Questo semplice protocollo consente di etichettare i veicoli elettrici e monitorarli tramite microscopia confocale. Ad esempio, l'imaging EV potrebbe aiutare a valutare la distribuzione EV quando lo si utilizza in terapia. Questa tecnica consente di monitorare facilmente la migrazione e l'assorbimento dei veicoli elettrici negli espianti di cartilagine, con microscopia confocale senza alcuna funzione speciale.
Lo stesso protocollo può essere utilizzato per i veicoli elettrici per esperimenti in vitro o in vivo. Assicurarsi che le colonne siano preparate in anticipo e che il volume iniziale di EV sia sufficiente per raggiungere la concentrazione finale di particelle desiderata, considerando che circa il 10% delle particelle andrà perso durante la fase di purificazione. Inizia concentrando la vescicola extracellulare, o EV, campione e il controllo.
Posizionare i campioni in un tubo di concentrazione da 15 millilitri o 500 microlitri, a seconda del volume iniziale del campione EV. Centrifugare i tubi secondo le istruzioni del produttore fino ad ottenere un campione quasi asciutto. Sospendere nuovamente i campioni EV concentrati con 200 microlitri e il gruppo di controllo con 100 microlitri di diluente C e trasferirli in nuovi tubi centrifughi da 1,5 millilitri.
Separare il campione EV in due aliquote da 100 microlitri ciascuna. Contrassegnare una delle aliquote con il colorante e usarlo come trattamento. Lascia l'altro non contrassegnato, ma elaboralo come il campione EV e usalo per quantificare la concentrazione ev mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle.
Preparare una soluzione colorante 2x in modo tale che la concentrazione risultante della soluzione di PKH26 nel diluente C sia di otto micromolari. Mescolare un microlitro di un linker PKH26 millimolare per 125 microlitri di diluente C nel campione. Preparare il volume necessario da aggiungere ai campioni in un rapporto 1:1.
Aggiungere 2x soluzione colorante ai veicoli elettrici derivati dal lisato piastrinico PKH e controllare i campioni in un rapporto 1:1, per ottenere una concentrazione di colorante 1x e quattro concentrazioni micromolari di PKH26. Aggiungere lo stesso volume di PBS al campione EV derivato dal lisato piastrinico NTA. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Aggiungere la soluzione di albumina-PBS sierica bovina al 5% ai campioni in un rapporto 1:1 e assicurarsi che il volume finale sia di circa 400 microlitri. Procedere alla separazione dei veicoli elettrici etichettati dal colorante non legato e dalle interazioni del colorante non specifiche con la colonna. Rimuovere il cappuccio dalla colonna, aggiungere 400 microlitri di ev derivati dal lisato piastrinico PKH, veicoli elettrici derivati dal lisato piastrinico NTA o controllare ed eliminare tutto il liquido eluito.
Attendere che l'esempio entri completamente nella colonna prima di procedere al passaggio successivo. Aggiungere 600 microlitri di PBS ed eliminare tutto il liquido eluito. Attendere che il PBS entri completamente nella colonna prima di procedere al passaggio successivo.
Aggiungere 600 microlitri di PBS e raccogliere una frazione di 600 microlitri in un tubo centrifugo da 1,5 millilitri. Per una nuova colonna, ripetere i passaggi che coinvolgono la concentrazione dei campioni menzionati all'inizio del protocollo. Aggiungere 600 microlitri di veicoli elettrici precedentemente eluiti alla colonna ed eliminare il volume eluito.
Quindi aggiungere 400 microlitri di PBS ed eliminare tutti i volumi eluiti. Aggiungere 600 microlitri di PBS alla colonna e raccogliere una frazione di 600 microlitri in un tubo centrifugo da 1,5 millilitri. Lavare la cartilagine due volte con PBS e asportare con un pugno bioptico di tre millimetri di diametro in condizioni sterili.
Posizionare gli espianti in piastre di coltura a 96 pozzetti con mezzo DMEM-F12, integrato con 1% di penicillina streptomicina a 37 gradi Celsius, 5% CO2 e 80% di umidità. Per stabilire un modello di OA guidato dall'infiammazione, integrare il terreno di coltura cellulare con 10 nanogrammi per millilitro di oncostatina M e due nanogrammi per millilitro di fattore di necrosi tumorale-alfa. Trattare gli espianti con 1 volte 10 alla 9a particella per pozzetto di EV derivati dal lisato piastrinico PKH, o controllo, in terreno di coltura cellulare integrato con oncostatina M e fattore di necrosi tumorale-alfa.
Rimuovere il mezzo dalle piastre di coltura cellulare a 96 pozzetti contenenti espianti di cartilagine. Aggiungere 200 microlitri del terreno di coltura cellulare a ciascun pozzo come descritto nel manoscritto. Interrompere il test in vitro ogni ora da zero a cinque ore.
Lavare i pozzetti di coltura cellulare contenenti gli espianti di cartilagine due volte con 200 microlitri di PBS. Aggiungere 100 microlitri di paraformaldeide al 4% al tessuto per fissarlo per tre ore a quattro gradi Celsius. Rimuovere il PFA, aggiungere 100 microlitri di PBS, conservare il tessuto fisso a quattro gradi Celsius ed elaborare i campioni entro 48 ore.
Le immagini scattate in diversi punti temporali mostrano come gli EV entrano nel tessuto fino a raggiungere i condrociti ed entrano nei condrociti nel tempo. I veicoli elettrici etichettati erano già localizzati intorno ai condrociti dopo un'ora di incubazione. Assicurarsi che il volume iniziale di veicoli elettrici sia sufficiente per raggiungere la concentrazione finale di particelle desiderata.
Un'altra cosa importante da ricordare è quella di utilizzare i veicoli elettrici etichettati entro le prossime 24 ore. Se non lo si utilizza entro 24 ore, può verificarsi una diminuzione della fluorescenza. Questa tecnica aiuterà i ricercatori a migliorare l'imaging EV e a studiare i veicoli elettrici in biologia e terapia.
