L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare i metodi di dissezione per la gamba adulta di Drosophila. Questa tecnica rimuove una porzione della cuticola, esponendo il tessuto sottostante in un modo che preserva l'architettura neuronale e muscolare. Questa procedura ci consente di caratterizzare la giunzione neuromuscolare per i pergolati del motoneurone identificati, utilizzando tecniche chimiche immunocitiche standard.
La dissezione è particolarmente utile per lo studio di cambiamenti degenerativi lenti che si verificano in periodi di tempo relativamente lunghi. L'aspetto temporale è una considerazione importante, perché la giunzione neuromuscolare ben caratterizzata delle larve di Drosophila è stabile per circa cinque-sette giorni prima dell'inizio della metamorfosi. Al contrario, i neuroni adulti sono presenti per tutta la vita di una mosca adulta, circa 90 giorni per una Drosophila melanogaster di tipo selvatico, allevata in laboratorio.
La tecnica è flessibile e può essere applicata a una gamma di genotipi per diversi modelli di malattia e utilizzare una gamma di anticorpi disponibili per Drosophila come sistema modello. L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare i metodi di dissezione per la gamba adulta di Drosophila. Questa tecnica rimuove una porzione della cuticola, esponendo il tessuto sottostante in un modo che preserva l'architettura neuronale e muscolare.
Usando un pennello, trasferire le mosche al metanolo freddo in un pozzetto di vetro o in un piatto per circa 30 secondi a un minuto. Il metanolo solubilizza gli idrocarburi cuticolari e le mosche possono ora essere immerse piuttosto che galleggiare in soluzioni acquose. Con la pinza, trasferire con attenzione le mosche a PBS.
Risciacquare tre volte in PBS ghiacciato per rimuovere il metanolo in eccesso e mantenere le mosche in PBS sul ghiaccio fino alla dissezione e alla fissazione. A questo punto, le mosche dovrebbero essere sezionate e fissate nel più breve tempo possibile, preferibilmente meno di 30 minuti. Trasferisci le mosche su una piastra di dissezione in elastomero siliconico riempita con PBS freddo.
Rimuovere le zampe metatoraciche alla coxa usando due paia di pinze Dumont numero cinque, o tagliare le gambe con le forbici Vannas. Trasferire le gambe in un pozzo in una piastra di plastica, 24 pozzetti riempita con un mil di PBS e mantenere la piastra sul ghiaccio fino a quando tutte le gambe non vengono rimosse e trasferite nei pozzetti. In genere usiamo 20 gambe per pozzetto.
Sostituire la soluzione PBS con una soluzione FA da un millilitro e ruotare su un nutatore per 30 minuti. L'impostazione del nutatore deve essere impostata a una velocità media. Assicurarsi che le gambe siano completamente immerse nella soluzione durante questo periodo.
Per rimuovere la soluzione FA, lavare in un mil PBS tre volte rapidamente, seguito da altri tre lavaggi per cinque minuti ciascuno in un mil PBS. Tenere i tessuti in un mil PBS sul ghiaccio, prima e durante le fasi di dissezione. Per fornire una breve panoramica dell'anatomia della gamba di Drosophila, sono indicati i segmenti delle gambe, tra cui la coxa, il trocantere, il femore, la tibia e cinque segmenti tarsali.
Qui vediamo una vista anteriore della gamba, riconosciuta dalla presenza di setole sensoriali in contrasto con la cuticola nuda presente sul lato posteriore. Sono indicati anche l'orientamento dell'asse prossimale-distale e dell'asse dorsale-ventrale. Questa procedura di dissezione rimuove un piccolo pezzo di cuticola dal femore prossimale, in modo che possano essere studiati i pergole assonali, che proiettano dorsalmente, innervando il muscolo elevatore della tibia.
Il nostro lavoro precedente si è concentrato sul pergolato indicato, originato da presunti lignaggio oculare dei neuroblasti. In questa parte della procedura, rimuoviamo la cuticola dal lato anteriore del femore. Le pinze di dissezione sono fondamentali per il successo e abbiamo scoperto che l'introduzione di una leggera curva alla fine della pinza super fine numero cinque fornisce una smussatura che consente alla cuticola di essere afferrata superficialmente, piuttosto che essere colpita, il che può rovinare il tessuto.
Trasferire le gambe su un piatto in elastomero siliconico in PBS per la dissezione. Utilizzando un paio di pinze, fissare il segmento della tibia al piatto in elastomero siliconico come mostrato qui sul lato destro. Usando l'altra pinza tenuta smussata verso il basso, afferrare un pezzo di cuticola sull'estremità distale del femore e tirare nella direzione prossimale verso il trocantere.
Continuare a rimuovere metodicamente la cuticola fino a quando il muscolo nudo è visibile in tutta l'estremità prossimale del femore. Una volta sezionate tutte le gambe, sostituire PBS con soluzione FA per postfiggere le gambe per 30 minuti con agitazione su un nutatore a media velocità. Successivamente, lavare i campioni in un mil PBS per tre volte più velocemente, e poi tre volte per cinque minuti ciascuno in soluzione PBT.
