Name: highly efficient transfection of human thp-1 macrophages by nucleofection
Uploaded: 2014-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
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THP-1マクロファージの1。前分化<ol><li> CO 2中10％（v / v）ウシ胎児血清（FCS）および1％（v / v）ペニシリン/ストレプトマイシン/ L-グルタミン（PSG）を補充したRPMI-1640培地中でTHP-1細胞を培養（5％ 37℃）のインキュベーター。 </li><li>トランスフェクションの前に、細胞を分割し、以前のように新鮮なRPMI培地に移す。 24時間細胞を培養。 </li><li>シード1.0〜1.5×10 75 cm 2の組織培養フラスコ中に7細胞または2.5×10 7 RPMI-1640培地中の150-cm 2の組織培養フラスコへの細胞および10％（v / v）FCS、1％（容量を追加/ 48時間v）のPSG、1％（v / v）のピルビン酸ナトリウム、1％（v / v）の非必須アミノ酸、10ng / mlのPMA、および50μMのβ-メルカプトエタノール。 </li></ol>ヌクレオの調製<ol><li> 37℃の水浴中のAccutase Iおよびすべてのメディアを置く。 </li><li>フラスコからの吸引し培地および6mlの（75 cm 2のフラスコ）または12ミリリットル（150 cm 2のフラスコ）と交換してくださいIのAccutaseと細胞の完全な剥離、37℃で30分間インキュベートする。細胞が丸い外観を有することを確認するために私のAccutase処理後の細胞の形態を観察します。いくつかの細胞は、まだ取り付けられるように表示される場合は、慎重にマイクロピペットでフラスコをすすぎやそっとの剥離を完了するために、それをタップします。これは、細胞の活力に悪影響を与えるように、セルスクレーパーを使用しないでください。 15mlチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li>のAccutase I処理中に、次のメディアを準備します。 <ol><li>トランスフェクション培地を調製する：補足細胞培養培地を、1％（v / v）のPSGを、1％（v / v）の非必須アミノ酸、1％（v / v）のピルビン酸ナトリウム、および5％（v / v）のヒト血清（プラスミドDNAの場合）、ヒト血清（siRNAの場合）または20％（v / v）の; 2つの12ウェルプレートに1つの6ウェルプレートまたは4ミリリットル/サンプルのいずれかのため3ミリリットル/試料の最終容量を準備する。 </li><li>培養培地を準備し補足培養培地を、1％（v / v）のPSGを、1％（v / v）の非必須アミノ酸の、1％（v / v）のピルビン酸ナトリウム、および5％（v / v）のhu男性（siRNAのための）血清または20％（プラスミド用）（v / v）のヒト血清、2.5 ngの/ mlのPMA、および50μMβ-メルカプトエタノール; 2つの12ウェルプレートに1つの6ウェルプレートまたは4ミリリットル/サンプルのいずれかのため3ミリリットル/試料の最終容量を準備する。 </li></ol></li><li>室温で300×gで5分間遠心し、細胞懸濁液。 </li><li> 37℃に予め温めRPMI培地1ml中を吸引のAccutase I再懸濁細胞;細胞数を決定するために、細胞を計数。 注：高速自動細胞計数手順が使用される場合、2.4およびステップ2.5を省略してもよいし、細胞を剥離がのAccutase Iへの長期暴露が回避されることを条件直後にカウントすることができる。 </li><li>各トランスフェクションサンプルについて2.0〜2.5×10 6個の細胞を含む遠心管に分注しを準備します。 </li></ol> THP-1マクロファージの3ヌクレオ<ol><li>室温で250×gで10分間遠心操作は、すべての分量。 </li><li>ヌクレアーゼフリーでプラスミドDNAまたはsiRNAを希釈水または適当な緩衝液。可能な限り小さくプラスミドDNAまたはsiRNAの必要量を保管してください。 </li><li>各トランスフェクションのためのsiRNA1μgのか、プラスミドDNAの0.5μgのいずれかで1ヌクレオキュベットを準備します。 </li><li>一度に一つのトランスフェクションを実行します。細胞アリコートからの上清を吸引し。 </li><li> DNA / siRNAおよびヌクレオフェクター溶液100μlの全容積を得たヌクレオフェクター溶液中でペレット化した細胞を再懸濁する。最小限に純粋なヌクレオ溶液への曝露時間を維持し、露光時間が15分を超えないことを保証する。 </li><li>穏やかなタッピングによるヌクレオキュベット中に再懸濁細胞とDNA / siRNAのミックス。 </li><li>ヌクレオ2bの装置におけるプログラムY-001を実行することによって細胞をトランスフェクトする。 </li><li>使い捨てのプラスチック製パスツールピペットを用いて反応バイアルにトランスフェクトされた細胞を移す。 </li><li>すぐに準備されたトランスフェクション培地500μlを加える。 </li><li>繰り返しは、各トランスフェクションサンプルに対して3.4〜3.9を繰り返します。 </li></ol><ol><li>トランスフェクトされた細胞について6ウェルまたは12ウェルプレートのどちらかを準備します。ピペット12ウェルプレートの各ウェル（1ウェル/トランスフェクション）に6ウェルプレート（1ウェル/トランスフェクション）またはトランスフェクション培地1.75mlを各ウェルにトランスフェクション培地を2.5ml。 </li><li>マイクロピペットで十分に細胞懸濁液を混ぜる。 </li><li>準備されたウェル（12ウェルプレート中の6ウェルプレートまたは2におけるつのウェルのいずれか）にトランスフェクト細胞を移す。 </li><li>加湿インキュベーター（5％CO 2、37℃）で4時間培養する。 </li><li>微視的細胞の再付着を確認してください。 注：細胞の大部分が再び付着性であるべきである。時折、1時間までの潜伏期間を延長することは不十分な再付着の場合には接着細胞の数を増加させる。 </li><li>慎重にマイクロピペットでトランスフェクション培地を吸引し、培養培地の等量交換してください。一度に吸引するだけでなく。 </li> &lt;李&gt;は、プラスミドまたはsiRNA（24〜72時）の最大効果のために必要な時間のために細胞を培養する。潜伏期間が48時間を超えた場合、48時間後に培地を交換してください。 </li><li>エフェクターと追加の治療のために（ 例えば 、サイトカイン、アゴニスト、アンタゴニストおよび阻害剤）は、PMAなしの無血清培地とβ-メルカプトエタノールを使用しています。時間は、プラスミドまたはsiRNAの最大効果の経時エフェクタのインキュベーション期間の終わりとは、媒体に応じて、エフェクターの追加の変化を計画しています。 24時間よりも長い間、無血清の条件下で細胞を維持しないでください。 </li></ol>

