Name: establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery
Uploaded: 2014-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
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我々はSで私たちを提供するためのレオニー·デ·ボーアとバZaat（アカデミックメディカルセンター）に感謝しています表皮のO-47株。私たちは、COPAS XLおよびVASTバイオイメージ解析分析のヘルプやアドバイスをリコボンガーツ、フランシス·スメットとアンジェラ·コマス（ユニオンBiometrica）に感謝。我々は有用な議論のためにライデン大学からデービー·デ·ウィット、ウルリケNehrdich、および魚の留守番用のローラ·バンヒュルスト、および他の同僚に感謝します。本研究では、生体材料研究所、オランダ経済省が共同出資の研究プログラムのプロジェクトP5.03 IBIZAの一部を形成し、経済のオランダ省のスマートミックスプログラム（NWOA_6QY9BM）のとのオランダ教育省、文化科学。追加のサポートは、EUのプロジェクトZF-ヘルス（FP7健康 - 2009から242048）から入手し、そしてRMJは、EU初期トレーニングネットワークFishForPharma（PITN-GA-201で経験研究者としてマリー·キュリー·フェローシップによってサポートされていました1から289209）。 SJRは、付与契約に基づいて革新的な医薬品イニシアティブ共同事業からの資金提供を受け、N 115337を°、親切contribution.The著者の欧州連合（EU）の第七次フレームワーク計画（FP7/2007-2013）とEFPIA会社から資金拠出によって構成されているのリソースがさらに認めるロボット工学のためのライデン大学基金（LUF）からCyttronからの財政支援、ひいては財政的に画像化施設の科学研究費オランダ機構によってサポートされてBesluit補助金Investeringen Kennisinfrastructuurプログラム内。 COPASシステムの取得は、部分的に科学研究費オランダ機構（NWO、834.10.004）からの資金援助と地球と生命科学（ALW）のための部門によってサポートされていました。

