Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
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Vorremmo ringraziare la dott.ssa Julia Fine per le sue idee e discussioni durante il processo di creazione del protocollo, così come la dott.ssa Cassondra Vernier per i suoi utili commenti durante l'editing. Questi materiali hanno contribuito a progetti che sono stati sostenuti in parte dalla Foundation for Food and Agriculture Research, nell'ambito della sovvenzione ID 549025.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui abbiamo delineato metodi che descrivono in dettaglio ogni fase del processo di amplificazione del virus e di preparazione dello stock di inoculo, compresa la raccolta delle larve e la propagazione, l'estrazione e la concentrazione del virus, nonché il trattamento virale sotto forma di esperimenti di alimentazione in gabbia. Questi metodi consentono la produzione di particelle virali semi-pure (Figura 4), la cui efficacia può essere costantemente quantificata mediante test di mortalità dose-risposta per virus letali per gli adulti (Figura 5). Dopo la conferma della capacità infettiva e/o della patologia, le particelle generate possono quindi essere utilizzate nei biosaggi per chiarire le interazioni tra le api mellifere e i virus delle api da miele.
Uno dei vantaggi più distintivi dei protocolli descritti è che ognuno è facilmente ridimensionato a un grande volume, che si tratti di pupe raccolte, particelle prodotte o saggi biologici eseguiti. Usando i metodi di escissione pupale33, ci si può aspettare di rimuovere ~ 100 pupe all'ora, anche se questo numero si scalerà con competenza. Tuttavia, il metodo di auto-rimozione larvale, riportato qui, pur richiedendo diverse procedure di pianificazione e programmazione, può facilmente generare 10-20 volte quel numero di api rimosse durante la notte, comportando relativamente poco sforzo manuale e meno sforzo meccanico sulle api.
Il limite principale di questo metodo è che non c'è modo di garantire che le larve auto-rimosse non fossero precedentemente infestate da Varroa. Il trattamento regolare degli acari e il monitoraggio degli alveari di origine possono ridurre al minimo questo rischio, ma alcune larve potrebbero ancora aver avuto un certo livello di parassitizzazione della Varroa. La rimozione manuale delle pupe singolarmente, tuttavia, consente all'utente di osservare se sono presenti acari nella cellula di una determinata pupa. Inoltre, poiché il processo di auto-rimozione si basa sul comportamento di ricerca del cibo delle larve, i telai contenenti queste larve devono essere rimossi prima dell'alimentazione finale che normalmente si verifica. Solo a causa di questa mancanza di approvvigionamento da parte dei lavoratori, le larve strisciano dalle loro cellule. Pertanto, le pupe derivate da questo metodo sperimentano una finestra molto breve di stress nutrizionale rispetto alle larve che si sono sviluppate completamente all'interno di una colonia e possono apparire leggermente più piccole. Ciò è particolarmente notevole nelle larve più giovani della coorte presente sul telaio; poiché la regina ha deposto le uova su una finestra di 24 ore, a queste larve manca proporzionalmente più tempo di alimentazione. Questi sono di solito chiaramente notevoli durante la pupa per le loro dimensioni molto ridotte rispetto a quelle rimosse dall'escissione manuale. Tuttavia, il volume di larve prodotte dall'auto-rimozione compensa più che compensa la loro ridotta biomassa individuale. Inoltre, il metodo di escissione manuale può anche causare notevoli sollecitazioni meccaniche alle pupe mentre vengono estratte dalle loro cellule. Se uno dei due metodi deve essere utilizzato come parte di un esperimento, e non solo per produrre particelle virali, è necessario prestare attenzione per garantire controlli adeguati.