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	<li>Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair.">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+developing+cationic+vectors+for+non-viral+systemic+gene+therapy+against+cancer.">Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer.</a> Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).</li><li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells.">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).</li><li>Mae&#223;, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+efficient+nonviral+transfection+of+premature+THP-1+macrophages.">Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).</li><li>Ma, W., Liu, Y., Ellison, N., Shen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+C-X-C+chemokine+receptor+type+7+(CXCR7)+switches+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+and+phagocytic+activity+in+macrophages+linked+to+atherosclerosis.">Induction of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) switches stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling and phagocytic activity in macrophages linked to atherosclerosis.</a> J Biol Chem. 288 (22), 15481-15494 (2013).</li><li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+localization+of+ABCG1+does+not+require+LXR+activation.">Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).</li><li>Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. J., Hofnagel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47,+a+lipid+cargo+protein+involved+in+macrophage+triglyceride+metabolism.">TIP47, a lipid cargo protein involved in macrophage triglyceride metabolism.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 767-773 (2009).</li><li>Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Lorkowski, S., Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+proteins+visualized+by+freeze-fracture+immuno-electron+microscopy:+A+new+tool+in+cellular+and+molecular+medicine.">GFP-tagged proteins visualized by freeze-fracture immuno-electron microscopy: A new tool in cellular and molecular medicine.</a> J Cell Mol Med. 13 (7), 1381-1390 (2009).</li><li>Guh, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activators.">Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators.</a> J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).</li><li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli.">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli.">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li><li>Angosto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+inflammasome+functions+in+vertebrates:+Inflammasome+and+caspase-1+trigger+fish+macrophage+cell+death+but+are+dispensable+for+the+processing+of+IL-1b.">Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b.</a> Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).</li><li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes.">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li></ol>

