Name: assessing bacterial invasion of cardiac cells in culture and heart colonization in infected mice using listeria monocytogenes
Uploaded: 2015-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
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この研究は、公衆衛生サービスがAI41816およびAI099339(N.E.F.)を付与し、NiAIDからF31AII094886-01(P.D.M.)によって支援されました。 内容は著者の責任であり、必ずしも資金調達源の公式見解を表すものではありません。

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著者らは、競合する財政的利益を報告していない。

L. 単球遺伝子 は、広範囲に及び、よく特徴づけられるヒト病原体であり、多くの異なる疾患症状を引き起こすことができる15。細菌は、中枢神経系に到達し、植民地化し、胎児を発達させるために、血液脳関門や胎盤胎児障壁などの障壁を越えて移動する能力について以前に説明されています。これらの組織を植民地化する生物の 生体内 能力は、多くの場合、標的となる器官を構成する培養中の代表的な細胞に侵入する インビトロ 能力によって補完される。例えば、脈絡叢における上皮細胞の侵入は、CNS16を植民地化する生物の能力と関連している。絨毛性トロホブラストの外植物は、母体胎児の障壁17を表すために使用されてきた。本プロトコルでは、培養中の心臓細胞の細菌浸潤を評価する場合や、肝臓および脾臓のコロニー形成に対する個々の分離株に対する心臓の細菌コロニー形成の比較に有用である方法が記載されている。
このプロトコルには多くの重要なステップが含まれていますが、最も重要なものの中には、カバーリップで増殖した組織培養細胞の感染または動物の感染に正しい細菌CFUを使用するものがあります。細菌のCFU数が異なる井戸と動物の間で正しく制御されていない場合、サンプル間の直接比較は行うことができません。細菌CFU数が正確に推定されていることを保証するために、メディアプレート上の最終希釈液の直接めっきによってイノクラを生成するために使用される希釈系列を再確認することが重要です。
これらのアッセイで使用されるH9c2細胞は、主に心室組織18を含む13日間の胚性ラット心臓の下半分に由来する。細胞は単核筋細胞として増殖し、組織培養フラスコまたは皿中の合流に達すると、多核尿管構造を形成し始める。セルの生成時間は約 30 時間18 です。H9c2細胞の血清飢餓は骨格筋細胞への細胞の分化と関連しているのに対し、10nM全トランスレチ ノイン酸による筋芽細胞の治療は心筋細胞14への筋芽細胞分化と関連している。このプロトコルは 、L.モノサイトゲネス ・ミオブラスト細胞の浸潤に焦点を当てたが、H9c2細胞株は、細菌の侵入に対する制御された細胞分化の影響を調査するために使用できる汎用性の高い細胞株である。
L.単球遺伝子株07PF0776は、もともと心臓8の侵襲的なL.単球遺伝子感染のために非再起性の収縮期逮捕を有するHIV感染患者から単離された。マウス感染モデルにおけるこの株のその後の分析は、心臓組織を標的と侵略する能力が増強されたことを示した。L. 単球遺伝子の追加のランダム分離株の限定的な分析は、細菌分離株のサブ集団が心臓組織または心臓弁への任意の以前の損傷がない場合にマウスの心臓に感染することができることを示唆している8.興味深いことに、最も特徴付けられるL.モノサイトゲネス株の2つは、10403SおよびEGD、心臓細胞および組織の貧しいコロニー形成器であることが判明した。07PF0776単離のゲノムシーケンシングは、新しい病原性の島の存在を明らかにしたり、ユニークな遺伝子クラスター19の証拠を提供しませんでした。これは、07PF0776が病原性遺伝子産物の既存の兵器の改変を通じて侵入のために心臓細胞を標的とすることを示唆している。予備的な組織内化学分析は、07PF0776が感染したマウスの心臓内に膿瘍を形成し、元の感染したヒト患者内で観察された膿瘍と同様に見えることを示している(データは示していない)。他の心熱帯L.単球遺伝子が類似の心臓膿瘍形成を誘導する分離物であるかどうかはまだ決定されていない。
ここで提示されるアッセイは、感染のさまざまな側面の検査を容易にするために容易に修正することができる。個々のカバーリップは、光または蛍光ベースの顕微鏡検査のために固定および染色することができ、組織培養の培養時間を増加させ、細菌の細胞内増殖速度の測定および比較のために、組織および器官は、細胞レベルでの膿瘍形成および細菌分布を調べるためにパラフィン埋め込みおよび処理することができる。組織培養細胞の細菌浸潤または宿主組織のコロニー形成のレベルを評価する場合、各アッセイが検出できる細菌の最小量の点で制限がある。 インビトロ 浸潤アッセイは、カバースリップあたり約300 CFUの検出の下限を有する。カバーリップを渦巻くために使用される水の量を調整すると、低い数の細菌の検出を強化し、細胞のリシス量が500μlの低い場合、侵襲性の低い株を検出するのに役立ちます。カバーリップは、より小さな体積の宿主細胞のリシスの前に過剰なゲンタマイシンを除去するために滅菌水に短時間浸漬することができる。5 ml 以上のボリューム レベルは、侵襲性の高い株を適切に列挙するために使用できます。動物では、臓器ホモジネートは、5mlまたは10mlのddH20の体積で生成することができ、より低い量の細菌を検出するのに有用であり、より高い体積は、より大きくコロニー形成された器官をより良く列挙するのに有用である。感染した臓器の最小検出範囲は約100 CFUです。臓器が一貫して高レベルで植民地化されている場合は、より大きな量の水(10 ml)を使用し、96ウェルプレート内でより多くの希釈を行う方法を検討してください。
記載された方法は、心臓外の器官および組織に適用することができる。このような侵入アッセイやマウス感染症は、胎盤、脳、胆嚢、肝臓、腸を含む多数の部位での植民地化を評価するために使用されてきた。上記のプロトコルの修飾はまた、過侵襲および/または過毒性株を収容するために行うことができる、および他の細胞型との心臓細胞の置換は、心血管系外の部位での浸潤表現型を評価するために行われ得る。異なる細胞タイプが L.単球遺伝子 の侵入に感受性を変化させるので、アッセイから正確にデータを回復するためにMOIやインキュベーション時間などのパラメータを調整する必要があります。

