The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).

以下のプロトコルは、動物管理のカナダの協議会のガイドラインに準拠し、トロント大学の医学部や薬学部動物実験委員会によって承認されています。 表1に記載のように1。必要な試薬を準備する<ol><li> 表1に概説濃度ですべてのスクロース溶液、緩衝液にプロテアーゼおよびホスファターゼ（必要な場合）阻害剤を加え、のddH 2 O。重要：実験の開始に先立って試薬や機器のすべてを、4℃でのすべての手順を実行して、事前にクール。油性マジックで超遠心管を含め、全てのチューブにラベルを付けます。 </li></ol>適切な脳領域の2解剖<ol><li>頸椎脱臼または断頭により動物を生け贄に捧げる。ハウスとは、動物のケアに関する制度や政府の方針に従って動物を安楽死させる。 </li><li>急速番目を削除チルド解剖台の頭蓋骨と場所からの電子の脳。 </li><li>新鮮な組織から適切な脳領域を解剖し、ステップ3に進みます。 </li></ol>モーター駆動ガラステフロンホモジナイザーで3組織の均質化<ol><li> 0.32 M HEPES緩衝ショ糖溶液4ml含む標識13ミリリットルポリプロピレンチューブ中で解剖組織（SPM用）50〜100 mg、または（PSD用）100〜200ミリグラムを置きます。 15ミリリットルに試料を移す先細ガラステフロン組織グラインダー/ホモジナイザー、900rpmで（設定7）にモータ駆動に設定し、30秒かけて12ストロークでサンプルを均質化する。サンプル間の異なるガラステフロンホモジナイザーを使用するか、またはサンプル間の冷蒸留水でホモジナイザーをすすぎ、キムワイプで拭いて乾かしてください。注：組織の最大4グラムを0.32 M HEPES緩衝スクロース溶液4mlに均質化することができる、しかし、それは適切な分別を保証するために少ない組織を使用することをお勧めします。 </li><li> Tバックホモジナイズサンプルを転送同じ13ミリリットルポリプロピレンチューブO。予備後続のタンパク質定量、総タンパク質画分のウェスタンブロット分析のために-80℃でホモジネートし、店舗100μlの。 </li></ol>核画分を削除する4。低速遠心（上清S1に利回り） <ol><li>遠心し、4℃で10分間、900×gで固定角ローターでホモジネート。新しい上清（S1）を移し、13ミリリットルチューブを標識し、0.32MのHEPES緩衝スクロースを500μlの核画分のペレット（P1）を懸濁します。 NOTE：（P1）画分は-80℃で保存し、核画分のウエスタンブロット分析のために使用することができる。 </li></ol>粗製シナプトソーム画分の5。エンリッチメント（利回りペレットP2） <ol><li> 4℃で15分間のを10,000×gで遠心上清（S1）。その後のタンパク質定量のために-80℃で保存するために上清（S2）、および予備マイクロチューブ内の500μlのを削除しますificationおよび細胞質/光膜画分のウエスタンブロット分析。 0.32 M HEPES緩衝スクロース溶液1ml中に残った粗シナプトソーム画分をペレット（P2）に再懸濁し、別の3ミリリットルの0.32 M HEPES緩衝スクロース溶液を添加する。 </li><li> 4℃で15分間、10,000×gで遠心する。その後のタンパク質の定量化および細胞質/光膜画分のウエスタンブロット分析のために-80℃で保存するためのマイクロ遠心チューブに上清（S2 &#39;）と予備500μlのを削除します。ポリプロピレンチューブに洗浄された粗シナプトソームペレット（P2 &#39;）を保存します。 </li></ol>粗製シナプトソーム画分の6。·ライジング（低浸透圧ショック） <ol><li>溶解のddH 2 O 1ml中に再懸濁することによりポリプロピレンチューブ中の粗シナプトソームペレット（P2 &#39;）のddH 2 Oを別の3mlをガラステフロン組織ホモジナイザーに移し、追加し、3ストロークで、手で均質化する。注：これは重要です可能な限り迅速に、この手順を実行し、すぐに6.2に進みます。 </li><li>バック同じ13ミリリットルのポリプロピレンチューブに、急速にホモジナイザーからの振替サンプル混合する反転、1M HEPES溶液の16μlのバック4のHEPESにサンプルを調整します。 </li><li>完全な溶解を確実にするために30分間、4℃でサンプルを回転させます。 </li></ol>シナプトソーム膜画分の7。エンリッチメント（P3） <ol><li> 4℃で20分間25000×gで遠心する。