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ここで概説したプロトコルは、通常、トランスフェクションがかなり困難であるTHP-1マクロファージをトランスフェクトする信頼性の高い効率的な方法を提示します。トランスフェクションは、細胞の生命力の有意な減少なしにsiRNAの90％を超えるトランスフェクション効率を達成することができる。プラスミドについて効率は、そのサイズが少ないためであり得るが、70％程度のトランスフェクション効率は、通常、達成することができる。 siRNA媒介ノックダウンの効率は適用されたsiRNAに応じて百分の80から90まで到達することができます。このプロトコルの主な利点は、細胞分化を妨害しないことである。トランスフェクション後、細胞は、依然として12分化剤PMA（1Bと図4に図1A）に正常に応答。これはまた、トランスフェクションA後の培養のために選択された媒体に強く依存するが、加えて、そのようなIL10またはLPS /IFNγなどのサイトカインの刺激による細胞分極は、12影響を受けません図4に示す。■。 特定の要件にプロトコルを適合させるために修飾することができるプロシージャ内のいくつかのオプションがあります。 図4に示すように細胞をトランスフェクションした後、選択培地に応じて、同じIL10刺激に異なって反応する。これは培地組成が細胞挙動に強い影響を持っていることを示している。媒体によって課される効果は、さまざまな実験的な刺激のために異なるかもしれないので、それは最適な媒体が変更される可能性があることが可能であり、したがって、独立して、異なる実験のために培地の適合性を検証する必要がある。しかしながら、THP-1細胞の培養に使用されるデフォルトの媒体であるRPMI-1640培地は、細胞活力の有意な損失が観察されたように、トランスフェクション後の培養には不向きであることが証明された。さらに、プロトコルはまた、前のPMA誘導性分化せずにTHP-1単球に適用することができ、これを明らかに手順の間の細胞剥離の必要性を除去するが、残りのすべての手順を調整する必要はありません。必要に応じて、THP-1単球を、その後分化させることができる。 プロトコルの最も重要な要素は、まず、剥離および第二に、トランスフェクションのために必要な時間である。剥離が高い細胞生存率を維持するために、できるだけ穏やか行わなければならない。そこで私たちは、私のAccutaseオーバーな​​ど、トリプシン処理として非常に攻撃的な方法によって、比較的温和な酵素脱離することをお勧めします。そのようなリドカインまたはスクレーピングによる治療などのさらなる剥離法は、むしろ有害であることが判明したため、使用しないでください。のAccutase I治療の30分すべての細胞を剥離するのに十分であるべきではない場合に正しく、これは通常、誤って格納されている、または期限切れのAccutase I溶液またはあまりにも多くの凍結融解サイクルの指標である。私たちは、-20°でのAccutase私の小さなアリコートを格納することにより、良好な結果を得たCは、凍結融解サイクルの回数を減少させる。しかし不十分な剥離新鮮なのAccutaseでのAccutase私を交換するか、1時間までのインキュベーション時間を増やすのいずれかがある場合もございます。加えて、フラスコまたはプレートを穏やかにタッピングやリンスを脱離を支援することができます。トランスフェクションのための必要な時間に関する純粋なヌクレオ溶液への細胞の曝露時間は、できるだけ短くする必要があり、したがって細胞の生存に大きな影響を持っている。これを達成する最良の方法は、時間並行して（ステップ2.10から2.15）ではなく、複数のトランスフェクションでのそれぞれのトランスフェクションを行うことである。 ノックダウン効率が低い場合、これは通常、低いトランスフェクション効率によるものではないが、これは容易にフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡使用して検証し、蛍光標識siRNAまたはGFPをコードするプラスミドを標識することができる。大部分の原因は、非効率的なsiRNA又はプラスミドDNAである。これらの状況下では、（2-3μgのまで）siRNAの量を増加させるために考慮されるべきであるか（1-2μgのまで）プラスミドDNAまたは利用可能な場合は、別のsiRNAまたは発現ベクターを使用します。代替的に、満足な結果は、同じターゲットに対して向け複数の異なるsiRNAのプールを使用することによって達成され得る。さらに、経時変化実験は、正確には、通常、トランスフェクション後24〜72時間後に達した最大効果の期間を決定するために必要とされる場合があります。 別にトランスフェクションからのエレクトロポレーションによって哺乳動物細胞のトランスフェクションのための更なる十分に確立された技術がある。頻繁に適用されるシステムは、貨物核酸と複合体を形成した後、細胞内への輸送を容易にすることができる化学的トランスフェクション剤である。最も一般的に使用される試薬は、異なる脂質種に基づいているか、カチオン性ポリマー3の数から選択することができる。両方が多様な選択に近づくために市販されている。これらのトランスフェクション試薬は、それらが通常であるという利点を提供使いやすく、多くの時間を必要としないため、剥離の必要性を取り除くだけでなく、接着細胞を扱う。残念ながら、マクロファージは、それらがインビトロで有意に増殖し、外来DNAの細胞質ゾル13-15に対して向けられた防御機構を持たないように、これらの方法によってトランスフェクトすることがかなり困難である。したがって、化学的トランスフェクションアプローチは、しばしば、細胞生存率の著しい減少をもたらす。しかしながら、図2に示すようにそこに成功マクロファージへのsiRNAを転送することができ、化学的トランスフェクション剤があるが、フローサイトメトリー（ 図2A）および蛍光顕微鏡（ 図2B）の分析は、それらが細胞内のsiRNAの同一の均一な分布を達成することができない示すようヌクレオにより得られた。実際には、フローサイトメトリーデータは、トランスフェクトされた細胞の二つの異なる集団がNucleofecti後の細胞と同様の蛍光を有する集団まず、起こることを示しているオンが検出され、第二に、より強い蛍光を持つ人口があります。明確な確認がまだ必要であるが、私たちは、第一集団は、蛍光顕微鏡で第二集団は、おそらく非常に明るい凝集体を持つ細胞に相当する細胞質ゾル内の蛍光siRNAの均一な分布を示し、これらの細胞と同一であると仮定します。 図2Aに示すフローサイトメトリーのデータは、代替リポフェクション法よりも細胞あたりの少ないsiRNA中のヌクレオ結果。しかし、図3のデータは、ヌクレオとして援用するsiRNAであっても、比較的少量既に標的遺伝子の80〜90％のノックダウンのために十分であることを示している。したがって、化学的トランスフェクション後の第二の集団として援用siRNAの追加の量は非常に可能性が余剰であり、従って、更なる増加ノックダウン効率よりも望ましくない副作用を引き起こす可能性が高くなる。それとは別にこれらのsiRNA分子は、機能または遊離siRNA分子よりも少なくとも効率が低い可能性があり、オフターゲット効果を引き起こす可能性があるため、細胞内凝集体の形成は、それ自体が既に望ましくない。さらに、これらの凝集物の真の性質はまだ明らかではない。それは、これらの明るいスポットがsiRNAが細胞によって内部が、その後エンドソームからの放出されたことを示すエンドソームに失敗し、siRNAは、閉じ込められたため、効果がないまま表現している可能性があります。あるいは、スポットは、細胞内で形成される凝集体である可能性があります。化学トランスフェクションの機能評価は、したがって、ノックダウン効率に決定的な文はまだ二つの異なる集団の存在が、これはすべての結果は両集団の平均を記載していることを意味する、既に好ましくない、まだ作ることができない、保留されている、これはそのために対応していない集団のいずれか。そのためヌクレオは、優れたアプローチである。 <p clお尻は= &quot;jove_content&quot;&gt;それにもかかわらず、ここで説明トランスフェクション法には限界もあります。細胞は、ヌクレオ接着細胞が細胞に追加の応力係数を提示する、脱着する必要が懸濁液である必要があるからである。さらにプロトコル全体はかなり時間がかかります。 10実験当たり - トランスフェクションを同時に行うが、細胞の損傷を避けるために迅速に実行する必要はできないので、サンプル数は約8に制限されている。したがって、このプロトコルは、ハイスループットスクリーニングプロジェクトには適していない。高スループットのアプリケーションでは異なるヌクレオシステムが用意されています。まず、16ウェルストリップ·フォーマットを提供しています4D-ヌクレオシステムがあります。さらに大きなスループットを得るため、96ウェルシャトルシステムと384ウェルのHTヌクレオシステムがあります。しかし、これらの新しいシステムは、アルミニウム、したがって電気的条件、 すなわちプログラムやcomposの代わりに導電性ポリマー電極を用いて作業するヌクレオソリューションのitionは、それが私たちのプロトコルは、それらのシステムに転送することができるかどうかを決定する必要がある、それに応じて変更されています。 しかし、これらの制限にもかかわらず、ここに提示プロトコルは、すべての他の非ウイルス的アプローチよりも優れているTHP-1細胞の信頼性のある効果的なトランスフェクションを生じない。このプロトコルは、他のすべての面で差別化し、普通に偏光するため、可能な限りトランスフェクションの少ない副作用として表示THP-1細胞における遺伝子発現の変化の影響の調査を可能にします。