1。細菌株および増殖条件<ol><li> Sを準備する表皮接種<ol><li> Sから、いくつかの個々のコロニーを取る表皮株O-47、pWVW189を含有する補充した25ミリリットルのLB培地中で37℃で一晩10μg/ mlのクロラムフェニコールと文化を補ったルリアベルターニ（LB）寒天プレートからmCherry発現ベクター（未発表デ·ボーアL.）に由来舞台を中間対数増殖する10μg/ mlのクロラムフェニコール。 </li><li> 1分間、12,000×gで、続いて培養物の遠心1mlを、それらを0.3％（v / v）のTween-80をながら1 mlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄する。 </li><li> 600度（OD 600）での光学密度を測定し、PBS中の2％で0.3のOD 600に細菌懸濁液（w / v）ポリビニルピロリドン40（PVP 40）を希釈する。注：OD 600×10 8〜1.0に相当する0.3のコロニー単位/ ml（cfu / mlで）を形成する。 </li></ol&gt; </li><li> Mを準備するmarinumの接種<ol><li> Mから、いくつかの個々のコロニーを取る安定して10mlに28℃で一晩、10％（V / V）ミドルOADCを50μg/ mlのハイグロで補充濃縮および文化にミドル7H10寒天プレートからmCherry 10を表現pSMT3-mCherryベクターを含むマリナム菌株MまたはE11 50μg/ mlのハイグロを補足した10％（V / V）ミドルADC濃縮したミドル7H9ブロス。 </li><li> 1分間、12,000×gで、続いて培養物の遠心1mlを、それが0.3％（v / v）のTween-80を用いて1mlの滅菌PBSで3回洗浄する。 </li><li> OD 600を測定し、PBS中の（W / V）PVP 40 2％OD 0.3の600に細菌懸濁液を希釈。注：1のOD 600が 1.0×10 8 CFU / mlに相当する。 </li></ol></li></ol> 2。ゼブラフィッシュの卵を準備<ol><li> 70男性と50女性の野生のTYの最大値を置き大繁殖容器に別々にゼブラフィッシュをPE。注：大規模な繁殖容器の下部にメスの魚を置きます。 </li><li>ゼブラフィッシュは飼育を開始できるように、午前中に次の日のセパレータを削除します。 </li><li>卵の水（60μg/ mlのインスタント海洋海塩）で満たされた50ミリリットルチューブ内の卵のコレクタに大繁殖容器の底に卵を収集します。 </li></ol> 3。注射針<ol><li> 10μmの内径を有する市販のカスタムメイドのガラスキャピラリー針を取得します。 </li></ol>注射の4。実験概要<ol><li>約40ºCのまで、1％の100ミリリットル（w / v）の卵、水にアガロース、とクールを沸かす自動化されたmicroinjectorsプレートにアガロース注ぎ、アガロースに1024ウェルスタンプを配置します。注意：プレートを冷却するときに使用する準備ができています。 </li><li> 「校正段階」に自動化されたマイクロインジェクターオペレーティングソフトウェアをクリックしたときに、その後、&#39;1024 &#39;だけでなくグリッドをクリックして、マイクロインジェクターでアガロースプレートを置き、ウェルの中心位置に画面をクリックすることで、プレートのキャリブレーションを行います。 </li><li> 「針メニュー」に移動し、「校正針ホルダ」をクリックしてください。 </li><li> 100 CFU / NL Sを含む10μlのPVP 40のいずれかでmicroloaderチップを使用して注射針を埋める表皮または30 CFU / NL M.マリヌム 、または偽注射剤としてPVP 40を使用しています。 </li><li>自動化されたマイクロインジェクターに針を置き、下げたり、針を上に移動すると、針の位置で画面をクリックすることで、Y位置をXのキャリブレーションを行います。次いで、針の先端の位置で画面をクリックすることによって、針のz位置を較正する。 </li><li>プラスチック転送ピペットを用いてアガロース、グリッド上で卵を配布し、余分な卵の水を除去する。自動化されたマイクロインジェクターでアガロースグリッドを配置します。 </li><li> 「充血に行くNメニュー &#39;と調整」Femtojet設定メニューで、1 NLと相関する」200ヘクトパスカルに設定し、「射出圧力射出時間」0.2秒と「報酬圧力&#39; 15ヘクトパスカルを。 </li><li>プレート全体を注入するために「すべてを注入」をクリックします。 </li><li>ペトリ皿当たり70胚の最大で、ペトリ皿（92×16 mm）のにそれらを洗浄することによって、注入後に卵を収集し、28℃でインキュベート</li></ol> 5。フローサイトメーター解析<ol><li>製造業者の指示に従って大粒フローサイトメーターを調製し、卵の水と試料カップおよびシース液容器を充填する。 </li><li>オペレーティングソフトウェアでは、「PMT」メニューに移動し、以下の設定を使用します。「グリーン」と「イエロー」のチャネルに対して650「赤」チャネル用のVと0Vに。そして、「しきい値」メニューに移動し、以下の設定を使用します &#39;視神経をデブリの影響を低減するために、lの密度」閾値信号：975 mVの（COPAS XL値：50）および「320マイクロ秒（800 COPAS XL値）飛行時間」（TOF）最小。 </li><li>胚は、分析のために、5.4に進み、ソートやシャーレに胚をソート5.5または分析のためのステップに移動し、96ウェルプレートに胚をソートすることなく、分析のための5.6に進みます。 </li><li>サンプルカップに胚を置き、分析を開始する「スタート」をクリックしてください。すべての胚を分析する場合は、「停止」をクリックして、分析を停止。 「すべてのストア」​​をクリックして、データを保存します。注：すべてのデータはTXT、LMD、DAT、CSVおよびBSRTファイルとして保存されます。ステップ5.7で、プロトコルに従ってください。 </li><li>サンプルカップに胚を置き、「並べ替え」メニューに70を入力することによってソートされるプレート当たり70胚の最大値を定義します。ソーターの下に空のペトリ皿を置き、「手動で並べ替え」をクリックしてください。ときはペトリディ<html> SHは満たされている、「すべてのストア」​​をクリックして、データを保存します。注：すべてのデータはTXT、LMD、DAT、CSVおよびBSRTファイルとして格納されます。ステップ5.7で、プロトコルに従ってください。 </li><li>サンプルカップに胚を置き、「並べ替え」メニューで1を入力してソートするウェルあたり1胚の最大値を定義します。左プレートホルダーに空の96ウェルプレートを配置し、「プレート塗りつぶし」をクリックしてください。 96ウェルプレートがいっぱいになると、「すべてのストア」​​をクリックして、データを保存します。注：すべてのデータはTXT、LMD、DAT、CSVおよびBSRTファイルとして格納されます。ステップ5.7で、プロトコルに従ってください。 </li><li>ソートモジュール &#39;ステータスのソート」を使用して40を、もし：&#39;ステータスを選択し「次のデータのフィルタ設定を使用して、生データを処理するためにTXTファイルを入手してください。6その後「赤から全蛍光信号から番号を使用平均値と平均値の標準誤差を計算する」チャンネル。バーや散布グラフにこれらのデータセットをプロットします。 </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6。薬物療法<ol><li>分析し、並べ替えで3日間注射後（DPI）、M. marinumのは、大きな粒子流サイトメータ（工程5.5）を用いて二つの等しいグループ内の胚を感染させた。そのキャリア溶媒中で関心のある化合物と1グループを扱い、キャリア溶媒のみ（コントロール）を持つ他の。抗生物質の副作用をテストするために注入されたコントロールモックを作成する同様の処理を適用します。 </li><li> 4と5 dpiの分析（ステップ5.5）で繰り返して化合物を含有する卵の水または卵水をリフレッシュ。 </li></ol> 7。高分解能イメージング<ol><li> （w / v）の10分分析の前に、卵の水に3 - アミノ安息香酸エチルエステル（トリカイン）を緩衝0.02％で胚を麻酔。 </li><li>メーカーの指示に従って脊椎動物自動スクリーニング技術システムと大粒子サンプラーを準備します。 </li><li> 「イメージングから胚の時代に対応する参照画像を選択 - オブジェクト211;検出の設定」メニュー。 </li><li>メニュー - 「自動保存画像イメージング」から脊椎動物自動スクリーニング技術システムによってなされる写真の量と方向を選択します。 </li><li>大パーティクルサンプラの左プレートホルダーに（ステップ5.6から）の胚で満たさ96ウェルプレートを配置し、「実行プレート」をクリックしてください。 </li><li>胚が検出され、位置が合っていれば;画像ヘッドとCLSMは10X無地ドライ対物レンズを用いて、画像処理ソフトウェアを使用して、後で画像をパノラマで別々にテール。 </li></ol>