原油水疱分画上清（S3）を取り外し、その後のタンパク質定量およびウエスタンブロット分析のために-80℃で保存するために5ミリリットルチューブにそれを予約。 0.32 M HEPES緩衝スクロース溶液1mlにシナプトソーム膜画分（P3）を再懸濁する。 </li></ol>不連続ショ糖勾配の8。準備<ol><li>ピペットで正確に3.5ミリリットルの1.2M HEPES緩衝ショ糖溶液の正確3.0ミリリットルそれぞれ1.0 Mおよび0.8 M HEPEの独立した6ミリリットル中に、S-緩衝化ショ糖溶液はキャップチューブをはめ込みます。注：このスクロース勾配を作るために使用される緩衝液の体積を予め測定するために行われる。ボリュームの正確な測定は、得られた勾配超遠心分離のためにバランスされることを保証することが重要である。 </li><li>ガラスパスツールピペットや電球を使用して、12ミリリットルポリアロマー超遠心管に1.2MのHEPES緩衝スクロース溶液を移す。慎重に1.2MのHEPES緩衝スクロース溶液の上に1.0MのHEPES緩衝スクロース溶液をレイヤー。最後に、1.0MのHEPES緩衝スクロース溶液の上に0.8MのHEPES緩衝スクロース溶液をレイヤー。各ショ糖溶液のために、新鮮なパスツールピペットを使用し、ショ糖勾配を乱さないように注意してください。ベンチボルテックスまたはマイクロ遠心からの振動は、勾配の整合性を乱す。 </li><li>パスツールピペットを使用して、調製された不連続ショ糖勾配の上に再懸濁したシナプトソーム膜画分（P3）の層。勾配がスイングバケットローターのバケツの中にそれらの重量を測定することによってバランスされていることを確認。バケットがバランスの取れていない場合は、慎重に勾配の上部に0.32 M HEPES緩衝蔗糖を追加し、ローターバケットのバランスをとるP200ピペットを使用しています。 </li></ol>シナプス形質膜（SPM）の9分画<ol><li> 4℃で2時間150,000×gで、スイングバケットローターで超遠心分離機。慎重に超遠心バケットからショ糖勾配を削除します。 18 G針および1mlシリンジを用いて、1.0 M / 1.2 M HEPES緩衝スクロース溶液相間の下部にチューブを穿刺し、シナプス形質膜層（SPM）を引き出す。 </li><li>各SPMサンプルは1mlシリンジに占めるボリュームをメモしておいてください。各サンプルが調整された後、正確に4のHEPES、2.5容量の0.32 Mに1.2 Mからスクロース濃度を調整するために追加し、3.5ミリリットル厚肉超遠心管に集め、SPM層を配置edは0.32 Mスクロース、0.32MのHEPES緩衝ショ糖溶液で試験管のバランスをとる。 </li><li> 4℃で30分間200,000×gで固定角ローター中で超遠心機。上清を除去し、廃棄する。 50のHEPES / 2mMのEDTA溶液300μlのシナプス形質膜ペレット（SPM）を再懸濁します。 -80℃で保存サンプルは、ウェスタンブロッティングに使用するまで。 </li></ol>シナプス後肥厚画分の10。準備（PSD） <ol><li>氷上でのSPMのサンプルを解凍する。 </li><li> 50のHEPES / 2のEDTA溶液中の0.54％トリトンX-100の溶液を作る。 </li><li> 5ミリリットルポリスチレンチューブ中で、トリトンX-100 / HEPES / EDTA溶液および300μlのSPMフラクション2.7mlのを結合し、4°Cで15分間試料を回転させる</li><li> 4°Cで20分間32,000×gで3.5ミリリットル厚肉超遠心管、遠心サンプルに転送サンプル。 </li><li> -80上清（トリトンX-100可溶性画分[TS]）​​と店舗を予約;°C。注：この段階では、ペレットは「PSD-1T」割合を表す。界面活性剤による第二の治療は、「PSD-2T」部分を生成します。 PSD-1T画分が所望される場合、10.6に進む。 <ol><li> PSD-2T分画を生成するために、50mMのHEPES / 2mMのEDTA溶液中で0.5％トリトンX-100 3mlにペレットを再懸濁する。 4℃で15分間、サンプルを回転させます。 4℃で20分間、32,000×gで遠心分離した試料とは10.6に進みます。 </li></ol></li><li>上清を捨て、50のHEPES / 2のEDTA溶液中のシナプス後（PSD）ペレットを再懸濁。注：再懸濁体積はペレットのサイズに依存してもよい。 50〜75μlの容量を推奨します。 PSD画分は、界面活性剤不溶性画分であるため、タンパク質の完全な再懸濁を可能にするために0.5％SDSの1〜2μlを添加することがしばしば必要である。 -80℃で保存サンプルは、ウェスタンブロッティングに使用するまで。 </li></ol>