ヒト免疫系の細胞成分の中で、マクロファージは、先天性免疫応答のために非常に重要である。彼らのタスクは多様である。彼らは、組織恒常性において重要な役割を果たし、免疫応答1を調整し、調整するために多数のサイトカインを産生し、分泌し、病原体及び壊死物質の食作用に関与している。したがって、マクロファージは、一体的に、多くの生理学的プロセスおよび病態生理学的状態に関与している。それらの作業の多様性に、マクロファージは非常に異質で多面細胞型である。これは、異なる偏光によって達成される。外部刺激のマクロファージに応じて異なる表現型2内に開発することができます。免疫応答に対するマクロファージ &#39;変動性と影響、それらは非常に興味深い研究対象にする。彼らの複雑な代謝および調節機能を解明するために、in vitroモデル内の適切なマクロファージはREQです正しくマクロファージの不均一や変動性を反映しているuired。 細胞遺伝子の発現を変更するために、プラスミドDNAベクターまたは小さな干渉RNA（siRNA）を用いた細胞のトランスフェクションは、遺伝子調節、遺伝子機能の両方を調査するための細胞生物学で広く使用される強力なツールとなっている。現在、真核細胞のトランスフェクションのための利用可能なさまざまなツールの大規模な選択があります。これらのツールは、（核酸と複合体を形成することができるポリマーまたは脂質に依存している）ウイルスベクター（例えば、遺伝子銃など）機械的方法、化学的ア ​​プローチの適用、およびセル3のエレクトロポレーションが含まれる。これらのアプローチの全ては、それぞれの長所と短所があり、特定の細胞型およびアプリケーションのためにこの広い配列から最適なを選択することが困難で時間のかかるプロセスであることができる。 マクロファージは、ほぼすべての十分に確立されたtransfeをトランスフェクションが困難であることが知られてctionアプローチは大幅にマクロファージ&#39;の生存率を低下させるか、その行動を妨害する、 すなわち分化及び特定の偏光における。したがって、ここではDNA量の減少を必要とする最適化されたエレクトロポレーションアプローチを表し、エレクトロポレーション、ヌクレオベース技術を用いてヒトTHP-1マクロファージをトランスフェクトするための効率的な、非ウイルス性プロトコルを提示する。クレオは、単球やマクロファージなどの感受性細胞に非常に適している。このプロトコルは、以前に公開されたバージョン4,5を最適化したものです。 要するに、ホルボール12 - ミリステート13 - アセテート（PMA）は、従来siRNAまたはプラスミドDNAでのトランスフェクションに未熟マクロファージへの48時間のヒトTHP-1単球を区別するために使用される。トランスフェクションのために未分化マクロファージのAccutase I処理により酵素的に切り離されている。トランスフェクションは、細胞のエレクトロポレーションのためのヌクレオ2bの装置を用いて行われる。トランスフェクションの後、異なる必要に応じてentiationは、別の24〜48時間継続される。最後に、成熟したトランスフェクトされたマクロファージは、機能的研究のための化合物の異なる種類と共にインキュベートする。 このアプローチは、ヒトTHP-1単球およびマクロファージのような細胞株のトランスフェクションを可能にし、正常に過去6-10に適用されている。ほとんどの化学的トランスフェクションアプローチとは対照的に、未熟マクロファージを使用して私たちの修正されたヌクレオ手順は、ウイルスベクターを使用するか、または未知の副作用がさらに担体化合物を添加する必要なしに、損なわれていない細胞の生存率と組み合わせた高トランスフェクション効率をもたらす。また、マクロファージは、このように、トランスフェクション11以下のスムーズな機能の調査を可能にするそれらの完全な差別化のための可能性だけでなく、偏光を保持します。 さらに、ヌクレオ後に適用細胞培地を強くトランに続く機能的研究に影響を与えsfection;特に、偏光のためのマクロファージの能力が適用培地に依存して影響を受ける可能性がある。ここで、細胞培養培地の4つの異なるタイプが（IMDM、X-VIVO 20、LGM3およびマウスT細胞のNucleofector培地）THP-1マクロファージを用いたインターロイキン（IL）10を用いて不活性化する条件下で試験した、私たちはIL10に対する細胞の応答性があることが観察さマウスT細胞のNucleofector媒体は、上述した他の培地と比較して使用される場合、最も強い。これらの結果は、これらが大幅に実験結果を改善することができるように、すべての細胞培養条件の適切な最適化が成功したトランスフェクションundの後続の機能的研究のために必須であることを示している。 マクロファージは、さまざまなヒト疾患に関与しているように、多くの研究が、マクロファージの行動だけでなく、マクロファージによって制御マクロファージまたは順番に影響を与える規制的なメカニズムの解明に焦点を当てています。したがって、このプロトコルは、で関連性がある多くの異なった研究分野。

