Questo approccio può essere utilizzato in modelli di sistemi cellulari di stress del reticolo endoplasmatico manipolando l'espressione molecolare dei componenti della coppia a valle. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di rimuovere l'impatto della segnalazione accoppiata mediante la visualizzazione e la misurazione dei percorsi neurali. Questo metodo può contribuire a comprendere le basi molecolari della transizione tra fasi acute e croniche dello stress ER in diversi modelli di malattie neurodegenerative oltre alla gangliosidosi GM2 Per iniziare, sezionare il tessuto sotto una lente d'ingrandimento 20X con due pinze a punta fine numero cinque, separando la corteccia frontale dalle meningi.
Trasferire la corteccia frontale in un tubo conico da 15 millilitri e incubare il tessuto con tre o quattro millilitri di tripsina EDTA per 15 minuti a 37 gradi Celsius per la digestione chimica. Successivamente, lavalo tre volte con la soluzione salina bilanciata di Hank priva di ioni di calcio e magnesio e lo 0,1% di glucosio. Dissociare meccanicamente il tessuto 10 volte pipettando su e giù utilizzando una punta da 1.000 microlitri in DMEM più il 10% di FCS.
Centrifugare l'omogenato a 100 G per un minuto, raccogliere il surnatante e completare il volume rimanente in 1.000 microlitri. Placcare la sospensione cellulare su piastre di coltura cellulare ad una densità di 520 cellule per millimetro quadrato con due millilitri di DMEM contenente 10% FCS, 1% penicillina streptomicina e 1% di un additivo aminoacido essenziale. Incubare a 37 gradi Celsius in un ambiente umidificato con il 5% di anidride carbonica per due ore.
Per consentire la differenziazione delle cellule neurali, cambiare il mezzo per un mezzo neurobasale privo di siero con il supplemento senza siero. Mantenere le colture a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica fino al trattamento. Per la ricottura, mescolare due oligonucleotidi a singolo filamento con sequenze complementari in quantità molari uguali.
Riscaldare a 95 gradi Celsius per due minuti. Trasferire i campioni dal blocco termico e diluire il prodotto risultante a una concentrazione finale di 0,5 micromolari. Per clonare lo shRNA inserire nel vettore lentivirale pLKO.
3G, digerire un microgrammo del vettore con enzimi di restrizione EcoR1 e PAC1. Mescolare delicatamente mediante pipettaggio e incubare la reazione per tre o quattro ore a 37 gradi Celsius. Per la legatura, mescolare il vettore digerito e inserirlo in un rapporto molare di 3:1.
Incubarlo con la ligasi T4 e tampone ligasi durante la notte a 16 gradi Celsius. Quindi, mescolare il componente E.coli con il volume totale della reazione di legatura e raffreddarlo sul ghiaccio per 15 minuti. Mettilo in un bagno a 42 gradi Celsius per due minuti e poi raffreddalo di nuovo sul ghiaccio per 15 minuti.
Trasferire il volume totale sottoposto a shock termico in un tubo da 15 millilitri e completare il volume a 1.000 microlitri con Luria-Bertani o mezzo liquido L-B. Agitare i batteri per 90 minuti di 37 gradi Celsius in uno shaker orbitale a circa 330 RPM. Centrifuga che ha incontrato 5.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare 900 microlitri di surnatante e utilizzare il surnatante rimanente per risospendere il pellet. Distribuire uniformemente la sospensione batterica su una piastra L-B di ampicillina solida e incubare per 37 gradi Celsius durante la notte. Scegli una singola colonia da trasferire in un tubo da 15 millilitri con 10 millilitri di L-B liquido medio e ampicillina.
Agitare i batteri a 37 gradi Celsius a circa 330 RPM e centrifugare la coltura per pellettare i batteri a 5.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, conservare il pellet batterico a meno 20 gradi Celsius. 24 ore prima della trasfezione, seminare da 1 a 5 milioni di cellule HEK-293 in piatti di coltura da 100 millimetri.
Mescolare 14 microgrammi di pKLO. Vettore 3G con un inserto specifico, 10,5 microgrammi di plasmide psPAX e 3,5 microgrammi di plasmide dell'involucro pMD2. G.Diluire 45 microlitri di reagente plasmidico di trasfezione in 700 microlitri di terreno a siero ridotto e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi combinare la miscela di DNA con il reagente di trasfezione plasmidica diluito, mescolare delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Cambiare il mezzo del piatto di coltura delle cellule HEK-293 con un mezzo fresco dopo la trasfezione e aggiungere l'intero volume della soluzione di DNA goccia a goccia. Scuotere delicatamente il piatto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 48-72 ore per consentire agli shRNA di raggiungere la loro trasduzione ottimale.