リステリア単球遺伝子は、高齢者、妊婦、HIV/AIDSを有する人、および化学療法を受けている人を含む、感受性の高い集団において重篤な疾患を引き起こすことができるグラム陽性細胞内病原体である。これらの集団における感染は、汚染された食品を摂取した結果が多く、ほとんどの感染症は大規模な食物媒介性の流行2,3に関連している。ヒトおよび他の哺乳動物において、L.単球遺伝子は小腸の上皮境界を越えて転位することが可能であり、その後肝臓4,5に輸送される。動物モデルは、摂取した細菌が腸絨毛内で複製し、門脈静脈を通って肝臓に移動したり、腸間膜リンパ節を介して血流に広がったりし、肝臓および脾臓への血中血球播種化につながることを示唆している。肝臓および脾臓において、細菌は、プロの食細胞と常駐的なパレンキマル細胞の両方への取り込みを媒介することができ、これらの器官内の感染を迅速に確立する。細菌の負荷が増加するにつれて、多数の細菌が血液中に分散され、中枢神経系および胎盤(存在する場合)を含む感受性の組織をさらに植民地化することができる。これらの部位のコロニー形成は、髄膜炎、脳炎、および胎児中絶を含むヒトにおけるリステリア症の最も一般的な症状を妨げる2。
選択されたL.単球遺伝子の亜集団は、最近、心臓組織8内に侵入し、複製する能力が増強されたことが示されている。心臓の関与の症状は様々であり、心内膜炎および心膜炎から伝導異常を伴うフルミナント心筋炎まで9-13の範囲である。1年間のL.モノサイトゲネス心臓症例の総数は低いが、この感染のファセットが一般的に十分に認識されていないので、推定される可能性がある。病原体による心臓のコロニー形成には、多くの場合、既存の弁膜損傷または人工心臓弁などの宿主素因が必要である。しかし、心臓損傷および/または異常がない場合に感染した動物の心臓を植民地化する能力のために顕著であるL.単球遺伝子の単離者8がある。
本明細書明細書 では 、生体内および 生体内 で、生きた動物感染と同様に組織培養における浸潤アッセイを用いて感染動物内の心臓組織の細菌コロニー形成を評価する方法について説明する。これらの方法は、感染した動物の心臓組織を植民地化する可能性のある株を同定する上で有用であるだけでなく、心臓細胞の浸潤を増強し、心臓病理の変化をもたらす細菌遺伝子産物の同定にも有用であることが証明されている。これらの方法は、複数の株間の心筋症の比較を容易にする。ここで説明する方法については 、L.モノサイトゲネス 10403Sは、非心熱帯性株の十分に研究された代表として使用され、臨床分離株07PF0776は、心熱帯株の代表例として使用される。これら2つの株は、 生体内で の心臓細胞の細菌浸潤と 生体内での感染したマウスの心臓のコロニー形成との比較を提供するために選ばれた。分離株07PF0776は、HIV+患者8において致命的な不整脈を引き起こした心室間膿瘍から回復した臨床的分離株である。 L. 単球遺伝子 単離株は、その毒性の可能性が異なる可能性があり、 リステリア が免疫抑制および妊婦に感染する傾向を考えると、これらの集団内の人々は、異なる臨床分離株を評価しながら注意を払うべきである。