<table><tbody><tr><td>Accutase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Amino acids, nonessential</td><td>PAA</td><td>M11-003</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (15 ml)</td><td>TPP</td><td>TPP91015</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS gold)</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Human Monocyte Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>VPA-1007</td><td>Contains Nucleofector Solution, cuvettes, and Pasteur pipettes</td></tr><tr><td>Human serum off the clot</td><td>Lonza</td><td>C11-020</td><td></td></tr><tr><td>Isove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine</td><td>Lonza</td><td>12-722F</td><td></td></tr><tr><td>Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3)</td><td>Lonza</td><td>CC-3211</td><td></td></tr><tr><td>Mouse T Cell Nucleofector Medium</td><td>Lonza</td><td>VZB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b</td><td>Lonza</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / streptomycin / L-glutamine (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)</td><td>PAA</td><td>E15-840</td><td></td></tr><tr><td>siRNA / plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 human leukemia monocytes</td><td>CLS</td><td>300356</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flasks (75 cm&amp;sup2;; 150 cm&amp;sup2;)</td><td>TPP</td><td>TPP90076/TPP90151</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture plates (6-well; 12-well)</td><td>TPP</td><td>TPP92406/TPP92012</td><td></td></tr><tr><td>Tubes (1.5 ml)</td><td>StarLab</td><td>S 1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 20 with gentamycin</td><td>Lonza</td><td>BE04-448Q</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