Per bloccare i tessuti, sostituire un mil PBT con una soluzione bloccante costituita da un mil 5% di siero di capra normale diluito in PBT. Incubare le gambe sezionate per quattro ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Rimuovere la soluzione bloccante e sostituirla con un anticorpo primario che viene diluito in soluzione bloccante.
Qui, stiamo usando dischi anti grandi a una diluizione da uno a 200. Rimettere le piastre su uno shaker e incubare a quattro gradi durante la notte. Dopo l'incubazione degli anticorpi primari, lavare gli anticorpi primari in un mil PBT per tre volte brevemente e poi tre volte per 15 minuti ciascuno.
Blocca di nuovo i tessuti in un mulino al 5% di siero di capra normale per almeno due ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere 300 microlitri degli opportuni anticorpi secondari coniugati fluorescenti diluiti appropriati. Inoltre, aggiungere uno a 2000 diluizione di fluorescenza coniugata falloidina per etichettare il muscolo.
Per incubare, sigillare i pozzetti con nastro sigillante da laboratorio e coperchio. Inoltre, avvolgere le piastre in un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori dalla luce. Incubare per sei-otto ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius.
Per rimuovere gli anticorpi secondari non legati, eseguire lavaggi con PBT in modo simile descritto in precedenza durante il lavaggio dell'anticorpo primario. Dopo questo passaggio, i campioni sono ora pronti per essere montati e ripresi. Disporre le gambe anteriormente verso l'alto e coprire con supporti di montaggio aggiuntivi, se necessario.
Raschiare delicatamente gli angoli di una copertura scivolare su una palla di argilla. L'argilla risultante fungerà da distanziatore tra la diapositiva e lo scivolo di copertura, in modo che i tessuti non vengano schiacciati. Premere verso il basso sul coperchio scivolare fino a quando non tocca la parte superiore delle gambe.
Sigillare i bordi con lo smalto e conservare a quattro gradi fino all'imaging. Immagine al microscopio confocale utilizzando i parametri di imaging descritti nella sezione quattro del protocollo scritto. Per aiutare a convalidare il protocollo di dissezione, abbiamo prima le gambe dell'immagine per microscopia a contrasto di fase a basso ingrandimento.
Ecco un esempio sul pannello A di una buona dissezione a sinistra e una cattiva dissezione a destra in cui le fibre muscolari sono state interrotte. Il pannello C mostra un'immagine confocale di una buona dissezione in cui il muscolo non è stato interrotto. Al contrario, il pannello D mostra una gamba danneggiata durante la dissezione, in cui mancano le fibre muscolari, come indicato dalla freccia.
Qui, abbiamo colorato una ripresa delle gambe con perossidasi anti rafano per rilevare i processi neuronali, mostrata qui in verde, anti dischi grandi, che facilita il raggruppamento del recettore postsinaptico del glutammato, mostrato in rosso, e falloidina per etichettare il muscolo, mostrato in blu. Se catturato con ingrandimento 20X con un canale di luce trasmessa, è facile vedere l'area sezionata. Si noti che gli anticorpi penetrano parzialmente in aree non sezionate e possono essere visti attraverso la cuticola come indicato dalla freccia bianca.
Ciascuno dei motoneuroni delle gambe fa proiezioni stereotipate quando innerva il muscolo. Il nostro lavoro si concentra sui motoneuroni che innervano il muscolo elevatore della tibia, mostrati qui come la regione inscatolata e indicati dalla freccia bianca. A un ingrandimento più elevato 60X con zoom 2X in alto a destra, possiamo effettivamente visualizzare i bouton, mostrati in verde, e il DLG circostante mostrato in rosso.
Aumentare ulteriormente lo zoom, o passare a un obiettivo 100X, consente la quantificazione delle dimensioni e della morfologia del bouton come mostrato in basso a destra. Usando questa tecnica di dissezione combinata con l'immunocitochimica, abbiamo scoperto che c'è gonfiore del bouton H-dipendente in un modello mutante di SLA sod1, mostrato qui nelle zampe H71Y invecchiate, rispetto ai controlli di tipo selvaggio come indicato dalle frecce. Le dimensioni di Bouton sono quantificate nella trama dello sciame di api a destra.
Abbiamo inoltre trovato una riduzione del marcatore della zona attiva Bruchpilot, mostrato in rosso, all'interno di assoni HRP debolmente macchiati, mostrati in verde, dei mutanti H71Y. Per studiare la neurodegenerazione, gli aggregati proteici ubiquitinati sono spesso rilevati dall'anticorpo FK2, e mostrati qui come puncta FK2-positivi, negli assoni e nei muscoli delle mosche H71 della zolla invecchiata sul lato destro, indicato dalle frecce. Infine, i mitocondri possono essere visualizzati mediante immunocitochimica utilizzando un anticorpo monoclonale anti ATP5a, come mostrato qui in rosso all'interno del muscolo elevatore della tibia.
Abbiamo scoperto che i mitocondri si ingrandiscono con l'età nei mutanti H71Y. Una volta padroneggiata, la preparazione delle gambe sezionate e la colorazione anticorpale associata ti permetteranno di analizzare i cambiamenti molecolari nella giunzione neuromuscolare adulta per il tuo mutante preferito in vari punti temporali.