Indipendentemente dal metodo di estrazione, il protocollo di propagazione del virus può generare grandi quantità di particelle virali utilizzando le pupe, il che riduce al minimo la variabilità indotta da altri metodi di inoculazione del virus attualmente praticati 35,36,37 durante il test per la risposta virale delle api mellifere. È importante notare che questo protocollo è stato ottimizzato e testato utilizzando virus non avvolti nell'ordine Picornavirales (ad esempio, virus israeliano della paralisi acuta, virus dell'ala deformata). Diverse strategie per isolare le particelle virali dovrebbero essere seguite quando si lavora con virus avvolti44. Come approssimazione approssimativa, ciascuno dei 16 campioni coinvolti nello sforzo di raccolta del virus (che includeva le 4 colonie della Figura 4) sono stati generati da 200-300 pupe iniettate e hanno prodotto tra 2-2,5 ml di preparati concentrati di particelle virali. Supponendo una concentrazione di inoculo virale dello 0,1% e una gabbia standard di 35 api, ciascuno dei 16 preparati virali fornirebbe particelle sufficienti per 3.300-4.200 gabbie. Questo surplus di materiale infettivo riduce le restrizioni sperimentali e consente saggi biologici ad alto rendimento. È importante notare che sebbene il concentrato di particelle virali possa rimanere vitale per mesi o anni se conservato a -80 °C, può lentamente diminuire di infettività, anche se sottoposto a pochi cicli di congelamento-disgelo. Si raccomanda pertanto di conservare il materiale di preparazione virale in piccole aliquote, molte delle quali possono quindi essere utilizzate per quantificare i titoli virali e verificare la dose di trattamento al momento dell'esperimento. Inoltre, la variabilità tra gli anni dimostrata nella Figura 5 rafforza ulteriormente la necessità di test periodici dose-risposta, riducendo così al minimo le possibilità di perdita inaspettata della vitalità del virus.
I biotest in gabbia stessi hanno anche limitazioni, o almeno avvertimenti necessari da prendere in considerazione, il principale è la natura artificiale dell'ambiente di biodosaggio della gabbia (Figura 3). Il raggruppamento delle api in recinti consente test virali oltre il livello individuale; la gabbia diventa l'unità sperimentale piuttosto che l'ape stessa. Sebbene questo sia più simile a una colonia reale che a una singola ape trattata in isolamento, è ancora lontano da un ambiente di alveare realistico. Rimosse dall'ambiente sociale, compresi i feromoni regina e covata, le api di età diverse e altri segnali, queste api potrebbero non rispondere come potrebbe fare una colonia a grandezza naturale. Tuttavia, queste sono principalmente considerazioni per esperimenti su larga scala che utilizzano il sistema a gabbia. I risultati raccolti dai biotest virali in gabbia dovrebbero essere trattati principalmente come informazioni di base che possono essere utilizzate per informare le future decisioni di test del virus scalate in un ambiente più realistico sul campo come desiderato dall'utente.
I metodi qui descritti forniscono un processo standardizzato per la produzione di massa di particelle virali per l'uso nei saggi virali delle api da miele. Tali test sono già stati implementati per esaminare vari aspetti delle interazioni ape-virus del miele, tra cui l'infezione multi-virus e il modo in cui la qualità della dieta e gli integratori alimentari influenzano la sopravvivenza di fronte all'infezione virale 11,18,45,46. Sono stati scalati per l'uso in esperimenti di infezione a livello di colonia11,47 e per studiare gli effetti dell'infezione sul comportamento47 e sull'espressione genica48. Nel complesso, questi metodi forniscono una linea di base in strumenti che possono essere utilizzati per produrre e valutare l'inoculo del virus delle api da miele.