highly efficient transfection of human thp-1 macrophages by nucleofection

マクロファージは、先天性免疫応答のキープレーヤーとして、組織の恒常性やさまざまな病状を扱う研究の焦点である。 siRNAおよびプラスミドDNAを用いたトランスフェクションは、それらの機能を研究するための効果的なツールですが、マクロファージのトランスフェクションは、些細な問題ではありません。真核細胞のトランスフェクションのための多くの異なったアプローチが利用可能であるが、わずか数は、マクロファージの信頼性と効率的なトランスフェクションが、減少した細胞の活力と頻繁に観察され、分化や偏光のために減少した能力のような深刻な改変された細胞の挙動を可能にする。従って、トランスフェクションプロトコールは、このように正常な細胞挙動の文脈におけるsiRNAの効果またはプラスミドの調査を可能にする重大な副作用を引き起こすことなく、マクロファージへのsiRNAおよびプラスミドDNAを伝達することが可能であることが要求される。ここに提示されたプロトコルは、確実かつ効率的にヒトTHP-1マクロファージおよびカをトランスフェクトするための方法を提供高い細胞活力、高いトランスフェクション効率、および細胞の挙動に最小限の影響でnocytes。このアプローチは、ヌクレオに基づいており、プロトコルは、トランスフェクション後、細胞活性化のための最大能力を維持するために最適化されている。プロトコルは、接着性剥離後の細​​胞ならびに懸濁液中の細胞のために適切であり、小型の媒体にサンプル番号のために使用することができる。このように、提示された方法は、マクロファージ分化と偏光の間に遺伝子調節の効果を調査するのに便利です。別に代替化学的方法と比較してこのプロトコルに従ってトランスフェクションしたマクロファージを特徴付ける結果を提示から、細胞の挙動上のトランスフェクション後の細胞培養培地の選択の影響も議論されている。提示されたデータは、さまざまな実験的な設定のための選択を検証することの重要性を示している。