<ol>
	<li>Delint-Ramirez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+composition+of+NMDA+receptor+signaling+complexes+differs+between+membrane+subdomains+and+is+modulated+by+PSD-95+and+PSD-93.">In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+psychiatric+disease+risk+factors+DISC1+and+TNIK+interact+to+regulate+synapse+composition+and+function.">The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function.</a> Mol Psychiatry. 16, (2010).</li><li>Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinsertion+or+degradation+of+AMPA+receptors+determined+by+activity-dependent+endocytic+sorting.">Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting.</a> Neuron. 28, 511-525 (2000).</li><li>Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+interaction+of+stargazin-like+TARPs+with+cycling+AMPA+receptors+at+synapses.">Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses.</a> Science. 303, 1508-1511 (2004).</li><li>Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusional+trapping+of+GluR1+AMPA+receptors+by+input-specific+synaptic+activity.">Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity.</a> Neuron. 54, 447-460 (2007).</li><li>Bats, C., Groc, L., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+Stargazin+and+PSD-95+regulates+AMPA+receptor+surface+trafficking.">The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking.</a> Neuron. 53, 719-734 (2007).</li><li>Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+level+controls+postsynaptic+composition+and+signaling+via+the+ubiquitin-proteasome+system.">Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system.</a> Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).</li><li>Cartier, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+and+functional+protein+complex+involving+dopamine+synthesis+and+transport+into+synaptic+vesicles.">A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles.</a> J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).</li><li>Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+enzymic+studies+of+cholinergic+and+non-cholinergic+synaptic+membranes+isolated+from+brain+cortex.">Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex.</a> Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).</li><li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+nerve+endings+from+brain:+an+electron-microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation.">The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J Anat. 96, 79-88 (1962).</li><li>Cotman, C. W., Taylor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structural+studies+on+synaptic+complexes+from+rat+brain.">Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain.</a> J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).</li><li>Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+postsynaptic+densities+from+rat+brain.">Isolation of postsynaptic densities from rat brain.</a> The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).</li><li>Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+postsynaptic+densities+from+various+brain+regions:+enrichment+of+different+types+of+postsynaptic+densities.">Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities.</a> The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).</li><li>Jones, D. H., Matus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+synaptic+plasma+membrane+from+brain+by+combined+flotation-sedimentation+density+gradient+centrifugation.">Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation.</a> Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).</li><li>Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+immunochemical+evidence+that+the+"major+postsynaptic+density+protein"+is+a+subunit+of+a+calmodulin-dependent+protein+kinase.">Biochemical and immunochemical evidence that the "major postsynaptic density protein" is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).</li><li>Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+tyrosine-phosphorylated+protein+in+the+postsynaptic+density+fraction+is+N-methyl-D-aspartate+receptor+subunit+2B.">The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).</li><li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein.">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter.">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).</li><li>Ma, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-induced+Gadd45b+promotes+epigenetic+DNA+demethylation+and+adult+neurogenesis.">Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis.</a> Science. 323, 1074-1077 (2009).</li><li>Budreck, E. C., Scheiffele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin-3+is+a+neuronal+adhesion+protein+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses.">Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arc/Arg3.1+regulates+an+endosomal+pathway+essential+for+activity-dependent+beta-amyloid+generation.">Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation.</a> Cell. 147, 615-628 (2011).</li><li>Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapsin+I+(protein+I),+a+nerve+terminal-specific+phosphoprotein.+III.+Its+association+with+synaptic+vesicles+studied+in+a+highly+purified+synaptic+vesicle+preparation.">Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation.</a> J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).</li><li>Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+and+characterization+of+synaptic+vesicles+of+high+purity.">The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity.</a> Brain Res. 109, 285-309 (1976).</li><li>Cheng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+and+absolute+quantification+of+postsynaptic+density+proteome+isolated+from+rat+forebrain+and+cerebellum.">Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).</li><li>Sheng, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postsynaptic+architecture+of+excitatory+synapses:+a+more+quantitative+view.">The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view.</a> Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Eggena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+histone+H1+as+a+cognate+antigen+of+the+ulcerative+colitis-associated+marker+antibody+pANCA.">Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA.</a> J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homodimerization+of+the+beta2-adrenergic+receptor+as+a+prerequisite+for+cell+surface+targeting.">Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting.</a> J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).</li><li>Bernocco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+detergent+fractionation+of+primary+neurons+for+proteomics+studies.">Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies.</a> Proteomics. 8, 930-938 (2008).</li><li>Grunewald, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localization+and+cytosolic+overexpression+of+LASP-1+correlates+with+tumor+size+and+nodal-positivity+of+human+breast+carcinoma.">Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma.</a> BMC Cancer. 7, 198 (2007).</li><li>Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+isoforms+of+actin-binding+proteins+on+distinct+populations+of+Golgi-derived+vesicles.">Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles.</a> J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).</li><li>Neff, R. A., Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+scaffolds+for+nicotinic+receptors+on+neurons.">Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons.</a> Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).</li><li>Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal-associated+membrane+protein+LAMP-1+is+a+novel+differentiation+marker+for+HC11+mouse+mammary+epithelial+cells.">The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells.</a> Differentiation. 61, 113-120 (1996).</li><li>Otera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+targeting+signal+receptor+Pex5p+interacts+with+cargoes+and+import+machinery+components+in+a+spatiotemporally+differentiated+manner:+conserved+Pex5p+WXXXF/Y+motifs+are+critical+for+matrix+protein+import.">Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import.</a> Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).</li><li>Goubaeva, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondrial+connexin+43+regulates+apoptosis.">Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).</li><li>Lamers, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-100B,+neuron-specific+enolase+(NSE),+myelin+basic+protein+(MBP)+and+glial+fibrillary+acidic+protein+(GFAP)+in+cerebrospinal+fluid+(CSF)+and+blood+of+neurological+patients.">Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients.</a> Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).</li><li>Arunachalam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+is+critical+for+plasma+membrane+localization+of+syntaxin1+but+not+of+SNAP-25+in+PC12+cells.">Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells.</a> Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).</li><li>Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+bassoon+among+ribbon+synapses+in+the+mammalian+retina.">Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina.</a> Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