Le api mellifere (Apis mellifera) svolgono un ruolo fondamentale nel moderno paesaggio agricolo globale, ma attualmente soffrono di una combinazione di fattori di stress biotici e abiotici, tra cui esposizione a pesticidi, foraggio scadente, parassiti e agenti patogeni 1,2. Uno dei più importanti agenti patogeni di preoccupazione sono i virus, molti dei quali sono vettorizzati da un altro dei principali fattori di stress delle api da miele, l'acaro parassita Varroa (Varroa destructor). Questi virus possono causare una serie di effetti negativi nelle api mellifere tra cui una ridotta sopravvivenza della covata, difetti dello sviluppo e paralisi che possono portare al collasso totale dell'alveare sia prima che dopo i periodi di svernamento 3,4,5. Sebbene ci siano stati progressi promettenti nello sviluppo di tecnologie utilizzate per combattere l'infezione da virus 6,7,8,9, le dinamiche con cui molti virus si propagano, si diffondono e interagiscono all'interno di un'ape o colonia di miele sono ancora poco conosciute 5,10 . Comprendere la biologia di base delle interazioni tra api e virus e le loro relazioni con altri fattori ambientali è fondamentale per lo sviluppo di tecniche efficaci di gestione dei virus.
Tuttavia, lo studio delle interazioni tra api e virus del miele pone sfide con numerosi fattori noti e sconosciuti che complicano il processo. Questi includono interazioni con la dieta11,12, esposizione ai pesticidi13 e background genetico delle api14,15. Anche quando ci si concentra solo sull'infezione da virus, le complicazioni sono comuni perché le popolazioni di api da miele, sia gestite che selvatiche, hanno sempre un certo grado di infezione da virus di fondo, anche se spesso senza manifestare sintomiacuti 16,17, e gli effetti della coinfezione da virus non sono ben compresi18. Ciò ha reso difficile districare lo studio degli effetti del virus delle api da miele.
Molti studi sul virus delle api da miele hanno utilizzato infezioni virali circostanziali per cercare interazioni con altri fattori di stress, osservando come le infezioni di fondo cambiano con altri trattamenti 12,19,20,21. Mentre questo approccio ha avuto successo nell'identificare effetti importanti, in particolare scoprendo come i pesticidi o i trattamenti dietetici influenzano i livelli e la replicazione del virus, l'inoculazione con un trattamento del virus di contenuto e concentrazione noti è fondamentale per i test sperimentali delle dinamiche di infezione da virus. Anche così, separare il trattamento sperimentale dall'infezione di fondo può anche porre delle sfide. Negli studi sul campo, i ricercatori hanno differenziato i ceppi del virus dell'ala deformata (DWV) per fornire prove della trasmissione del virus dalle api mellifere ai bombi22, ma l'uso di questo approccio sarebbe difficile solo all'interno delle api da miele. I cloni infettivi da virus sono uno strumento potente, non solo per il monitoraggio dell'infezione 23,24,25, ma per studi di genetica inversa sui virus delle api da miele e per la ricerca sull'interazione virus-ospite 26,27,28. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, i cloni infettivi sono ancora necessari per soddisfare il ciclo di infezione all'interno delle cellule per produrre particelle. Tali particelle sono preferite come inoculi per trattamenti sperimentali perché la loro infettività è superiore all'RNA virale nudo e l'inoculazione con genomi incapsulati imita un'infezione naturale.
Anche la produzione di inoculi puri e incontaminati del virus delle api del miele (ceppi virali selvatici o derivati da cloni infettivi) pone delle sfide. Questi sono principalmente dovuti alle difficoltà nell'ottenere una linea cellulare di api da miele affidabile, a replicazione continua e priva di virus per produrre virus di ceppo puro29,30. Mentre alcune linee cellulari sono state prodotte, questi sistemi rimangono imperfetti; tuttavia, c'è la speranza che una linea cellulare praticabile possa essere prodotta29, il che consentirebbe un controllo più preciso della produzione e dell'indagine del virus. Fino a quando tale linea non sarà ampiamente disponibile, la