イメージング

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

9.4K ビュー.  The University of Queensland. We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

ビデオ: Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of pancreatic tissue, such as the rat pancreas, and to increase the number of channels (cell types) that may be studied in a single specimen. We further describe the implementation of a number of computational tools that provide: 1/ accurate positioning of a specimen's (in our case the pancreas) centre of mass (COM) at the axis of rotation (AR)2; 2/ improved algorithms for post-alignment tuning which prevents geometric distortions during the tomographic reconstruction2 and 3/ a protocol for intensity equalization to increase signal to noise ratios in OPT-based BCM determinations3. In addition, we describe a sample holder that minimizes the risk for unintentional movements of the specimen during image acquisition. Together, these protocols enable assessments of BCM distribution and other features, to be performed throughout the volume of intact pancreata or other organs (e.g. in studies of islet transplantation), with a resolution down to the level of individual islets of Langerhans.

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

We describe the adaptation of optical projection tomography (OPT)1 to imaging in the near infrared spectrum, and the implementation of a number of computational tools. These protocols enable assessments of pancreatic &beta;-cell mass (BCM) in larger specimens, increase the multichannel capacity of the technique and increase the quality of OPT data.

糖尿病研究におけるβ細胞の質量分布のアセスメント用の赤外線光学投影断層近く

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

医学

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

コラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製の組合せを用いて単離ランゲルハンスマウスの膵島

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

生物学

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

膵臓の生きた組織スライスにおける膵島機能と膵島免疫細胞相互作用の観察

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

免疫・感染学

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology have been developed and utilized in vivo, they are limited in terms of allowing single cell resolution and continuous longitudinal recordings. Because of the transparency of the cornea, the anterior chamber of the eye (ACE) in mice is well suited to study human and mouse pancreatic islet cell biology. Here is a description of how this approach can be used to perform continuous longitudinal recordings of grafting and revascularization of individual human islet grafts. Human islet grafts are inserted into the ACE, using NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mice as recipients. This allows for the investigation of the expansion of recipient versus donor cells and the contribution of recipient cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft. Further, a step-by-step approach for image analysis and quantification of the islet volume or segmented vasculature and islet capsule forming recipient cells is outlined.

The goal of this protocol is to continuously monitor the dynamics of the human pancreatic islet engraftment process and the contributing host versus donor cells. This is accomplished by transplanting human islets into the anterior chamber of the eye (ACE) of an NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mouse recipient followed by repeated 2-photon imaging.

前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging study, with an abdominal imaging window, enabled visualization of the cellular dynamics in abdominal organs in vivo. However, due to the soft sheet-like architecture of the mouse pancreas that can be easily influenced by physiologic movement (e.g., peristalsis and respiration), it was difficult to perform stabilized longitudinal in vivo imaging over several weeks at the cellular level to identify, track, and quantify islets or cancer cells in the mouse pancreas. Herein, we describe a method for implanting a novel supporting base, an integrated pancreatic intravital imaging window, that can spatially separate the pancreas from the bowel for longitudinal time-lapse intravital imaging of the pancreas microstructure. Longitudinal in vivo imaging with the imaging window enables stable visualization, allowing for the tracking of islets over a period of 3 weeks and high-resolution three-dimensional imaging of the microstructure, as evidenced here in an orthotopic pancreatic cancer model. With our method, further intravital imaging studies can elucidate the pathophysiology of various diseases involving the pancreas at the cellular level.

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo high-resolution imaging of the pancreas was facilitated with the pancreatic intravital imaging window.

膵臓内イメージングウィンドウを用いたマウスモデルにおける膵臓の細胞レベル可視化におけるビ ボ における縦方向の安定化

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study insulin granule exocytosis either use electrophysiology or microscopy coupled to the expression of fluorescent reporters. However most of these techniques have been optimized for clonal cell lines or require dissociating pancreatic islets. In contrast, the method presented here allows for real time visualization of insulin granule exocytosis in intact pancreatic islets. In this protocol, we first describe the viral infection of isolated pancreatic islets with adenovirus that encodes a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP), pHluorin, coupled to neuropeptide Y (NPY). Second, we describe the confocal imaging of islets five days after viral infection and how to monitor the insulin granule secretion. Briefly, the infected islets are placed on a coverslip on an imaging chamber and imaged under an upright laser-scanning confocal microscope while being continuously perfused with extracellular solution containing various stimuli. Confocal images spanning 50 &#181;m of the islet are acquired as time-lapse recordings using a fast-resonant scanner. The fusion of insulin granules with the plasma membrane can be followed over time. This procedure also allows for testing a battery of stimuli in a single experiment, is compatible with both mouse and human islets, and can be combined with various dyes for functional imaging (e.g., membrane potential or cytosolic calcium dyes).