siRNAを用いたTHP-1マクロファージのトランスフェクションのために、このプロトコルを使用して、私たちは通常、細胞の活力を大幅に削減することなく、90％以上のトランスフェクション率を達成。 図1は、非トランスフェクトに対するsiRNAを蛍光標識して、トランスフェクション後の細胞の状態の24時間を特徴付ける代表的なデータを示しているクレオ試薬およびパルスまたはsiRNAで処理したが、トランスフェクトサンプルとして培養培地のすべての変更を受け取っていなかったコントロール、。 図1Aに細胞形態は、フローサイトメトリー測定により示されている。顕微鏡画像を図1（b）に示す1Cおよび1Dは 、アポトーシス（コントロール：1.5％;ヌクレオ：5.4％）のための低金利表す図 。：;：影響を受けた細胞の活力を示すと壊死（3.2％対照ヌクレオ2.0％）。トランスフェクトされたTHP-1マクロファージがもっとあるので壊死とアポトーシスは、トランスフェクションサンプルに対してわずかに高い着脱が増加中の細胞の損傷の確率こうして、非トランスフェクト細胞よりも取り外すのは困難。最後に、トランスフェクション効率は、 図1Eに示されている。全体のトランスフェクトされた集団は対照に対してシフトされるように、これは全ての細胞が蛍光顕微鏡像（ 図2B）によって確認されたトランスフェクトされることを示している。フローサイトメトリーデータと同様に蛍光顕微鏡画像の両方は、全ての細胞が一貫してセル間だけでなく、細胞内でのsiRNAの均一な分布をトランスフェクトすることを示している。これは、比較図2Aおよび2Bのための脂質ベースのアプローチを用いて化学トランスフェクション剤のためのそれぞれのフローサイトメトリーデータ及び蛍光顕微鏡画像を示す、多くの化学的トランスフェクション試薬とは対照的である。これらの図は、トランスフェクトされた細胞の二つの異なる集団を検出することができることを示している。最初の人口はFolloのトランスフェクションされた細胞に似ているウイングヌクレオ。それらは、低い全体的な蛍光および細胞内のsiRNAの均一な分布によって特徴付けられる。第二の集団は、siRNAの非常に明るい細胞内凝集体に由来する、より強い蛍光でマークされています。 図2Cにおける微分干渉コントラストで示すように、細胞の形態は、両方のトランスフェクションアプローチの影響を受けません。効果的に同様の結果をプラスミドDNAの収量を用いたトランスフェクションは、例についてRobenek ら （2009）9または謝を参照してくださいら （2006）7。 トランスフェクション後の細胞培養培地の選択は、非常に関連性がある。したがって、異なる細胞培養培地は、比較して試験した。選択されたメディアは、すべてのTHP-1細胞の培養に適しており、ポストヌクレオ栽培に適用媒体としてロンザの推奨に従って選択した。 図3は、siRNAのmediatを表すedはIL10RB（インターロイキン10受容体β鎖）のmRNAに対するsiRNAを使用して、効率をノックダウン。試験したすべてのメディアのIL10RBの発現は、対照レベル（ 図3）の10〜20％に減少した。しかし、トランスフェクトされた細胞は、偏光に対するそれらの潜在的な培養培地に応じて異なる。非特異的コントロールsiRNAまたはIL10RB特異的siRNAのいずれかでトランスフェクトしたTHP-1マクロファージは、トランスフェクション後、異なる媒体で栽培し、IL10で処理した。続いて、mRNAレベルでのIL10誘導遺伝子SOCS3（3サイトカインシグナル伝達の抑制因子）の発現レベルをRT-qPCRにより測定した。培養培地との違いは、SOCS3 mRNA発現の誘導の程度に関して発生する（ 図4）、テストされたメディアのマウスT細胞のNucleofector媒体のそれぞれについて、帰納、LGM3、X-VIVO 20とIMDMであった19.5 [17.7から21.5 ]、11.5 [8.5から15.7]、8.0 [4.6から14.2]と7.2 [5.6から9.5]は、それぞれ、倍。ザ·マウスT細胞のNucleofector媒体のreforeアプリケーションが不可欠です。 IL10治療が観察した後に加えて、SOCS3発現に対するIL10RBのノックダウンの効果の違いは、SOCS3 mRNAの発現レベルは、9.5 [8.8から10.3】マウスT細胞のNucleofector媒体に折り、2.1 [1.1から4.1]倍に減少したLGM3で、4.8 [3.2から7.2、X-VIVO 20および3.3 [2.7から3.9]中折りIMDM中で折る。これらの値は、それぞれ49％、18％、60％、45％、異なる媒体におけるSOCS3の発現の減少に相当する。 IL10RB siRNAのトランスフェクション後のIL-10誘導性のSOCS3発現の減少は、トランスフェクションによるIL10RBが正常にダウンレギュレーションを確認します。 <img alt="図1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" width="300" /> トランスフェクトされたTHP-1マクロファージの図1。キャラ。光学顕微鏡によって明らかにし、フローサイトメトリーは、トランスフェクトしていない共同の分析として細胞の特徴的状態が影響を受けない提示されたプロトコールに従ってトランスフェクションしたTHP-1マクロファージに対するntrol細胞。 THP-1マクロファージは、48時間10ng / mlのPMAで分化し、蛍光標識（アレクサ488）、非特異的対照siRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後のいずれかの生細胞の画像は、（B）撮影された、または細胞がIのAccutase処理によって剥離し、フローサイトメトリー（A）により分析した。アポトーシスおよび壊死染色、アネキシンV-フィコエリトリン（PE）（C）および7 -アミノアクチノマイシン（7-AAD）（D）を用いて行った。トランスフェクション効率（E）は、siRNAと取り付けられた蛍光標識を用いたフローサイトメトリーによって決定した。トランスフェクトした細胞（黒色）の蛍光信号は、制御信号（灰色）に対して示されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width = &quot;4インチ&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 51960 / 51960fig2highres.jpg&quot;幅= &quot;400&quot; /&gt; リポフェクション対ヌクレオ後のsiRNAの細胞内分布の図2の比較。THP-1細胞は、このプロトコルに従って48時間分化し、その後ヌクレオによって、またはリポフェクションのいずれかによってトランスフェクトした。提示リポフェクション結果は4のsiRNAと試薬の仕込み比で、製造業者の推奨に従ってXtremegene siRNAのキットを用いて得られた：1。トランスフェクション細胞から24時間後のいずれか、フローサイトメトリー解析のためのAccutase私で剥離または生細胞を用いて顕微鏡的に評価した。集団内の（A）トランスフェクション効率および細胞当たりのsiRNAの分布は、siRNAと取り付けられた蛍光ラベルを使用してフローサイトメトリーによって決定した、siRNAでトランスフェクトすることなく、コントロールは灰色で表示され、siRNAをトランスフェクト試料は、黒で示されている。 （B）蛍光顕微鏡siRNAの（アレクサフルオロ488）蛍光標識の細胞内分布を示す画像。スケールバーは40μmでを表します。 （C）蛍光画像に応じた微分干渉コントラスト像;スケールバーは40μmでを表しています。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" width="500" /> トランスフェクトされたTHP-1マクロファージにおけるIL10RBの図3 siRNA媒介ノックダウン。THP-1マクロファージを概説したプロトコルに従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をプロトコールセクションで説明したように補充し、LGM3（C）、及びX-VIVO 20（D）は、4つの異なる培養培地、すなわちマウスT細胞ヌクレオ培地（A）、IMDM（B）中で培養した。 C言語のエルどちらか非特異的対照siRNA（Ctrlキー）またはIL10RB特異的siRNA（IL10RB）でトランスフェクトした。パルス制御、 すなわち 、次のサンプルが含まれていた追加の対照として。 siRNAは（パルス）の欠如、及び媒体制御でトランスフェクションを受けた細胞、 すなわち 。培地の変更のみを受信し、それ以外は未処理のままの細胞。 24時間のトランスフェクション後に細胞をさらに24時間50ng / mlのIL10を含むまたは含まない無血清培地中でインキュベートした。 IL10RB発現をRT-qPCRにより測定した;図は、3つの独立した実験の平均値は、エラーバーは平均の標準誤差を表す示す。 * はp &lt;0.05; ** はp &lt;0.01; *** はp &lt;0.001対Ctrlキー。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" width= &quot;500&quot; /&gt; トランスフェクトされたTHP-1マクロファージにおけるIL10RBのノックダウン後にSOCS3の図4 IL10依存性調節。THP-1マクロファージは記載されているプロトコルに従ってトランスフェクトした。トランスフェクション細胞は、4つの異なる培養培地マウスT細胞ヌクレオ培地（A）、IMDM（B）で培養した後のプロトコールセクションで説明したように、LGM3（C）及びX-VIVO 20（D）を補充。細胞は、いずれの非特異的対照siRNA（Ctrlキー）またはIL10RB特異的siRNA（IL10RB）でトランスフェクトした。追加の対照として、以下のサンプルが含まれていた： すなわちパルス制御、新羅（パルス）の欠如、及び媒体制御でトランスフェクションを受けた、すなわち細胞を、。培地の変更のみを受信し、それ以外は未処理のままの細胞。 24時間のトランスフェクション後に細胞をさらに24時間50ng / mlのIL10を含むまたは含まない無血清培地中でインキュベートした。 SOCS3のexpressionをRT-qPCRにより測定した;図は、3つの独立した実験の平均値は、エラーバーは平均の標準誤差を表す示す。 *、＃ はp &lt;0.05; **、## はp &lt;0.01; ***、### Ctrlキー対と対のp &lt;0.001はCtrl + IL-10であった。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