maggior parte dei protocolli di produzione di virus continuerà a fare affidamento sull'uso della produzione e purificazione di virus in vivo 18,31,32,33,34. Questi approcci comportano l'identificazione e la purificazione di particelle virali di interesse (o la produzione di un clone infettivo) e il loro utilizzo per infettare le api da miele, di solito come pupe. Le pupe vengono iniettate con il virus bersaglio e poi sacrificate, e ulteriori particelle vengono estratte e purificate. Tuttavia, poiché nessuna ape è priva di virus per cominciare, c'è sempre un certo grado di contaminazione da tracce di altri virus in qualsiasi concentrato di questo tipo e, pertanto, è necessario prestare molta attenzione nella scelta delle api con una bassa probabilità di infezioni di fondo. Inoltre, i metodi per rimuovere le pupe dalle cellule del pettine per l'uso in questi protocolli33 sono molto laboriosi e possono indurre stress nelle api, limitando la produzione con questi mezzi18,32. Qui, riportiamo un metodo alternativo che consente la rimozione su larga scala delle larve con poco lavoro e meno stress meccanico sulle api.
Una volta ottenute le pupe e iniettate con l'inoculo del virus di partenza, devono essere incubate per fornire al virus il tempo di replicarsi. Successivamente, le particelle virali prodotte possono essere trasformate in una forma utilizzabile per infettare le api sperimentali. Esistono diversi metodi semplici per raggiungere questo obiettivo, tra cui l'utilizzo di un omogeneizzato grezzo35,36 o emolinfa generata da api infette viralmente come fonte di infezione37. Questi metodi sono efficaci ma incontrano una maggiore possibilità di introdurre variabili sconosciute dal substrato di fondo (ad esempio, altri fattori negli omogeneizzati delle api morte). Inoltre, è auspicabile concentrare le particelle se un esperimento richiede di somministrare una dose ampia e nota di un virus in un breve periodo di tempo. Pertanto, per un migliore controllo, è preferibile utilizzare metodi che consentano un certo livello di purificazione e concentrazione delle particelle virali. Generalmente, una serie di fasi di precipitazione e centrifugazione comporterà la rimozione di quasi tutto il possibile materiale virale non bersaglio33.
Dopo aver prodotto questo inoculo concentrato, è utile quantificare i titoli virali (qPCR) e caratterizzarlo con biosaggi in vivo per testarne la vitalità e la capacità di causare mortalità, nonché per confermare che si ottengono titoli virali aumentati dopo l'infezione. Ciò può essere ottenuto attraverso esperimenti di iniezione (sia in pupe che in adulti) o esperimenti di alimentazione (in larve o adulti). Mentre tutti questi approcci sono possibili, l'alimentazione di gruppi di api adulte in una gabbia è spesso la più veloce e semplice. Il metodo di analisi della gabbia è anche ampiamente utilizzato per testare vari altri trattamenti sulle api, tra cui la tossicità dei pesticidi38, lo sviluppo dell'ovaio39 e l'influenza nutrizionale sul comportamento40,41 e, quindi, può costituire una buona base per esperimenti che collegano l'infezione da virus con altri fattori42.
Qui descriviamo un metodo affidabile per produrre grandi quantità di particelle virali semi-pure e altamente arricchite senza utilizzare un costoso ultracentrifuga, incluso un metodo per rimuovere le pupe che riduce il lavoro e lo stress meccanico sulle api e un biotest altamente ripetibile e ad alto rendimento per testare l'infezione virale e gli effetti. Controllando strettamente la purezza dell'inoculo virale, i ricercatori sono in grado di ridurre la variazione della risposta virale delle api da miele rispetto ad altri metodi di inoculazione virale. Inoltre, il biotest può schermare gli effetti virali a livello di piccoli gruppi utilizzando unità sperimentali altamente ripetibili prima di scalare su impostazioni realistiche sul campo, che è molto più laborioso da gestire. In combinazione, questi due metodi forniscono gli strumenti necessari per gli studi che possono aiutare a migliorare la nostra comprensione generale delle interazioni fisiologiche ape-virus del miele.