成功した結果のために重要である手順にはいくつかのステップがあります。ステップ3では、均質化の一貫性の程度は、各サンプルについて達成されることが重要である。モーター駆動ホモジナイザーで組織を均質化する場合には、一定の速度を乳棒の回転のためだけでなく、ストローク数でも利用される。低張液の拡張均質化またはインキュベーションがミトコンドリアを溶解し、SPMサンプルを汚染するので、浸透圧ショック時のインキュベーション時間は、正確である必要があります。 もう一つの重要なステップは、試薬、特にスクロース溶液の調製である。ショ糖溶液のモル濃度が正しくない場合は手順が動作しません。したがって、スクロース溶液は、その後、正確な最終容量に4のHEPESを加える4のHEPES溶液中に溶解させ、ショ糖の重量を測定することによって準備する必要があります。トラブルシューティングのヒント：ENに準備されたショ糖溶液を用いた試験勾配を構築勾配が適切に組み立てられていることを確認してください。三つの異なる層の可視化を支援するための3つのスクロース溶液のうちの2つに（例えば、w / vの0.005％-0.02％の最終濃度）のブロモフェノールブルーの濃度を変化させ追加します。 これは、勾配が組み立てられたとき、チューブを遠心分離したときの間の時間の量を制限することが重要である。通常の拡散は、時間をかけて勾配を破壊し、勾配が保存されているベンチに振動がある場合、これが加速される。正確なボリュームがガラスパスツールピペットでピペッティングしされるために個別のアリコートへのソリューションの予備ピペッティングが可能になる。これはまた、勾配超遠心分離アセンブリとの間の時間が短縮されます。トラブルシューティングのヒント：実験のためのショ糖勾配と同時に上記のようにブロモフェノールブルー染料で「テスト勾配」を構築。勾配の完全性は、このように経時的にモニターすることができる。テスト勾配となる拡散の指標勾配が事前にすぎ組み立てられるや振動にさらされている場合。 最後に、それは続いて水の2.5倍量の試料を希釈する必要があるため、できるだけ小さい容積のSPMサンプルを収集することが重要である。理想的には、サンプルは、1ccの注射器を用いて0.4〜0.7ミリリットルの容量で収集する必要があります。これは、勾配超遠心分離アセンブリとの間の時間を制限するために、ステップ7で最後の20分間のスピンの間に不連続勾配を構築することをお勧めします。 プロトコルは、異なる画分のすべてを確保し、その後の分析のために-80℃で、これらを格納するための推奨事項が含まれています。当社は、これらの画分のわずかに図2のシナプス後のタンパク質の濃縮を実証した。しかし、その分布を理解する画分のそれぞれに目的とする蛋白のレベルを測定することをお勧めします。 DISTRIBの比較他の細胞内マーカータンパク質画分中のタンパク質のutionも実験条件が必要な分画を達成したことを確認するのに役立ちます。 表2は、分別の段階の指標として使用することができ、一般的に使用されるタンパク質マーカーをまとめた8,27- 38。 不連続ショ糖勾配の利用は広くシナプス形質膜を豊かにするために使用されます。このメソッドは、作成が容易であり、特別な装置を必要としない不連続ショ糖勾配での連続パーコール勾配よりも有利である。しかし、この方法は、正確に、目的のタンパク質を局在化するのに十分でない可能性があり、これらの用途にパーコール勾配が好ましい場合がある。

