Il significato di questo metodo è che consente ai microtubuli privi di etichetta di essere ripresi contemporaneamente a proteine marcate fluorescentemente a frame rate elevati. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua facile implementazione e le esigenze minime sui componenti ottici. Elude anche la necessità di etichettatura fluoro-4 dei microtubuli.
Per iniziare, preparare il polimero PDMS combinando l'agente polimerizzante e l'elastomero di base in un rapporto di massa 1:10. Mescolarli per due minuti e poi degasare la miscela in una camera a vuoto fino a quando tutte le bolle scompaiono. Successivamente, versare il composto sullo stampo principale in uno strato di circa 0,5 centimetri di spessore, avendo cura di evitare di creare bolle, e cuocere il composto in forno preriscaldato a 70 gradi Celsius per 40 minuti.
Quindi, ritagliare le regioni strutturate del polimero e perforare i fori a ciascuna estremità del canale utilizzando un punzonatore PDMS. Successivamente, pulire il lato strutturato del blocco PDMS. Successivamente, risciacquare tre volte con isopropanolo e metanolo seguito da acqua ultrapura e asciugare la superficie.
Successivamente, il plasma pulisce il PDMS utilizzando ossigeno o plasma d'aria e posiziona il PDMS pulito al plasma su un vetro di copertura opportunamente pulito. Riscaldare una piastra calda a 80 gradi Celsius per 15 minuti. Inserire tubi in polietilene a bassa densità di dimensioni appropriate nei fori e collegare il tubo di uscita a una siringa da 0,5 millilitri.
Quindi, far fluire le soluzioni nei microcanali immergendo il tubo di ingresso nella soluzione e disegnando il volume richiesto con la siringa. Posizionare il campione sul palco del microscopio e accendere la sorgente luminosa epi-illuminazione per l'imaging IRM. Per mettere a fuoco il microscopio, cercare il piano focale corretto vicino all'interfaccia della soluzione PDMS e scegliere un campo visivo vicino al centro del canale.
Quindi, preparare una soluzione 0,1-micromolare di microsfere fluorescenti in BRB80 e fluire in almeno un volume di canale della soluzione di microsfere. Monitorare la reazione tramite IRM o TIRF. Quando viene raggiunta la densità desiderata delle microsfere, lavare via l'eccesso con BRB80.
Flusso di semi diluiti nella camera di reazione e monitoraggio della reazione attraverso IRM. Quando viene raggiunta la densità desiderata dei semi, lavare via l'eccesso con BRB80. Quindi, preparare una miscela di estensione di microtubuli contenente tubulina non etichettata 12 micromolari, GTP monomillolare, DTT a cinque millimolari in tampone BRB80.
Quindi, fluire in almeno un volume di canale della miscela di estensione, assicurando al contempo che la temperatura di reazione sia di 28 gradi Celsius. Per iniziare, impostare le impostazioni di imaging sul software del microscopio. Avviare l'imaging e far fluire la soluzione di kinesina nella camera.
Quindi, visualizza i microtubuli non svezzanti di kinesin 1 marcati GFP. Al termine della misurazione, registra un breve video in cui il palco viene lentamente tradotto in un movimento circolare o laterale. La proiezione mediana di questo video servirà come immagine di sfondo e verrà sottratta dalle misurazioni grezze.
Creare una proiezione mediana in ImageJ dalla registrazione di sfondo facendo clic su Immagine. Quindi, selezionare l'opzione Stack e fare clic su Z Project. Quindi, sottrarre la proiezione di sfondo mediana dai dati dell'immagine grezza facendo clic su Elabora e quindi selezionare l'opzione Calcolatrice immagini assicurandosi di controllare l'opzione del risultato float a 32 bit.
Per la registrazione delle immagini, scegliere una raccolta di microsfere vicino al microtubulo di interesse e utilizzarle per allineare le immagini TIRF e IRM. Per ogni tallone di questa raccolta, utilizzare lo strumento di selezione multipunto per contrassegnare la posizione approssimativa nel canale TIRF e quindi la posizione corrispondente nel canale IRM. Quindi, eseguire la macro ImageJ fornita.
Le microsfere appaiono come macchie scure nel canale IRM a destra e come punti luminosi nel canale TIRF a sinistra. La procedura di allineamento sovrappone correttamente i due canali localizzando una selezione di perline. Utilizzando questo protocollo è stato ottenuto anche un kymograph di molecole di kinesina marcate con EGFP che camminano verso le estremità restringenti dei microtubuli.
Quando si esegue questa procedura, è importante scegliere obiettivi ad alta apertura numerica per ottenere una riflessione interna totale e anche per massimizzare l'efficienza della raccolta e il contrasto dell'immagine. Questo metodo può essere utilizzato per l'imaging ad alta risoluzione di singole molecole fluorescenti contemporaneamente all'interno della struttura macromolecolare abbastanza massiccia da essere visualizzata da IRM, come la membrana cellulare o il filamento di actina. Questo protocollo fornisce anche una procedura facilmente adattabile per l'imaging simultaneo con qualsiasi combinazione di IRM, TIRF ed epifluorescenza.