<table><tbody><tr><td>10% bleach solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td><td>SigmaAldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cages for bioassay</td><td></td><td></td><td>Dependent on experimental setup</td></tr><tr><td>Combitips Advanced 0.1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089405</td><td>Optional (if no injector appartus is available)</td></tr><tr><td>Containers for larval self-removal</td><td></td><td></td><td>Should measure roughly 19&quot; x 9-1/8&quot; (Langstroth deep frame dimensions)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>Capable of maintaining 34 &amp;ordm;C and 50% relative humidity</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Any absorbent wipe will work</td></tr><tr><td>Medium-sized weight boats</td><td></td><td></td><td>Serve as inoculum trays</td></tr><tr><td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td><td>MilliporeSigma</td><td>MPE100025</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrile gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td><td>SigmaAldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated benchtop centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of 15,000 x g</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of 21,000 x g</td></tr><tr><td>Repeater M4 Multipipette</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Optional (if no injector appartus is available)</td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>ThermoFisher</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-free water</td><td>SigmaAldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>SigmaAldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Le api da miele sono di grande importanza ecologica e agricola in tutto il mondo, ma sono anche soggette a una varietà di pressioni che influenzano negativamente la salute delle api, compresa l'esposizione a patogeni virali. Tali virus possono causare un'ampia varietà di effetti devastanti e spesso possono essere difficili da studiare a causa di molteplici fattori che rendono difficile separare gli effetti dei trattamenti sperimentali dall'infezione di fondo preesistente. Qui presentiamo un metodo per produrre in serie grandi quantità di particelle virali insieme a un biotest ad alto rendimento per testare l'infezione virale e gli effetti. Rese necessarie dall'attuale mancanza di una linea continua di cellule di api da miele prive di virus, le particelle virali vengono amplificate in vivo utilizzando pupe di api da miele, che vengono estratte dall'alveare in grandi volumi utilizzando una metodologia minimamente stressante. Queste particelle virali possono quindi essere utilizzate nei biotest delle gabbie delle api per testare la vitalità degli inoculi, nonché in varie altre dinamiche di infezione virale, comprese le interazioni con nutrizione, pesticidi e altri agenti patogeni. Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo di tali particelle è che riduce notevolmente le possibilità di introdurre variabili sconosciute nella sperimentazione successiva rispetto alle alternative attuali, come l'infezione tramite emolinfa delle api infette o omogeneizzato, anche se è necessario prestare attenzione quando si acquistano le api, per ridurre al minimo la contaminazione da virus di fondo. I saggi in gabbia non sostituiscono esperimenti su larga scala e realistici sul campo che testano gli effetti dell'infezione virale a livello di colonia, ma funzionano invece come metodo per stabilire risposte virali di base che, in combinazione con le particelle virali semi-pure, possono servire come strumenti importanti per esaminare varie dimensioni delle interazioni fisiologiche ape-virus del miele.