Raccogliere il terreno con lentivirus e conservare a quattro gradi Celsius. Filtrare il surnatante virale con una membrana di nylon da 0,45 micrometri e aliquote di un millimetro del flusso attraverso. Centrifugare a 17.000 g per quattro ore.
Scartare il surnatante e conservare il pellet. Lasciare asciugare il pellet invisibile e, una volta asciugato, conservare a meno 80 gradi Celsius. Infettare le colture primarie di neuroni corticali con specifici oligonucleotidi shRNA, prendendo di mira le UTR a tre primi di calcineurina A-alfa o CHOP e incubarle a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per un giorno.
Successivamente, aggiungere la soluzione madre GM2 al terreno di coltura a una concentrazione finale di due micromolari e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 16, 24 e 48 ore. Fissare le cellule con il 4% di paraformaldeide e 120 millimolari di saccarosio in PBS per 20 minuti a 37 gradi Celsius e quindi lavarle con PBS. Aggiungere la soluzione di permeabilizzazione per cinque minuti e lavare con PBS.
Utilizzare 5% BSA diluito in PBS per 45 minuti per consentire il blocco. Quindi, incubare con l'anticorpo anti-MAP2 a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo aver lavato le cellule due volte con PBS alla fine del tempo di incubazione, incubare con un anticorpo secondario per un'ora.
Montare gli occhiali dopo aver lavato le celle con PBS. Dopo aver ottenuto le immagini con un microscopio invertito ad epifluorescenza caricare l'immagine per ottenere ImageJ e sottrarre lo sfondo cliccando su Process seguito da Subtract Background. Fare clic su Immagine, Regola, Soglia per regolare i valori minimi, consentendo di distinguere il percorso e alcuni tracciati.
Eliminare i soma utilizzando la selezione a mano libera. Selezionare Tracce e fare clic su Modifica, Selezione, Crea selezione. Ottieni il ROI facendo clic sui tasti Ctrl e T della selezione e conservalo.
Apri l'immagine originale. Fai clic sul pannello ROI Manager e seleziona il ROI iniziale. Quindi fare clic sull'immagine originale.
Una volta tracciato il ROI sull'immagine, premere i tasti Ctrl e M per elaborare l'analisi statistica. È stato fatto un tentativo qui per verificare se il silenziamento dei componenti a valle di 2pERK influisce sulla fase di transizione della risposta proteica dispiegata nel modello di cellule di stress ER. Il gene della calcineurina A-alfa e il gene CHOP sono stati silenziati da due specifiche sequenze di shRNA in una coltura cellulare di neuroni primari per un giorno.
L'espressione viene analizzata mediante Western blotting. Si osserva una chiara inibizione della calcineurina A-alfa mediata dallo stress ER e dell'aumento del livello di CHOP nelle cellule knockdown. Il possibile legame dello stress ER indotto dall'accumulo di GM2 con la degenerazione neuronale è stato esaminato eseguendo l'immunocolorazione MAP2 di colture neuronali primarie.
L'atrofia dei neuriti aumenta significativamente dopo aver indotto lo stress ER mediante incubazione di GM2 da 16 a 48 ore. Il silenziamento dell'espressione della calcineurina A-alfa aumenta significativamente l'atrofia dei neuriti, in particolare a 16 ore di accumulo di GM2 rispetto ai gruppi GM2 non trattati. Pertanto, il knockdown della calcineurina A-alfa ha accelerato il processo di degenerazione nei neuroni, corroborando l'effetto pro-sopravvivenza della calcineurina durante la fase iniziale della risposta proteica dispiegata.
Al contrario, il knockdown CHOP ha comportato una significativa diminuzione dell'atrofia dei neuriti rispetto ai controlli precisamente a 16-24 ore. il protocollo cellulare con la corretta coltura cellulare primaria e ottenendo una percentuale pari o superiore di cellule infette con il rispettivo lentivirus. Poiché la perdita dell'assone terminale neurale è il primo passo che delineiamo nel nostro processo, è anche possibile valutarlo eseguendo un test.
Questa tecnica permette al nostro gruppo e ad altri di valutare alcune molecole come potenziali strumenti terapeutici.