We describe a protocol for visualization of insulin exocytosis in intact islets using pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein. Isolated islets are infected with adenovirus encoding pHluorin coupled to the vesicle cargo neuropeptide Y. This allows for the detection of insulin granule fusion events by confocal microscopy.

共焦点イメージングの神経ペプチド Y-pHluorin: そのままのマウスと人間のランゲルハンス島におけるインスリン開口分泌の可視化技術

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウムダイナミクスのイメージング

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails significantly fewer preparation-induced changes than isolated islets, acini, ducts, or dispersed cells described in typical in vitro studies. By combining the acute pancreatic tissue slice with live-cell calcium imaging in confocal laser scanning microscopy (CLSM), calcium signals can be studied in a large number of endocrine and exocrine cells simultaneously, with a single-cell or even subcellular resolution. The sensitivity permits the detection of changes and enables the study of intercellular waves and functional connectivity as well as the study of the dependence of physiological responses of cells on their localization within the islet and paracrine relationship with other cells. Finally, from the perspective of animal welfare, recording signals from a large number of cells at a time lowers the number of animals required in experiments, contributing to the 3R-replacement, reduction, and refinement-principle.

We present the preparation of acute pancreatic tissue slices and their use in confocal laser scanning microscopy to study calcium dynamics simultaneously in a large number of live cells, over long time periods, and with high spatiotemporal resolution.

急性マウス膵臓組織スライスにおけるカルシウム動態の共焦点レーザー走査顕微鏡

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

Grafting Pancreatic Islets: A Method to Implant Pancreatic Islets into the Anterior Chamber of the Mouse Eye for In Vivo Imaging

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61234/" target="_blank">A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the protocol for grafting human pancreatic islets into the anterior chamber of the mouse&#8217;s eye to monitor revascularization of human islet grafts in vivo. It also helps to understand the contribution of recipient versus donor cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft.

膵島移植:In vivoイメージングのためのマウス眼の前房に膵島を移植する方法

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

がん研究

膵臓がん

アッセイと技術

Intravital Imaging: A Method for Cellular Level Observation of the Mouse Pancreas Through a Stabilized Imaging Window

Source: Park, I. and Kim, P. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62538">Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we describe the intravital imaging of a mouse pancreas through a stabilized window for long-term visualization of cellular dynamics.

生体内イメージング:安定化イメージングウィンドウによるマウス膵臓の細胞レベル観察法

Source: Park, I. and Kim, P. Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital ...

LEPR

要約

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この動画の章

糖尿病研究におけるβ細胞の質量分布のアセスメント用の赤外線光学投影断層近く

コラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製の組合せを用いて単離ランゲルハンスマウスの膵島

膵臓の生きた組織スライスにおける膵島機能と膵島免疫細胞相互作用の観察

前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量

膵臓内イメージングウィンドウを用いたマウスモデルにおける膵臓の細胞レベル可視化におけるビボにおける縦方向の安定化

共焦点イメージングの神経ペプチド Y-pHluorin: そのままのマウスと人間のランゲルハンス島におけるインスリン開口分泌の可視化技術

マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウムダイナミクスのイメージング

急性マウス膵臓組織スライスにおけるカルシウム動態の共焦点レーザー走査顕微鏡

膵島移植:In vivoイメージングのためのマウス眼の前房に膵島を移植する方法

生体内イメージング:安定化イメージングウィンドウによるマウス膵臓の細胞レベル観察法

LEPR

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糖尿病研究におけるβ細胞の質量分布のアセスメント用の赤外線光学投影断層近く

コラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製の組合せを用いて単離ランゲルハンスマウスの膵島

膵臓の生きた組織スライスにおける膵島機能と膵島免疫細胞相互作用の観察

前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量

膵臓内イメージングウィンドウを用いたマウスモデルにおける膵臓の細胞レベル可視化におけるビ ボ における縦方向の安定化

共焦点イメージングの神経ペプチド Y-pHluorin: そのままのマウスと人間のランゲルハンス島におけるインスリン開口分泌の可視化技術

マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウムダイナミクスのイメージング

急性マウス膵臓組織スライスにおけるカルシウム動態の共焦点レーザー走査顕微鏡

膵島移植:In vivoイメージングのためのマウス眼の前房に膵島を移植する方法

生体内イメージング:安定化イメージングウィンドウによるマウス膵臓の細胞レベル観察法

膵臓内イメージングウィンドウを用いたマウスモデルにおける膵臓の細胞レベル可視化におけるビボにおける縦方向の安定化