ニューロンは、シナプスを介して通信しており、この通信の品質はシナプスにおけるタンパク質の組成変化によって大幅に規制されている。特に、シナプス後密度で存在するタンパク質は、そのシグナル伝達系1と密接に足場神経伝達物質受容体による神経細胞のコミュニケーションに参加しています。さらに、シナプス効力の強度の持続的な変化は、シナプス後密度1-6で追加または受容体を除去することによって制御されている。したがって、シナプスタンパク質の単離および定量化は、神経細胞がシナプス効力7を刺激し、変更するための対応方法への洞察を得るために必要かつ有用な技術である。この記事では、不連続ショ糖勾配超遠心分離によって齧歯類脳組織からシナプスのタンパク質を分離するために一般的な手法について説明します。シナプス形質膜画分を濃縮することができるとに基づいて単離さ経験的に1.2Mのショ糖に類似すると判断されたショ糖でのその密度、。 生物学的問題によっては、細胞下画分は、スクロース又はパーコールのいずれかの連続または不連続勾配によって分離することができる。連続勾配は、複数の画分へのタンパク質の分離を可能に。これは、与えられた画分8内のタンパク質の共局在を実証するために特に有用であり得る。しかし、連続的な勾配の調製は、より面倒であり、多くの用途のためには不要である。不連続勾配は調製が比較的容易であり、少数の、一般的に定義された画分にタンパク質を分離するために使用することができます。増加モル濃度の三スクロースの層から構成されている不連続勾配が広くシナプス形質膜（SPM）に関連するタンパク質を単離するために使用されてきた。このシナプス形質膜画分は、さらに、シナプス後密度fractioに加工することができる界面活性剤不溶性画分の界面活性剤処理および分離によりn（PSD）。 このプロセスは、最初に1960年代9,10に記載されたときに、電子顕微鏡は、大まかに、シナプス形質膜およびシナプス後密度画分9-14を定義細胞小器官、膜を実証した。これらの研究は、シナプス前および後膜とSPM画分中のシナプス小胞を含めることを実証した。界面活性剤処理した後、主に電子密度の高い、シナプス後密度が見えた。手順では、低張性ショックは、電池本体10からシナプスプロセスをピンチオフするために使用される。このステップは、ミトコンドリア浸透圧ショックに対してより耐性であり、無傷のままであり、従ってそれらはショ糖勾配（ 図1）の底部に沈降するという事実を利用する。 これと同じ濃縮技術を使用して、SPMとPSD画分を生化学的に最初でした主要なタンパク質成分15〜17のポリアクリルアミドゲル電気泳動および配列決定によって定義される。続いてウェスタンブロット分析（ 図2）、これらの画分を定義し、さらに検出し、シナプスのタンパク質のレベルを定量化するために使用されている。私たちは、SLC6A3遺伝子座をマウス18で重複しているときに発生するドーパミントランスポーターのシナプスレベルの変化を定量化するために私たちの研究室でこの技術を使用している。また、DISC1のインタラクトーム19の一部であるタンパク質中のシナプス特異的な減少を明らかにNMDA受容体欠損マウスでは、この技術を使用している。 これは、SPM画分を、シナプス小胞膜タンパク質、エンドソームのマーカー、ミトコンドリアタンパク質、膜結合合成酵素およびシグナル伝達分子、ならびにシナプス後密度の不可欠な構成要素とシナプス形質膜20〜23を含有し、ウェスタンブロット分析から明らかである。 EVEN PSD画分を豊富ミトコンドリアタンパク質の混入を持つことができ、それは彼ら13を除去する第二の勾配沈降または追加の精製工程を実行する必要があるかもしれない。最近では、定量的な質量分析だけでは、シナプス後密度の100以上のタンパク質のリスト、ならびにこれらの構成要素24,25の相対存在量の指標を提供してきました。