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JSは、この記事で使用する楽器を作り出す生命科学の方法BVの所有者である。

このホワイトペーパーで説明した高スループットの方法論は、感染症のさまざまな種類の魚の胚および幼虫の多数をスクリーニングする迅速かつ費用対効果のパイプラインを提供しています。代わりに、伝統的な単一または家族繁殖タンクの大繁殖容器を使用すると、生成されているプロセスの制御および同期の卵より多数の生成を容易にした。自動化されたマイクロインジェクション装置7の改良版では、1時間以内に同一の細胞の段階でほぼ全て2,500個もの卵を注入することができる。これらの更新及び改良されたソフトウェアを使用してそれを読み出すなどの細菌増殖に大きな薬物スクリーニングを行うために使用することができ、以前可能であったよりも多くの卵を注入することが可能である。しかし、この方法は依然として注射、ベナードセルらにより記載され、例えば、他の注射経路を卵黄に限定される。 （2012）6、願わくは近い将来に自動化されたマイクロインジェクション装置に組み込まれます。 &lt;これらのメソッドは、ゼブラフィッシュをスクリーニングするためにベンチマークされていますが、Pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;、それは同様に他の魚種とするアプリケーションのために有用であろう。例えば、コイ、薬物スクリーニングのための利点を有することが示されている。ゼブラフィッシュのように、コイの卵や初期段階の胚は透明ますが、その大きな卵の卵の百何千もの大きさと、より一定の遺伝的背景16を提供する近交系の可用性の主な利点である。 感染した胚の大量の分析は、ハイスループット大粒フローサイトメーターを用いて行われる。このデバイスは、ソート、マルチウェルプレートまたは多数の化合物を試験するためには特に適してペトリ皿に胚を分析することができる。セットアップが技術サイトメーター大きな粒子流が予備スクリーニングするために使用し、続いて媒体を介して、サンプルを分析することができるような方法で適合されているよりも高い撮像分解能が必要な場合高い解像度で置く。これは、脊椎動物の自動スクリーニング技術17,18を用いて行うことができる。このデバイスは、自動的にマルチウェルプレートまたはバルクコンテナ、画像CLSMまたはステレオ顕微鏡法を用いて、毛細管を通して360度から2〜7日後に受精の間、ライブまたは固定胚を収集し、ベースの胚の手選別を可能2バルクコンテナに再処分することができます顕微鏡画像上。将来の改善は、CLSMで経時的に個々の胚を自動的多数をスクリーニングすることがことが可能となる、マルチウエルプレートに結像した後、胚の選別を可能にする。将来の用途において脊椎動物自動スクリーニング技術のシステムはまた、マルチウェルプレートに分配前の幼虫の技術を必要とせずにサイトメーター大きな粒子流に接続することができると仮定すると、より高度な並べ替えにつながる。 本論文では、確立ANを説明S.を研究するための高スループット·セットアップのD最適化表皮とM.創薬のためのモデルとしてmarinumの感染症。それは、卵黄に注入されたこれらの細菌の結果は、注射時の卵の発達段階に依存していることを示しています。 Mを注入する16-64細胞期の16から128細胞期またはM株のマリヌム E11が尾静脈注射2、6と同じ感染パターンにつながる。しかしながら、このセットアップでのみ細菌性病原体の増殖に限定されるものではない。それはロボットでそれぞれ13、過剰発現および遺伝子ノックダウン研究を形質転換するためのDNA、RNAまたはモルホリノを含有する溶液を注入することが可能であることが以前に示された。さらに、このセットアップはまた、癌細胞の増殖および遊走を研究するために有用であることが示された。したがって、このパイプラインは、コンテキスト内の信号の様々なメカニズムのハイスループットスクリーニングのための汎用的な方法を提示し自然免疫の、感染症および癌の開発に適用。これらの画面は、薬剤発見のための他のユーザーにも適用可能な薬剤の同定可能な毒性効果の分析と組み合わせることができる。

現在までにゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） が正常に感染症1の様々な研究する効率的なモデルとして確立されている。ゼブラフィッシュ胚は、その透明性及び蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック既存のレポーター株の多数のインビボイメージングの可能性に固有の提供。この強力な組み合わせは、 マイコバクテリウムmarinumの、M.最も近い相対などの病原体と相互作用しつつ、即座に別の免疫細胞タイプを追跡することを可能にする結核2、または表皮ブドウ球菌 、生体材料関連感染3-5の主な原因となる。感染の異なる経路は、試験6の目的に応じて、ゼブラフィッシュ胚において使用することができる。 これらの感染経路の一つは、細菌の卵黄注射である。他の人に比べてこの方法の主な利点は、卵黄infectiです上では有意に噴射時間を短縮し、感染7,8の高い再現性を可能にする、ロボット注射を介して自動的に行うことができる。 前作、Sの研究のための生体モデル系において 、高スループットなどのゼブラフィッシュを用いて、 表皮とM. marinumの感染は7,8成功したことを示した。このシステムは、初期胚の卵黄ロボット注射を介して疾患の進行をスクリーニングすることが可能であり、細菌負荷の尺度として蛍光読み出しを使用する。この概念と一致して、このセットアップでは、最適化され、均質に感染した胚を大量に生成し、多くの化合物で処理した後の時間の間、感染の進行を追跡する可能性を秘めた非常に効率的な高スループットパイプラインを確立した。確立された設定で、それは画面に8000同期胚まで発生させることができる病気の進行のために、時間あたり2,500胚まで、このように処理。胚は、感染した幼虫の均質なグループを確保し、自動化されたシステムを使用して、細菌の負荷に基づいて並べ替えられています。さらに、セットアップを検証するために、哺乳動物における結核の進行を防ぐために、既知の基準の影響は、M.に感染した胚でテストされていますマリヌム E11株以上の病原性のM株9。 本研究では、詳細に開発中に、化合物処理後に、感染した胚および細菌の進行のその後の分析を大量に生成することができるように確立されたハイスループット·パイプラインを記述する。