このプロトコルは、高い細胞活力と分化と偏光のための完全なマクロファージの容量を維持しつつ、高いトランスフェクション効率でエレクトロポレーションによってsiRNAまたはプラスミドDNAを用いたヒトTHP-1マクロファージをトランスフェクションするための効率的で信頼性の高い手法を提案する。

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

46.7K ビュー.  Friedrich Schiller University Jena. このプロトコルは、高い細胞活力と分化と偏光のための完全なマクロファージの容量を維持しつつ、高いトランスフェクション効率でエレクトロポレーションによってsiRNAまたはプラスミドDNAを用いたヒトTHP-1マクロファージをトランスフェクションするための効率的で信頼性の高い手法を提案する。 

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Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Amaxa Nucleofectorでヒト神経幹細胞をトランスフェクト

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

生物学

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

免疫・感染学

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

マウスマクロファージにおける先天性免疫応答を調査するために、RNA干渉を使用

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

ルシフェラーゼレポーター遺伝子でRAW264.7細胞をトランスフェクト

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including their interplay with significant human pathogens such as the human immunodeficiency virus (HIV). Compared to other immortalized cell lines of myeloid origin, THP-1 cells retain many intact inflammatory signaling pathways and display phenotypic characteristics that more closely resemble those of primary monocytes, including the ability to differentiate into macrophages when treated with phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA). The use of CRISPR-Cas9 technology to engineer THP-1 cells through targeted gene knockout (KO) provides a powerful approach to better characterize immune-related mechanisms, including virus-host interactions. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering using electroporation to deliver pre-assembled Cas9:sgRNA ribonucleoproteins into the cell nucleus. Using multiple sgRNAs targeting the same locus at slightly different positions results in the deletion of large DNA fragments, thereby increasing editing efficiency, as assessed by the T7 endonuclease I assay. CRISPR-Cas9-mediated editing at the genetic level was validated by Sanger sequencing followed by Inference of CRISPR Edits (ICE) analysis. Protein depletion was confirmed by immunoblotting coupled with a functional assay. Using this protocol, up to 100% indels in the targeted locus and a decrease of over 95% in protein expression were achieved. The high editing efficiency makes it convenient to isolate single-cell clones by limiting dilution.

The THP-1 cell line is widely used as a model to investigate the functions of human monocytes/macrophages across various biology-related research areas. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering and single-cell clone isolation, enabling the production of robust and reproducible phenotypic data.

エレクトロポレーションに基づくTHP-1細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

マウス骨髄由来の樹状細胞とマクロファージの蛍光融合タンパク質の発現

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Transfecting Primary Macrophages with Modified mRNA

Source: Herb, M. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60143">Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the process of transfecting primary macrophages with modified mRNA encoding green fluorescent protein. These modified mRNAs, designed to reduce immunogenicity and improve its stability, ensure the successful transfection and subsequent expression of green fluorescent proteins, which is confirmed through fluorescence microscopy.