Seguire con successo i protocolli (Figure 1) per l'iniezione pupale e l'estrazione virale dovrebbe produrre grandi quantità di particelle virali. Tuttavia, il campionamento e l'iniezione di pupe provenienti da una varietà di colonie in più punti temporali massimizza le possibilità di acquisire virus bersaglio con bassa contaminazione. La dinamica con cui i virus si replicano e interagiscono tra loro all'interno di un'ape mellifera non è ben compresa; accoppiato con la probabilità di infezione preesistente, non vi è alcuna garanzia che il virus iniettato (desiderato) diventerà il dominante in una data pupa, anche se le pupe sono state campionate dalla stessa colonia originale. La Figura 4 mostra la gamma potenziale di proporzioni virali che ci si potrebbe aspettare di vedere dopo l'estrazione. Le quattro colonie esposte rappresentano un sottoinsieme di un più ampio sforzo di raccolta del virus in cui ogni pupa è stata inizialmente iniettata con un inoculo del virus israeliano della paralisi acuta (IAPV) al 95%. Sebbene 10 dei 16 campioni di colonia coinvolti in queste estrazioni contenessero IAPV altamente puro (> 95%), tra cui alcuni > il 99% (ad esempio, la Colonia 1), altri campioni variavano nella loro proporzione IAPV (ad esempio, Colonia 2-3), con alcuni addirittura dominati da altri virus come il virus dell'ala deformata (DWV) (ad esempio, Colonia 4).
La Tabella 1 fornisce un contesto aggiuntivo per il livello di amplificazione dei quattro virus (BQCV, DWV, IAPV, SBV) mostrati nella Figura 4 sotto forma di valori del ciclo di soglia RT-qPCR (Ct) (il punto in cui un bersaglio PCR raggiunge la soglia di rilevamento) e equivalenti totali del genoma del virus (ge) per 100 ng RNA. I valori Ct possono essere usati come predittore di proporzione, ma i valori ge devono essere calcolati utilizzando un metodo basato su curve standard17. Si noti che la quantità effettiva di particelle (cioè ge) prodotte dipende dal numero di pupe lavorate e dal rigore filtrante durante il processo di estrazione.
I preparati di particelle virali (inoculo amplificato) devono essere conservati a -80 °C e si raccomanda di aliquotarli, poiché si degradano in modo significativo se sottoposti a cicli multipli di congelamento-disgelo18. Inoltre, i saggi dose-risposta dovrebbero sempre essere condotti prima della sperimentazione, poiché una moltitudine di fattori esterni (genetica dell'alveare, salute delle api, ecc.) possono portare a una risposta virale altamente variabile. Utilizzando i dati derivati dalle gabbie sperimentali (Figura 3), la Figura 5 dimostra tale variabilità confrontando le curve di sopravvivenza dose-risposta delle api da miele, alimentate con le stesse particelle IAPV durante due anni diversi. Nonostante parametri di test identici, tra cui gli stessi inoculi virali e concentrazioni di test che vanno dall'1% allo 0,01% IAPV, gli studi condotti nel 2018 (Figura 5A) e nel 2019 (Figura 5B) hanno prodotto risposte di sopravvivenza notevolmente diverse in tutti tranne il trattamento di controllo, che non ha ricevuto alcun virus nel suo inoculo di saccarosio. Si noti che, se lo si desidera, i calcoli LD50 possono anche essere eseguiti a questo punto per ottenere misurazioni di mortalità più precise43, ma questo di solito non è necessario in quanto le approssimazioni sono generalmente sufficienti. Nel 2018, una dose dell'1% ha portato a una sopravvivenza di circa il 50% a 72 ore dopo l'infezione (hpi), rendendola così la concentrazione predefinita per la maggior parte degli esperimenti in gabbia virale condotti quell'anno. Tuttavia, quella stessa dose ha raggiunto quasi la mortalità totale nel 2019 allo stesso tempo e, di conseguenza, la maggior parte degli esperimenti in gabbia virale condotti quell'anno ha ricevuto invece un inoculo IAPV dello 0,01%. Questa concentrazione significativamente più bassa ha raggiunto gli stessi livelli di mortalità di un inoculo IAPV all'1% nel 2018, utilizzando anche 100 volte meno particelle virali.