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES, pH 7.4</td><td>BioShop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioBasic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>BioShop</td><td>PMS123.5</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>BioShop</td><td>APR600.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>BioShop</td><td>LEU001.1</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>BioShop</td><td>PEP605.5</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>BioShop</td><td>BEN601.25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>BioShop</td><td>SFL001.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate</td><td>BioShop</td><td>SPP310.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>BioShop</td><td>SOV664.10</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>BioShop</td><td>GYP001.10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>TRX506.500</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 &amp;frac12;&amp;rdquo; needle</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1 cc syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23</td><td>VWR</td><td>KT885450-0023</td><td></td></tr><tr><td>IKA Model RW 16 basic stirrer</td><td>IKA Works</td><td>2572100</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SM-24 fixed angle rotor</td><td>ThermoScientific</td><td>29017</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall polyallomer tubes (13.2 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti rotor swinging bucket</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L-80 floor ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thickwall polycarbonate tubes (3.5 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 fixed angle rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td></td></tr><tr><td>Beckman TL-100 tabletop ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient

神経細胞下分画技術がシナプスとの間で売買されているタンパク質の定量化を可能にします。もともと1960年代後半に記載されるように、シナプス形質膜に関連するタンパク質は、ショ糖密度勾配超遠心分離によって単離することができる。シナプス膜が単離されると、シナプス後密度として知られている高分子複合体は、続いて、その界面活性剤不溶性に単離することができる。シナプス形質膜およびシナプス後密度タンパク質を単離するために使用される技術は、40年後に本質的に同じままであり、広く現在の神経科学の研究で​​使用されている。この記事では、不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後密度に関連するタンパク質の分画について詳しく説明します。得られたタンパク質調製物は、ウェスタンブロットまたは2D DIGE分析に適している。

