Questo protocollo fornisce un metodo semplice, rapido e riproducibile per indurre una lesione cerebrale traumatica da forza contundente scalabile nel pesce zebra adulto. Il pesce zebra adulto che subisce questa lesione cerebrale traumatica da forza contundente mostra molte delle caratteristiche osservate negli esseri umani che soffrono di un TBI a forza contundente. A dimostrare la procedura saranno james hentig e kaylee cloghessy, due dottorandi del mio laboratorio.
Inizia riempiendo una capsula di Petri con argilla modellante. Quindi utilizzare le dita o il dorso di un paio di pinze per creare una piattaforma rialzata con argilla di modellazione aggiuntiva. Dividere la piattaforma rialzata longitudinalmente in due metà approssimativamente uguali usando una lama di rasoio.
Formare le due metà in un canale, in modo tale che accolga la lunghezza di un pesce adulto. Usa argilla aggiuntiva per costruire pareti per fissare 2/3 del corpo del pesce con la testa esposta. Modellare un piccolo supporto nella regione della testa esposta perpendicolare alle pareti per evitare la rotazione o il rinculo della testa in caso di lesioni.
Assicurarsi che i lati del canale non ostacolino la perdita di peso. Utilizzare un mini foro per creare un disco in acciaio da 3 millimetri da un lampeggiante in acciaio calibro 22. Posiziona un pesce anestetizzato che non risponde al pizzico di coda sullo stampo di argilla all'interno del canale con il suo lato dorsale verso l'alto in modo che il suo corpo sia fissato sui lati.
Posizionare il disco in acciaio calibro 22 millimetri sulla testa, centrato sul punto di impatto desiderato. Allineare il pesce perpendicolarmente per evitare che la sua testa si inclinasse su un lato, il che potrebbe causare un impatto irregolare. Utilizzare un supporto ad anello standard e un morsetto per il braccio per fissare il tubo di acciaio o plastica, assicurandosi che sia dritto, in modo che il fondo del tubo sia 1,5 centimetri sopra la testa del pesce zebra.
Guarda in basso il tubo per assicurarti che sia allineato sopra la piastra di acciaio. Scegliere il cuscinetto a sfere appropriato in base alla gravità desiderata della lesione. Far cadere il cuscinetto a sfere da un'altezza predeterminata lungo il tubo sulla piastra di acciaio.
Quindi posizionare il pesce ferito nella vasca di recupero da monitorare. Riempi una capsula di Petri con argilla modellante e crea una piccola cavità per sostenere il corpo durante la dissezione. Posizionare il pesce nello stampo di argilla con il lato dorsale verso l'alto.
Posizionare due perni di dissezione, uno attraverso la linea mediana a metà del corpo e l'altro a circa 5 millimetri dietro la base della testa. Utilizzare un paio di 5 pinze Dumont per tagliare senza mezzi termini il nervo ottico e rimuovere gli occhi. Posizionare un'estremità delle 5 pinze sotto la piastra parietale destra.
Fai un'azione deliberata a forbice muovendoti verso l'estremità rostrale e rimuovi la piastra frontale destra. Quindi ruotare il pesce di 90 gradi in senso orario. Posizionare un'estremità delle 5 pinze sotto la piastra parietale sinistra e utilizzare lo stesso movimento della forbice per rimuovere le placche parietali e frontali sinistre, esponendo l'intero aspetto dorsale del cervello.
Utilizzare la pinza 5 per transecare senza mezzi termini la mascella in modo tale che i bulbi olfattivi siano conservati e non danneggiati. Usando la stessa pinza, rimuovere l'opercolo destro, il preopercolo, l'interopercolo e il sottoopercolo. Quindi resecare senza mezzi termini la muscolatura all'estremità caudale del calvario per esporre il midollo spinale.
Usando la pinza, transettare senza mezzi termini il midollo spinale. Posizionare accuratamente la pinza sotto il cervello e rimuovere delicatamente il cervello dal calvario. Seziona l'intero cervello o la regione di interesse usando le istruzioni nel manoscritto del testo e posiziona immediatamente il cervello su una piccola barca di pesatura usando una pinza fine, facendo attenzione a non pugnalare o raschiare il cervello.
Trasferire il cervello alla barca di pesatura asfaltata e registrare il peso bagnato del cervello. Orienta i cervelli per appoggiarli sulla barca con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Quindi posizionare il cervello e la barca di essiccazione in un forno di ibridazione impostato a 60 gradi Celsius per otto ore.
Per trasferire il cervello su una nuova piccola barca di pesatura catramata una volta che è asciutta, pizzicare insieme la pinza fine e, partendo dal lato ventrale del cervello, raccogliere in un movimento verso l'alto. Fai un'incisione parziale su una spugna bagnata. Metti un pesce alla volta nell'apertura con il lato ventrale verso l'alto e usa un ago calibro 30 per iniettare circa 40 microlitri di EdU da 10 millimolari nel corpo del pesce.
Quindi riportare il pesce al serbatoio di contenimento pieno di acqua di sistema. Raccogli i cervelli come accennato in precedenza e mettili come gruppo in una fiala di vetro da 9 millilitri contenente 2 millilitri di nove parti di etanolo al 100% a una parte di formaldeide al 37%. Fissa il cervello a 4 gradi Celsius su una piattaforma a bilanciere.
Utilizzare un mandrino criostato per incorporare il cervello in TFM nell'orientamento desiderato sul ghiaccio secco. La lesione vascolare è risultata essere una delle patologie più facili e importanti per identificare le lesioni di successo tramite questo modello. La capacità di identificare l'indicatore è cambiata con il ceppo di pesce utilizzato durante l'infortunio.
L'identificazione della lesione vascolare nel wild type AB era difficile da distinguere tra TBI lieve o moderata e pesci di controllo non danneggiati a causa della pigmentazione. Dopo l'infortunio, il pesce TBI lieve ha mostrato abrasioni superficiali minime, mentre il pesce TBI moderato ha mostrato un'emorragia cerebrale limitata. L'entità della lesione era evidente nei pesci tbi gravi.
Al contrario, la lesione vascolare può essere facilmente identificata quando si utilizza pesce albino o Casper. Il gonfiore del cervello a causa di lesioni è stato valutato utilizzando edema. Al contrario, sia il TBI moderato che il TBI grave avevano edema significativo, 1 dpi e 3 dpi, ma il contenuto di liquidi sia di TBI moderato che di TBI grave è tornato a livelli simili a controlli non danneggiati di 5 dpi.
Questa lesione da forza contundente ha provocato una robusta risposta alla proliferazione cellulare che attraversa il neuroassi. Un aumento dell'etichettatura EdU è stato osservato nelle zone ventricolari e subventricolari del proencefalo rispetto ai controlli non danneggiati. I cervelli feriti hanno mostrato un aumento dell'etichettatura EdU nella zona grigia periventricolare, nei lobi ottici tettoli e negli aspetti dell'ipotalamo anteriore rispetto al cervello di pesce non danneggiato.
A seguito di grave TBI, le regioni neurogeniche nel cervello posteriore hanno mostrato un aumento della proliferazione cellulare rispetto al cervello non danneggiato. Per una corretta induzione della lesione, assicurarsi che i pesci siano fissati e stabili nello stampo e che il tubo sia dritto per evitare l'impatto fuori centro o alterare la traiettoria di caduta del peso. Questa procedura fornisce un metodo di induzione della lesione da forza contundente rapido ed economico applicato a un modello rigenerativo che sarebbe particolarmente applicabile per traumi cranici ripetuti o studi rigenerativi indotti da lesioni.