<table><tbody><tr><td>Difco</td><td>BHI Broth Base</td><td>237200</td><td>2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)</td></tr><tr><td>Difco</td><td>Agar</td><td>214510</td><td>2 kg of Granulated Agar</td></tr><tr><td>Difco</td><td>BHI Agar</td><td>241810</td><td>2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar</td></tr><tr><td>in vitrogen</td><td>LB Broth Base</td><td>12975-084</td><td>2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Glass Coverslips</td><td>12-545-80</td><td>12 mm glass coverslips</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>24-well Tissue Culture Plate</td><td>35-3047</td><td>24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>14mL Polystyrene tube</td><td>352051</td><td>14 ml Polystyrene tubes</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>96-well U-bottom plate</td><td>35-3077</td><td>Non-tissue culture treated 96-well plate</td></tr><tr><td>Corning</td><td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X)</td><td>25-052-CI</td><td>Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture</td></tr><tr><td>Corning</td><td>DMEM (High glucose, high pyruvate)</td><td>15-013-CU</td><td>DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Pen/Strep/Glut Solution</td><td>30-009-CI</td><td>Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Gentamicin</td><td>30-005-CR</td><td>50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture</td></tr><tr><td>Cellgro (Corning)</td><td>L-Glutamine</td><td>25005197</td><td>Stock L-glutamine solution without antibiotics</td></tr><tr><td>Denville</td><td>75cm^2 Flask</td><td>T1225</td><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture treated flask</td></tr><tr><td>Denville</td><td>1.5mL microcentrifuge tubes</td><td>2013004</td><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>ATCC</td><td>H9c2 Cardiac Myoblasts</td><td>CRL-1446</td><td>Rat cardiac myoblasts</td></tr><tr><td>Hyclone</td><td>Fetal Bovine Serum</td><td>SH30070.63</td><td>Fetal Bovine Serum</td></tr></tbody></table>

assessing bacterial invasion of cardiac cells in culture and heart colonization in infected mice using listeria monocytogenes

リステリア単球遺伝子は、免疫不全患者、高齢者、および妊婦に重篤な侵襲感染を引き起こす可能性のあるグラム陽性の栄養性細胞内病原体である。 ヒトにおけるリステリア症の最も一般的な症状には、髄膜炎、脳炎、および胎児中絶が含まれる。 侵襲的なL.単球遺伝子感染の有意だが、はるかに文書化された後遺症は、心臓を含む。 心臓病による死亡率は治療にもかかわらず最大35%までであり得るが、心臓組織のL.単球遺伝子コロニー形成およびその結果として生じる病理に関してはほとんど知られていない。 さらに、最近では、L.モノサイト遺伝子の亜集団が心臓組織内に侵入し、成長する能力が強化されたことが明らかになりました。 このプロトコルは、L.単球遺伝子分離株の心肺を評価するために使用することができるインビトロおよびインビボ法で詳細に記述する。 組織培養におけるH9c2ラット心筋芽細胞の感染、ならびに感染したマウスの心臓の細菌コロニー形成の決定のための方法が提示される。 これらの方法は、感染した動物の心臓組織を植民地化する可能性のある株を同定するのに有用であるだけでなく、心臓細胞の浸潤を増強し、心臓病理学の変化を促進するのに役立つ細菌遺伝子産物の同定を促進する可能性がある。 これらの方法はまた、複数のL.単球遺伝子株間の心筋症の直接比較を提供する。

選択した単球遺伝子の単離株は、細胞培養およびマウス感染モデルにおける心臓細胞の侵入を増強する。図1は、細菌コロニーが寒天培地上の懸濁液のスポットめっき後にどのように現れるかの例を示す。この方法により、多数の寒天メディアプレートを使用することなく、サンプル内のCFUsを正確に評価できます。図2は、株07PF0776の株と心臓細胞に侵入する株10403Sの能力を比較する組織培養ベースのアッセイの一例を示す。10403Sに感染した細胞と比較して、ゲンタマイシン治療後の感染したH9c2心臓細胞から2倍以上の07PF0776細菌CFUを回収することができる。このアッセイを用いた心性向きの株に対しては、2~4倍の違いが日常的に観察される。図3は、感染後3日での肝臓、脾臓、および感染したマウスの心臓からの細菌の回復の例を示す。心性異性器株07PF0776または株10403Sを有するマウスの感染は、感染したマウスの肝臓および脾臓から同じ数の細菌を生じるが、07PF0776に感染したマウスは、心臓から検出可能な数の細菌を生じさせ、この器官でより大きな細菌負担を示す可能性が高い。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52497/52497fig1.jpg"> 図1:細菌CFUsを決定するためのスポットめっき技術の例。 ガラスカバーリップ上で増殖し 、L.モノサイトゲネス に感染したH9c2細胞を溶解し、懸濁液を1:10希釈まで1:10希釈(左パネル)で連続希釈した。マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから10ulをLB寒天プレートに直接ピペットし、プレートを37°C(右パネル)で一晩インキュベートした。カバースリップ当たりの細菌数は、適切な希釈に関連する細菌CFUを数えることによって評価される。
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52497/52497fig2.jpg"> 図2: L. 単球遺伝子 株 07PF0776 は、組織培養における心臓細胞の侵入の強化を示す。浸潤アッセイは、MOI=100を用いてH9c2細胞で行った。グラフは、10403S(黒)に感染した細胞から回収された細胞内細菌CFUsの平均数を示しています+/- SE対心熱帯07PF0776株(青)。** は p 0.01 の有意性を示<。
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52497/52497fig3.jpg"> 図3: L. 単球遺伝子 株 07PF0776 は、マウス感染モデルにおける心臓の侵入の強化を示す。動物は尾静脈を介して10,000 CFUで接種した。感染は72時間進行させ、その時点で動物は屠殺され、肝臓、脾臓、心臓を採取して処理して、臓器1個あたりの細菌CFUを決定した。実円は、個々のマウスから得られたCFUを表し、グループ内のすべての動物の平均値は+/-SEで示される。パーセンテージ値は、心臓内で検出可能な細菌CFUを含む動物の数を示す。* p < 0.05 の有意性を示す。

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Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

リステリア単球遺伝子は、妊婦の胎児感染を引き起こし、感受性のある集団では髄膜炎を引き起こす。 細菌の亜集団は心臓組織を植民地化し、患者および実験動物に心筋炎を引き起こす可能性がある。 ここでは、感染した動物におけるL.単球遺伝子の心臓細胞浸潤および心臓コロニー形成を評価する方法を説明するプロトコルを提示する。

リステリア単球遺伝子を用いた感染マウスにおける培養および心臓コロニー形成における心臓細胞の細菌浸潤の評価

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

5.4K ビュー.  College of Medicine, University of Illinois at Chicago. リステリア単球遺伝子は、妊婦の胎児感染を引き起こし、感受性のある集団では髄膜炎を引き起こす。 細菌の亜集団は心臓組織を植民地化し、患者および実験動物に心筋炎を引き起こす可能性がある。 ここでは、感染した動物におけるL.単球遺伝子の心臓細胞浸潤および心臓コロニー形成を評価する方法を説明するプロトコルを提示?...

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

免疫・感染学

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the gastrointestinal phase of listeriosis due to the lack of a small animal model that closely mimics human disease. This paper describes a novel mouse model for oral transmission of L. monocytogenes. Using this model, mice fed L. monocytogenes-contaminated bread have a discrete phase of gastrointestinal infection, followed by varying degrees of systemic spread in susceptible (BALB/c/By/J) or resistant (C57BL/6) mouse strains. During the later stages of the infection, dissemination to the gall bladder and brain is observed. The food borne model of listeriosis is highly reproducible, does not require specialized skills, and can be used with a wide variety of bacterial isolates and laboratory mouse strains. As such, it is the ideal model to study both virulence strategies used by L. monocytogenes to promote intestinal colonization, as well as the host response to invasive food borne bacterial infection.

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

This paper describes a novel method for oral infection of mice using Listeria monocytogenes-contaminated food. The protocol can readily be adapted for use with other food borne bacterial pathogens.

の口頭伝達<em&gt;リステリア菌</em&gt;汚染された食品の摂取を介したマウスにおける

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

細菌性病原体による細胞の感染を調査するためにイメージングInlC分泌<em&gt;リステリア菌</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

と実験感染<em&gt;リステリア菌</em&gt;ホストインターフェロンγ応答を研究するためのモデルとして、

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled microscopic lesions (microlesions) that are remarkable due to the absence of infiltrating immune cells. Due to their release of cardiotoxic products, S. pneumoniae within microlesions are thought to contribute to the heart failure that is frequently observed during fulminate invasive pneumococcal disease in adults. Herein is demonstrated a protocol for experimental mouse infection that leads to reproducible cardiac microlesion formation within 30 hr. Instruction is provided on microlesion identification in hematoxylin &#38; eosin stained heart sections and the morphological distinctions between early and late microlesions are highlighted. Instruction is provided on a protocol for verification of S. pneumoniae within microlesions using antibodies against pneumococcal capsular polysaccharide and immunofluorescent microscopy. Last, a protocol for antibiotic intervention that rescues infected mice and for the detection and assessment of scar formation in the hearts of convalescent mice is provided. Together, these protocols will facilitate the investigation of the molecular mechanisms underlying pneumococcal cardiac invasion, cardiomyocyte death, cardiac remodeling as a result of exposure to S. pneumoniae, and the immune response to the pneumococci in the heart.

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

の可視化<em&gt;肺炎球菌</em&gt;心臓Microlesionsとその後の心臓リモデリングの中

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

医学

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.

リステリア菌脳の感染症

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A Technique to Establish a Bacterial Infection Model in an Ex Vivo Organ Culture

Source: Rizzuto, G. A., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54237">Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates a method to establish an infection model in placental tissues to study infection propagation. An ex vivo placental organ culture is infected with Listeria monocytogenes, a facultative intracellular parasite. The bacteria invade extravillous trophoblasts (EVTs) to enter the placental tissue and then propagate to other cells via cell-to-cell spread.

生体外臓器培養における細菌感染モデルを確立する技術

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫病理学

インビトロモデル

Quantification of Bacterial Infection in Host Cells by the Colony-Forming Unit Assay

Source: Gayle, P. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58775">Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2019).
This video demonstrates an in vitro quantification technique to determine Listeria monocytogenes infection of macrophages by the colony-forming unit assay. The bacterial colonies on the agar plate represent the intracellular bacterial population that escapes the host-defense mechanism and survives within the macrophages.

コロニー形成ユニットアッセイによる宿主細胞における細菌感染の定量化

Source: Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2019).
This video ...

免疫反応

宿主と病原体の相互作用

Flow Cytometry Analysis of Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes In Vitro

Source: Gayle, P. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58775">Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we quantify intracellular and extracellular Listeria monocytogenes, an intracellular pathogenic bacteria, following their infection of cultured macrophages in vitro using flow cytometry.

In vitroでの細胞内および新興細胞外リステリア菌のフローサイトメトリー解析

Source: Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we ...

リステリア単球遺伝子を用いた感染マウスにおける培養および心臓コロニー形成における心臓細胞の細菌浸潤の評価

要約

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に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌

の口頭伝達

細菌性病原体による細胞の感染を調査するためにイメージングInlC分泌

と実験感染

の可視化

リステリア菌脳の感染症

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

生体外臓器培養における細菌感染モデルを確立する技術

コロニー形成ユニットアッセイによる宿主細胞における細菌感染の定量化

In vitroでの細胞内および新興細胞外リステリア菌のフローサイトメトリー解析