ショ糖密度勾配の調製は、ショ糖の3モルソリューション（0.8、1.0、1.2 Mショ糖）の明確な分離をもたらすはずである。タンパク質サンプルを添加する前勾配の例については、 図3Aを参照してください。勾配は、事前にあまり用意され、またはそれは他の機器からの振動をベンチ表面上に用意されている場合、勾配が損なわれ、適切な分離が達成されない場合。三つの溶液の明確な分離が表示されていない場合には、タンパク質試料を追加する前に、新しいグラデーションを作成することをお勧めします。タンパク質サンプルが追加されたショ糖勾配（黒矢印）の例については、 図3（b）を参照してください。 遠心分離後、各間期におけるタンパク質画の明確なバンド（0.32 / 0.8、0.8 / 1.0、1.0 / 1.2）があるはずです。加えてペレットをチューブの底に見えるはずです。例については、 図3Cを参照してください超遠心分離後の留バンドの。画分だけ、間で拡散して存在している場合、それは勾配が侵害された更なる処理をお勧めされていない可能性があります。 マウスの線条体からの総、SPM及びPSD1Tタンパク質試料のウェスタンブロッティング図2に示されている。のGluR1、PSD95、およびCaMKIIのようなシナプスのタンパク質の濃縮を、合計、SPMからのタンパク質（10μg）を一定量をロードすることによって視覚化することができる、およびPSD画分。ドーパミントランスポーター（DAT）のようなPerisynapticタンパク質は、SPM画分に濃縮されているが、PSD濃縮プロセスのその後の洗剤のステップで除去される。 同等のローディングを確実にするために、タンパク質レベルはポンソーレッド26で染色してウエスタンブロット膜上で視覚化することができる。抗体ベースの「負荷制御」は、シナプスタンパク質は差分かもしれないので、多くの場合、文献に報告されているが、これは誤った名称であってもよいerentially実験的治療群で規制。抗体ベースの「負荷制御」が所望される場合は、最初ポンソー染色により同等のタンパク質負荷を決定し、別の実験群において変化しないものを同定するためにいくつかの基準タンパク質をテストすることが望ましい。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51896/51896fig1highres.jpg" width="500" /> SPMとPSD蛋白分画を豊かにする細胞下分画の図1のワークフロー。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51896/51896fig2highres.jpg" width="500" /> タンパク質抽出物を図2マウスの線条体からの総、SPM、およびPSD1Tタンパク質の代表的なウエスタンブロット。10μgのは、SDS-変性、10％アクリル上で分離したアミドゲル、およびPVDF膜に移した。その後、これらのブロットを、後シナプス密度のすべてのコンポーネントであるαCaMKII、GluR1の、PSD-93、およびPSD-95のための一次抗体と共にインキュベートした。したがって、これらのタンパク質はSPMとPSD画分に濃縮される。交互に、ブロットは線条体におけるシナプス前膜に位置しているDATのための一次抗体と共にインキュベートした。 DATは、SPM画分に濃縮されるが、それはPSD複合体の一部ではなく、免疫反応性はPSD画分に観察されない。いくつかの実験条件も同様にこれらのタンパク質のレベルに影響を与えるかもしれないがアクチンまたはナトリウム/カリウムATPアーゼし（Na / Kポンプ）に対する抗体を、ローディングコントロールとして使用することができるので、適切なローディングコントロールは、経験的に決定されなければならない。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51896/51896fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。 </st栄&gt; ショ糖勾配の代表的な例として前と超遠心分離後に。勾配を調製した後、Aは 、チューブは、光にかざしたときに表示されている3段階があるはずです。白い矢印は、0.8 / 1.0 Mショ糖溶液、および1.0 / 1.2 Mのショ糖溶液間の中間相を示している。B.サンプルは、勾配の上にロードされると、それは0.32 Mショ糖溶液内にあり、0.8の上に残りますのスクロース層℃で遠心分離した後、ホモジネートは、いくつかの画分に分離される。 0.8 / 1.0 Mショ糖溶液の相間での浮遊画分は、ミエリン膜に濃縮されます。 1.0 / 1.2 Mのショ糖溶液の相間での画分は、針およびシリンジを用いて収集されるSPMの割合を表す。チューブの底にペレットをミトコンドリアタンパク質のために濃縮される。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> ソルン</td><td> HEPES緩衝蔗糖 </td><td> プロテアーゼ阻害剤 </td><td> *ホスファターゼ阻害剤 </td></tr><tr><td> 1MのHEPES pH7.4中</td><td> 4のHEPES（pH7.4）中の0.32Mのスクロース</td><td> 0.25のPMSF（エタノール、1,000倍の株式250 mM）を</td><td> 10mMのフッ化ナトリウム（株式500ミリモル、50×） </td></tr><tr><td> 4のHEPES pH7.4中</td><td> 0.8Mのショ糖4のHEPES（pH7.4）中</td><td> 1.5 / mlのアプロチニン（株式1.5 mg / mlの、1,000倍） </td><td> 2.5mMのピロリン酸ナトリウム（株式250mMの、100倍） </td></tr><tr><td>のddH 2 O </td><td> 1.0Mのショ糖4のHEPES（pH7.4）中</td><td> 10μg/ mlのロイペプチン（株式10 mg / mlの、1,000倍） </td><td> 1.0 mMのB-グリセロリン酸（株式200mMの、200倍） </td></tr><tr><td> 50mMのHEPES（pH7.4）中の2mM EDTA </td><td> 1.2Mのショ糖4のHEPES（pH7.4）中</td><td> 0.1 mg / mlのベンズアミジン（ストック100 mg / mlの、1,000倍） </td><td> 5.0mMのオルトバナジン酸ナトリウム（株式500ミリモル、100倍） </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 10μg/ mlのペプスタチン（エタノール、500分の1の株式5 mg / ml）を</td><td></td></tr></tbody></table> 表1に必要な試薬 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="614"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:88px;"> 分数 </td><td style="width:191px;"> タンパク質画分 </td><td style="width:335px;"> タンパク質標識 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> P1 </td><td>核</td><td>ヒストンH1 27 </td></tr><tr height="72"><td height="72" style="height:72px;"> S1 </td><td>細胞質ゾル/メンブレン</td><td style="width:335px;">カルネキシン28（小胞体）、チューブリン29（細胞骨格）、GAPDH 30（細胞質ゾル）、58Kゴルジプロ31（ゴルジ装置）テイン</td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> P2およびP2 &#39; </td><td>粗製シナプトソーム</td><td style="width:335px;"> AMPAおよびNMDA受容体サブユニット32 </td></tr><tr height="48"><td height="48" style="height:48px;"> S2およびS2 &#39; </td><td>細胞質ゾル/光膜</td><td style="width:335px;"> nNOS1 29（細胞質ゾル）、GAPDH（細胞質ゾル）、ランプ1 33（リソソーム）、PEX14 34（ペルオキシソーム） </td></tr><tr height="45"><td height="45" style="height:45px;"> P3 </td><td>シナプトソーム/ミトコンドリア</td><td style="width:335px;"> VDAC 35（ミトコンドリア）、AMPAおよびNMDA受容体サブユニット（シナプトソーム） </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> S3 </td><td>シナプス小胞</td><td style="width:335px;"> SV2 8、シナプトフィジン8 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> 0.8 M / 1.0 M </td><td> M<html> yelin </td><td style="width:335px;">ミエリン塩基性タンパク質36 </td></tr><tr height="45"><td height="45" style="height:45px;"> 1.0 M / 1.2 M </td><td> SPM </td><td style="width:335px;"> AMPAおよびNMDA受容体サブユニット、シナプス前のマーカー（SNAP25 8）、ニューレキシン32、ニューロリギン32 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> 1.2 MP </td><td>ミトコンドリア</td><td style="width:335px;"> VDAC 35 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;"> PSD（1T） </td><td> PSD </td><td style="width:335px;"> PSD93 32、PSD95 32、AMPAおよびNMDA受容体サブユニット、ニューロリギン、PICK1 32、CaMKIIの32 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> TS </td><td>シナプス前膜</td><td style="width:335px;"> SNAP25、Munc18 37、ファゴット38、ニューレキシン</td></tr><tr height="43">IGHT：43px; &quot;&gt; PSD-2T </td><td>濃縮されたPSD </td><td style="width:335px;"> PSD95、AMPAおよびNMDA受容体サブユニット、PICK1、CaMKIIの</td></tr></tbody></table> 細胞成分分画を区別するタンパク質マーカーの表2にリスト