Questi dati sono stati prodotti con biosaggi utilizzando gabbie simili a quella schematizzata nella Figura 3. I fori di alimentazione nella parte superiore e laterale consentono un facile controllo della dieta e la porta scorrevole della gabbia semplifica l'aggiunta o la rimozione di oggetti dall'ambiente della gabbia, come vassoi di inoculo o api morte. Tuttavia, il protocollo di analisi virale generalizzato non è limitato a questi tipi di gabbie né alle scelte dietetiche e dovrebbe essere modificato per soddisfare le esigenze sperimentali.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig01.jpg"> Figura 1: Immagini rappresentative di vari stadi durante il protocollo di auto-rimozione larvale. (A) Esempio di massa larvale che ci si aspettava dopo il periodo di auto-rimozione notturna (1.6). (B) Larve distanziate l'una dall'altra su vassoi separati per iniezione/crescita (1.6.3) (C,D) Pupe dagli occhi bianchi pronte per l'iniezione virale (1.9). Le macchie marroni sono frass larvali essiccati, che non hanno bisogno di essere rimossi. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig02.jpg"> Figura 2: Esempio di apparecchio iniettore creato combinando un ago ipodermico con una punta multi-dispenser. L'ago e la punta sono stati uniti utilizzando adesivo liquido per erogare costantemente iniezioni di fluido da 1 μL quando attaccati a un pipetter ripetuto. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig03.jpg"> Figura 3: Esempio di gabbia utilizzata nel biotest del virus. La soluzione di saccarosio e il polline sono stati forniti ad libitum attraverso fori di alimentazione durante la durata della prova. Gli inoculi virali potrebbero essere facilmente consegnati utilizzando un vassoio inserito attraverso il fondo della gabbia. Si noti che il tipo di gabbia e il contenuto dell'alimentatore potrebbero essere regolati secondo necessità per adattarsi ai parametri sperimentali. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig04.jpg"> Figura 4: Carichi e proporzioni virali totali medie tra i preparati virali di quattro colonie campione. Le cariche virali sono state misurate da RT-qPCR come virus delle cellule della regina nera (BQCV) + virus dell'ala deformata (DWV) + virus della paralisi acuta israeliana (IAPV) + virus della sacralità (SBV) equivalenti del genoma (ge) in 100 ng RNA. Ogni colonia campione era costituita da oltre 150 pupe omogeneizzate originariamente iniettate con IAPV e rappresenta la gamma tipica di proporzioni virali generate dal protocollo di iniezione del virus pupale. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig05.jpg"> Figura 5: Curve di sopravvivenza dose-risposta delle gabbie per biodosaggio delle api da miele. Le gabbie del 2018 (A) e del 2019 (B) sono state inoculate con IAPV e alimentate con soluzione di saccarosio al 30% ad libitum per tutta la durata dello studio. I trattamenti rappresentano concentrazioni di inoculi IAPV con 10-2 a 10-4 che denotano dall'1% allo 0,1% di preparati di particelle IAPV miscelati in soluzione di saccarosio al 30%; le inoculazioni di saccarosio di controllo non contenevano virus. n = 56 gabbie totali nel 2018; n = 77 gabbie totali nel 2019. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Valori medi del ciclo di soglia (Ct) ed equivalenti del genoma per 100 ng RNA di miscele virali in quattro preparazioni virali da quattro colonie campione. Ogni colonia campione è costituita da oltre 150 pupe omogeneizzate generate dal protocollo di iniezione del virus pupale. I virus sono stati rilevati da RT-qPCR utilizzando primer specifici per ciascun virus. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/Table_1.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>

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Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Qui descriviamo due protocolli: in primo luogo per propagare, estrarre, purificare e quantificare grandi quantità di particelle virali non avvolte dalle api da miele, incluso un metodo per rimuovere le pupe delle api da miele e in secondo luogo per testare gli effetti dell'infezione virale utilizzando un biotest in gabbia altamente ripetibile e ad alto rendimento.

Preparazione dell'inoculo arricchito da virus per l'infezione orale delle api mellifere (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

preparation-virus-enriched-inoculum-for-oral-infection-honey-bees

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

2.8K Views.  University of Illinois. Qui descriviamo due protocolli: in primo luogo per propagare, estrarre, purificare e quantificare grandi quantità di particelle virali non avvolte dalle api da miele, incluso un metodo per rimuovere le pupe delle api da miele e in secondo luogo per testare gli effetti dell'infezione virale utilizzando un biotest in gabbia altamente ripetibile e ad alto rendimento.

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Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

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Neuroscienze

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

Empirica, metagenomica e tecniche computazionali illuminano i meccanismi attraverso i quali salute delle API di fungicidi compromesso

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Ambiente

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

Valutare l&#39;effetto delle sostanze chimiche ambientali su Honey Bee sviluppo dall&#39;individuo alla colonia Livello

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

Condizionata tattile e Analisi del Movimento di strategie di campionamento antennale di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These insects are the predominant vectors of Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), a xylem-limited bacterium that is the causal agent of Pierce&#39;s disease (PD) of grapevine. Pierce&#8217;s disease is economically damaging; thus, H. vitripennis have become a target for pathogen management strategies. A dicistrovirus identified as Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) has been associated with an increased mortality in H. vitripennis populations. Because a host cell is required for HoCV-01 replication, cell culture provides a uniform environment for targeted replication that is logistically and economically valuable for biopesticide production. In this study, a system for large-scale propagation of H. vitripennis cells via tissue culture was developed, providing a viral replication mechanism. HoCV-01 was extracted from whole body insects and used to inoculate cultured H. vitripennis cells at varying levels. The culture medium was removed every 24 hr for 168 hr, RNA extracted and analyzed with qRT-PCR. Cells were stained with trypan blue and counted to quantify cell survivability using light microscopy. Whole virus particles were extracted up to 96 hr after infection, which was the time point determined to be before total cell culture collapse occurred. Cells were also subjected to fluorescent staining and viewed using confocal microscopy to investigate viral activity on F-actin attachment and nuclei integrity. The conclusion of this study is that H. vitripennis cells are capable of being cultured and used for mass production of HoCV-01 at a suitable level to allow production of a biopesticide.

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Here we present a protocol to propagate Homalodisca vitripennis cells and HoCV-1 in vitro. Medium was removed from HoCV-1 positive cultures and RNA extracted every 24 hr for 168 hr. Cell survivability was quantified by trypan blue staining. Whole virus particles were extracted post-infection. Extracted RNA was quantified by qRT-PCR.

Propagazione di<em&gt; Virus-01 Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Immunologia e infezioni

Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Here we describe our detailed protocol for the preparation of single-cohort honeybee colonies&#160;&#8211; a useful tool for analyzing the role-associated worker physiology. We also describe detailed protocols for treating workers with juvenile hormone and ecdysone to evaluate the involvement of these hormones in the regulation of worker behavior and/or physiology.

Preparazione di singole colonie-coorte e trattamento ormonale di lavoratore api per analizzare Fisiologia associati con il ruolo e / o sistema endocrino

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

Manipolazione neurofarmacologico di sobrio e-volo libero api mellifere,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of gene function. We use this method in this study to check for the specificity of antibodies developed against the insect GABAA receptor subunit Resistance to Dieldrin (RDL) and a metabotropic glutamate receptor mGlutR1 (mGluRA). The antibodies were generated in rabbits against the conjugated peptides specific to fruit flies (Drosophila melanogaster) as well to honeybees (Apis mellifera). We used these antibodies in honeybee brain sections to study the distribution of the receptors in honeybee brains. The antibodies were affinity purified against the peptide and tested with immunoblotting and the classical method of preadsorption with peptide conjugates to show that the antibodies are specific to the corresponding peptide conjugates against which they were raised. Here we developed the CRISPR-Cas9 technique to test for the reduction of protein targets in the brain 48 h after CRISPR-Cas9 injection with guide RNAs designed for the corresponding receptor. The CRISPR-Cas9 method can also be used in behavioral analyses in the adult bees when one or multiple genes need to be modified.

Presented here is a protocol to use the CRISPR-Cas9 system for reducing the production of a protein in the adult honeybee brain to test antibody specificity.

Test anticorpale sui recettori anti-RDL e anti-mGlutR1 nelle sezioni del cervello di Honeybee utilizzando CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Infezione virale sperimentale nelle zanzare adulte mediante alimentazione orale e microiniezione

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Preparazione dell'inoculo arricchito da virus per l'infezione orale delle api mellifere (Apis mellifera)

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

Empirica, metagenomica e tecniche computazionali illuminano i meccanismi attraverso i quali salute delle API di fungicidi compromesso

Valutare l'effetto delle sostanze chimiche ambientali su Honey Bee sviluppo dall'individuo alla colonia Livello

Condizionata tattile e Analisi del Movimento di strategie di campionamento antennale di api mellifere (

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (

Propagazione di

Preparazione di singole colonie-coorte e trattamento ormonale di lavoratore api per analizzare Fisiologia associati con il ruolo e / o sistema endocrino

Manipolazione neurofarmacologico di sobrio e-volo libero api mellifere,

Test anticorpale sui recettori anti-RDL e anti-mGlutR1 nelle sezioni del cervello di Honeybee utilizzando CRISPR-Cas9

Infezione virale sperimentale nelle zanzare adulte mediante alimentazione orale e microiniezione