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H10 agar</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 broth</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td><td>211886</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td><td>L5542</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td><td>L3022</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td><td>16785.03</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td><td>25966.01</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td><td>P1754</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone40</td><td>Calbiochem, San Diego, California, USA</td><td>529504</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands</td><td>S103</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Instant ocean sea salt</td><td>Sera Marin, Heinsberg, Germany</td><td>5460</td><td></td></tr><tr><td>iSPAWN</td><td>Techniplast, Buguggiate, Italy</td><td>iSPAWN</td><td></td></tr><tr><td>Automated microinjection system</td><td>Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands</td><td>Automated microinjection system</td><td></td></tr><tr><td>Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL)</td><td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td><td>COPAS XL</td><td></td></tr><tr><td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td><td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td><td>VAST BioImager</td><td></td></tr><tr><td>LP Sampler</td><td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td><td>LP Sampler</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Injection needle 10 &amp;micro;m inner diameter</td><td>Qvotek, Mississauga, Canada</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery

ゼブラフィッシュは、ハイスループットスクリーニングの可能性と全体の動物モデルとして、創薬スクリーニングの前臨床段階での貴重なツールになりつつあります。彼らは、このようにして、還元、はるかに高価なげっ歯類モデルでのテストを通過する多数の化合物を初期段階での哺乳動物モデルにおけるインビボの検証における細胞ベースのアッセイの間のギャップを埋めるために使用することができる。この観点から、現在の原稿に表皮ブドウ球菌およびマイコバクテリウムmarinumの感染症の研究のためのin vivoモデル系としてゼブラフィッシュを使用して、新しい高スループットパイプラインを説明している。このセットアップでは、同期胚の多数の生成と解析が均一に感染したことができます。また、パイプラインの柔軟性により、ユーザは必要なときに容易に分析の分解能を改善するための他のプラットフォームを実装することができます。一緒に革新的な高スループットTEでゼブラフィッシュの組み合わせchnologiesために全動物モデルを用いての強度だけでなく、ために新規化合物の作用様式を解読するために使用することができる利用可能なトランスジェニック系統の多数だけでなく、新たな可能性への薬物検査と発見の分野を開く。

本結果は、高スループット·パイプラインはS.を研究することを示す表皮とM. marinumの感染は正常に確立されており、それは、他の感染モデルに拡張することができる。まず、Adatto らによって公開システムに基づいて大規模な飼育容器（ 図1A）、（2011）11の使用は、生成されているプロセスの高い制御を与える一つのイベントに同期の卵を大量に生成することができます。以前に開発された自動化されたマイクロインジェクションシステム7の改良版は、（ 図1A）を使用し、短時間で多数の胚を注入することができることが急ぎ。卵黄の感染のための最高の発達段階でロバ、Sと注射へ表皮とM. marinumのはキンメルらによって行われた説明によれば、1〜512細胞期の間のすべての異なる段階で実施した。（1995）12 </suP&gt;。 100 CFU Sに注射表皮は、16〜128細胞期の間の最良の感染パターン（ 図2）を得た。細菌は3日間、卵黄の中に増殖し、以降3解像度から体内に広がった。 256細胞期胚の体内に広がってほとんどの細菌と卵黄の中に、主に細菌の成長を示した後16細胞期の前に注射を行うことにより、4 DPI、および射出から高い死亡率につながった。細菌負荷の定量はベネマンらによって記載されるように、大きな粒子がフローサイトメーターを用いた蛍光強度分析により行った。（2013）8（ 図3）。 観測は30 CFU Mの注入のための最適な発達段階あることを示したマリヌム注入はE11株（ 図4A）のために、より毒性の強い男straiで16-64細胞期間16から128細胞期の間にあるN（ 図4B）。これらの段階で注入した胚は卵黄の中に細菌の増殖を示し、胚（ 図7）を介して細菌の広がり。早い段階での両株の感染は4 dpiの後に死ぬために胚をリードする非特異的な一般化された細菌の増殖を発表した。一方、後の段階で注入した胚で細菌量は卵黄に限定されていた。 次に、大きな粒子との事前ソート（ 図1B）フローサイトメーターは、非または高度感染した胚（ 図5A及び6A）を除いた、感染した魚を大量に均質なグループを生成した。事前ソートした後、M. marinumの感染した胚を、リファンピシン、最初のラインの抗結核薬で処理した。これまでの研究では、200μMの用量のリファンピシンによる治療が効果的にMを減少させることを実証しゼブラフィッシュ7、13 マリナム感染。 advantagを取っハイスループット設定で生成均質に感染した胚の大多数の電子は、異なる用量での処置を行った。 M.に感染した胚M marinumの株および12,24、および200μMリファンピシンで48時間処理は、用量依存的に（ 図5B）で効率的にマイコバクテリア感染を低減することが示された。この濃度は、将来の実験のために使用した200μMの用量でリファンピシンを用いて、感染の効率的な低減の点で好ましい。前の結果に沿って、Mを使用して細菌負荷の進行を研究マリヌム E11株を大幅に削減、24時間目以降200μMのリファンピシンで処理した後には、（ 図6B）が観察された。 高倍率撮影をこれらの胚が要求される場合にはさらに、それらは、サンプルが使用して分析することができ、そこから、96ウェルプレート（ 図1C）に自動的に表示することができる大きなパーティクルサンプラ脊椎動物自動スクリーニング技術システムは、CLSM上に実装。 大粒子サンプラー脊椎動物自動スクリーニング技術システムのいずれかCLSMや実体顕微鏡に取り付けることができるシステムです。このデバイスは、自動的にガラスキャピラリーを介して96ウェルプレートまたはバルク容器から、ライブまたは固定された胚のローディングを可能にし、所望の角度（ 例えば 、背側または横方向）でのカメラの前でそれを配向させる。すべての向きでの胚の画像は、オンボードカメラで、または外部CLSM（ 図7）を用いて行うことができる。胚はその後、収集されたか、廃棄物コンテナに転送されます。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> 図1。主流の実験OUTLINE。大によるA）成魚が卵を集め、アガロースプレートに整列して注入され、結合するように一緒に入れている。B）が注入された卵は28℃でインキュベートされ、可能な薬物治療のために事前にソートされます。C）その後の分析粒子は、フローサイトメーターおよび/ ​​またはCLSMと大きなパーティクルサンプラ/脊椎動物自動スクリーニング技術。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> 図2。S.のための最高の細胞期の確立表皮は、注射卵黄。ゼブラフィッシュ胚は、Sの100 cfuの1〜512細胞期までさまざまな発生段階の卵黄に注入した表皮ブドウ 。 1 Aとの間で注入された胚ND 8細胞期は4解像度から卵黄と高い死亡率で細菌の増殖を示した。 16および128細胞期の間に注入胚は卵黄中の3 dpiで始まる体内に細菌の増殖を示した。 256および512細胞期の間に注入胚は卵黄の中に多くの細菌の増殖を示した。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> 図3サイトメーター大きな粒子流を用いて細菌負荷の定量 S.の100のcfu 表皮は、ゼブラフィッシュ胚の卵黄に注入した。A）5解像度まで、毎日、10胚のグループが2つの生物学的レプリカ（エラーバーに基づいて平均指数関数的な成長を見せ、均質化し、直接播種した分析サイトメーター= SEM）。B）大粒子流は、非注入し、S.からの平均蛍光シグナルを示してい表皮は、胚を注入した。条件あたり30から160胚（エラーバー= SEM）を分析した、異なる文字はTukeyの事後検定（P &lt;0.001）、NSが続く一方向ANOVAによって統計的有意差を示す：CFUの間には有意ではない差異C）の相関をと10 S.の群の平均蛍光シグナル表皮は、胚（エラーバー= SEM）を感染させた。この図は、ベネマンらから変更されている。（2013年）8。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> 図4。EstablisM.のための最高の細胞期のhment マリヌム卵黄注入。ゼブラフィッシュ胚がMの30 cfuの1〜512細胞期までのすべての異なる発生段階で注入したmarinumの E11およびM株はA、B）は、胚を示した8細胞期から注入同様の拡散及びそれらが注入されながらE11株は肉芽腫および全身性感染症の形成を示した両方の株による死亡率は、A）胚は、16〜128細胞期の間に注入256から512細胞期は、卵黄に細菌負荷を保った。B）の胚が128〜512細胞期から注入されたものは、卵黄に細菌負荷を保ちながら、様構造肉芽腫および全身感染症の形成を示し、M株と16-64細胞期の間に注入。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo：SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; /&gt;：FOコンテンツ幅= &quot;5インチ&quot; 図5。M.の治療ファーストラインの抗結核薬とマリヌム急性感染。胚はMの30 cfuの16-64細胞期の間に注入マリヌム M株は両群で、個々の胚の非および/ ​​または高度に感染した胚。A）の蛍光を捨てた後2つのグループにソートする3 dpiでフローサイトメーター大きな粒子を介して実行された。B）の胚は、リファンピシン（RIFで処理）12、24の用量で48時間、および200μMのは4 dpiで分析した。その細菌負荷が大幅に。C）代表COPASの12の用量でDMSOおよびリファンピシンで処理された胚のプロファイル、24、および24時間200μmで還元される。細菌負荷および分布は、赤いピークで表示されます。青い線は、ゼブラフィッシュの電子DPF要素替え（4のプロファイルを表すmbryo）COPASによる。条件あたり60〜90の胚を分析した。各データポイントは、個々の胚を表す。値は平均±SEMとして示されている。 NS：有意ではない差異。差異の統計的有意性の解析は、ANOVAはTukeyの事後検定に続く1の方法により実施した。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> 図6。M.の治療最初の行の抗結核薬とマリヌム慢性感染症。胚はMの30 cfuの16-64細胞期の間に注入マリヌム E11株は大きな粒子非および/ ​​または高度に感染した胚を破棄した後に2つのグループにソートされている3 dpiでフローサイトメーターに通した。<html> A）両群における個々の胚の蛍光。B）4日間、200μMのリファンピシン（RIF）で処理された胚は、治療の1日後の細菌負荷の大幅な減少を示して分析した。条件ごとに90の胚を分析した。値は平均±SEMとして示されている。異なる文字は、同じ治療の時点の間に有意な差を示す。 *対照群との有意差を示している。 NS：有意ではない差異。差の統計的有意性の分析は、ANOVAはチューキーの事後検定に続く片道により行った。 （P &lt;0.05）。図B）はSpaink らから変更されている。（2013）13。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> hres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; 図7。M.の結果マリヌム E11卵黄注入は、脊椎動物の自動スクリーニング技術とCLSMを使用して画像化した。Mの5解像度FLI1-EGFP 14胚。A）ライブ胚を示す増殖の共焦点Zスタック（ステッチ3画像）体全体マリヌム E11菌（赤）。B）は、M. を示す5 dpiのFLI-EGFP胚を修正しました体全体マリヌム E11菌（赤）白血球のL-プラスチンが15を免疫染色によって検出された（水色）との共局在化する。

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Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

このビデオの記事は正常に全動物脊椎動物生物を用いた化合物の試験と創薬のための新しい強力なツールを提供するゼブラフィッシュ胚を大量に感染し、分析するために確立されたハイスループット·パイプラインについて説明します。

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化<em&gt;表皮ブドウ球菌</em&gt;と<em&gt;マイコバクテリウムmarinumの</em創薬のためのモデルとして&gt;感染症

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

13.1K ビュー.  Leiden University. このビデオの記事は正常に全動物脊椎動物生物を用いた化合物の試験と創薬のための新しい強力なツールを提供するゼブラフィッシュ胚を大量に感染し、分析するために確立されたハイスループット·パイプラインについて説明します。 

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Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria survive these stressful conditions. The hypothesis behind this method is new: stress activation of biochemical pathways, which are targets of antibiotics, can accelerate antibiotic susceptibility testing. As compared to standard antibiotic susceptibility testing methods, the rate-limiting step -&#160;bacterial growth -&#160;is omitted during antibiotic application. The technical implementation of the method is in a combination of standard techniques and innovative approaches. The standard parts of the method include bacterial culture protocols, defining microfluidic channels in polydimethylsiloxane&#160;(PDMS), cell viability monitoring with fluorescence, and batch image processing for bacteria counting. Innovative parts of the method are in the use of culture media flow for mechanical stress application, use of enzymes to damage but not kill the bacteria, and use of microarray substrates for bacterial attachment. The developed platform can be used in antibiotic and nonantibiotic related drug development and testing. As compared to the standard bacterial suspension experiments, the effect of the drug can be turned on and off repeatedly over controlled time periods. Repetitive observation of the same bacterial population is possible over the course of the same experiment.

We have developed a microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria can survive these stressful conditions.

チップ上でのストレス誘発抗生物質感受性試験

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

生物工学

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

免疫・感染学

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery research less attractive. Antimicrobial drug discovery and subsequent commercialization can be made more lucrative if a fail-fast-and-fail-cheap approach can be implemented within the lead optimization stages where researchers have greater control over drug design and formulation. In this article, the setup of an ex vivo ovine wounded skin model infected with Staphylococcus aureus&#160;is described, which is simple, cost-effective, high throughput, and reproducible. The bacterial physiology in the model mimics that during infection as bacterial proliferation is dependent on the pathogen&#39;s ability to damage the tissue. The establishment of wound infection is verified by an increase in viable bacterial counts compared to the inoculum. This model can be used as a platform to test the efficacy of emerging antimicrobials in the lead optimization stage. It can be contended that the availability of this model will provide researchers developing antimicrobials with a fail-fast-and-fail-cheap model, which will help increase success rates in subsequent animal trials. The model will also facilitate the reduction and refinement of animal use for research and ultimately enable faster and more cost-effective translation of novel antimicrobials for skin and soft tissue infections to the clinic.

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

The protocol describes a step-by-step method to set up an ex vivo ovine wounded skin model infected with Staphylococcus aureus. This high-throughput model better simulates infections in vivo compared with conventional microbiology techniques and presents researchers with a physiologically relevant platform to test the efficacy of emerging antimicrobials.

新しい抗生物質をテストするための新しいハイスループット Ex Vivo ヒツジ皮膚創傷モデル

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

<meta charset="utf8"></head><body>デュアルレポーターを用いた Mycobacterium abscessus のハイスループットスクリーニングアッセイ

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト: M. abscessus 治療の効率的な発見のためのスケーラブルな薬物スクリーニングプロトコル

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

マイコバクテリアに対するハイスループット薬物スクリーニングのためのアッセイ開発

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化

要約

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チップ上でのストレス誘発抗生物質感受性試験

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性

新しい抗生物質をテストするための新しいハイスループット Ex Vivo ヒツジ皮膚創傷モデル

マイコバクテリアに対するハイスループット薬物スクリーニングのためのアッセイ開発

マイコバクテリアに対するハイスループット薬物スクリーニングのためのアッセイ開発

マイコバクテリアに対するハイスループット薬物スクリーニングのためのアッセイ開発