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient at JoVE.com

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

この記事では、不連続スクロース勾配超遠心分離によってシナプス形質膜に関連するタンパク質の濃縮を詳しく説明します。シナプス後肥厚タンパク質のその後の調製も記載されている。タンパク質調製物は、ウェスタンブロットまたは2D DIGE分析に適している。

不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

preparation-synaptic-plasma-membrane-postsynaptic-density-proteins

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.1K ビュー.  University of Toronto. この記事では、不連続スクロース勾配超遠心分離によってシナプス形質膜に関連するタンパク質の濃縮を詳しく説明します。シナプス後肥厚タンパク質のその後の調製も記載されている。タンパク質調製物は、ウェスタンブロットまたは2D DIGE分析に適している。 

ビデオ: Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

脳膜分画：<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

生化学

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

神経科学

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma membrane and then transported to the early endosomes. The internalized proteins could be transited to the lysosome for degradation or recycled back to the plasma membrane. A robust endocytic recycling pathway is required to balance the removal of membrane materials from endocytosis. Various proteins are reported to regulate the pathway, including ADP-ribosylation factor 6 (ARF6). Density gradient ultracentrifugation is a classical method for cell fractionation. After the centrifugation, organelles are sedimented at their isopycnic surface. The fractions are collected and used for other downstream applications. Described here is a protocol to obtain a recycling endosome-containing fraction from transfected mammalian cells using density gradient ultracentrifugation. The isolated fractions were subjected to standard Western blotting for analyzing their protein contents. By employing this method, we identified that the plasma membrane targeting of engulfment and cell motility 1 (ELMO1), a Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1) guanine nucleotide exchange factor, is through ARF6-mediated endocytic recycling.

This paper aims to present a protocol for preparing recycling endosomes from mammalian cells using sucrose density gradient ultracentrifugation.

哺乳類細胞におけるエンドサイトリサイクルを調べた密度勾配超遠心分離

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

ミトコンドリア接触部位の分離

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

著者スポットライト:ミトコンドリアの接触部位と建築的洞察の発表 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製

要約

さらに動画を探す

この動画の章

脳膜分画：

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

哺乳類細胞におけるエンドサイトリサイクルを調べた密度勾配超遠心分離

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング