La quantificazione delle lesioni aterosclerotiche nelle apoE e in altri tipi di topi iperlipidemici è fondamentale per la valutazione di vari fattori genetici e nuove terapie. Il nostro protocollo fornisce istruzioni passo-passo per l'analisi del carico aterosclerotico in modo qualitativo e quantitativo in un singolo topo. 16 settimane dopo aver indotto l'aterosclerosi, prima di perfondere il cuore, caricare una siringa da 10 millilitri con 10 millilitri di DPBS e attaccare un ago da 25 gauge.
Sollevare la pelle addominale del topo sperimentale con una pinzetta e utilizzare forbici sottili per tagliare la pelle dalla base dell'addome alla parte superiore del collo. Aprire la parete addominale sotto la gabbia toracica e utilizzare le pinzette per sollevare lo sterno per accedere al diaframma. Tagliare il diaframma e tagliare via la cassa toracica per esporre la cavità toracica.
Quindi, fare una piccola incisione nell'atrio destro del cuore e iniettare lentamente l'intero volume di DPBS nella puntura ventricolare sinistra apicale. Il fegato e il rene diventeranno di colore marrone chiaro. Quando tutta la soluzione salina è stata perfusa, utilizzare una spugna non tessuta per pulire la cavità toracica da sangue e liquidi estranei.
Dopo che la cavità toracica è stata pulita, rimuovere gli organi non sperimentali e tagliare la clavicola con una pinzetta e forbici fini. Posizionare il mouse sotto uno stereomicroscopio e utilizzare le pinzette e le forbici a molla per sezionare l'aorta. Quando l'aorta è stata isolata, coprire il tessuto con una spugna non tessuta imbevuta di soluzione salina e sezionare i rami aortici tra cui le arterie brachiocefale, carotidi, succlavia, renali, iliache comuni e femorali.
Quando tutte le arterie che si ramificano dall'aorta sono state isolate, utilizzare pinzette e forbici a molla per sezionare e rimuovere con cura il tessuto adiposo e connettivo avventiziale intorno ai rami dell'aorta e dell'aorta. Un isolamento riuscito dell'aorta e dei rami aortici richiede pratica e pazienza. Per fissare l'albero vascolare, caricare prima una siringa da 10 millilitri con il 4% di formaldeide in 1X DPBS e attaccare un ago da 25 gauge.
Ricordati di preparare sempre il 4% di formaldeide all'interno di una cappa aspirante. Inserire l'ago nella puntura ventricolare sinistra apicale e iniettare lentamente l'intero volume di fissativo. Pulire la cavità toracica di eventuali fluidi estranei con una spugna non tessuta come dimostrato e utilizzare pinzette e forbici a molla di microsestrazione per separare il cuore dall'aorta.
Quando i tessuti sono stati separati, isolare e asportare l'aorta e il suo vaso principale da un millimetro sopra l'arteria carotide fino alla fine dell'arteria femorale e posizionare il vaso in un contenitore di DPBS. Per la colorazione Oil Red O dell'aorta intera non aperta, utilizzare i perni Minutien per fissare il recipiente su una capsula di Petri di cera e risciacquare il recipiente con DPBS fresco. Versare 25 millilitri di soluzione fresca di Oil Red O filtrata con pori da 0,45 micrometri nel piatto per una macchia di 60 minuti a temperatura ambiente.
Immergere il tessuto con il 60% di isopropanolo per un lavaggio di 20 minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, sciacquare il recipiente tre volte con acqua distillata fresca per cinque minuti per lavaggio e posizionare il piatto sotto il microscopio di dissezione. Utilizzare pinzette e forbici a molla per pulire delicatamente tutto il tessuto adiposo perivascolare intorno all'aorta per evitare qualsiasi macchia di olio rosso O a falso fondo e trasferire la nave su un vetrino pulito per microscopio.
Oil Red O etichetterà la placca ricca di lipidi in rosso, lasciando le aree non contenenti placca di colore pallido. Quindi acquisire micrografie digitali ad alta risoluzione con un microscopio ottico dotato di una fotocamera e salvare le immagini preferibilmente in formato di file immagine taggato. Per il montaggio frontale del campione di tessuto aortico, trasferire il recipiente in una capsula di Petri di cera e coprire il tessuto con DPBS fresco.
Tagliare le arterie carotidi e succlavia dell'arco aortico e le arterie iliache nell'aorta addominale da uno a due millimetri dopo le biforcazioni. Tagliare le arterie renali. Quindi, utilizzare le forbici a molla di microsestrazione per aprire longitudinalmente la preparazione dell'aorta lungo la curvatura interna e le arterie iliache e tagliare i tre rami dell'arco aortico lungo la curvatura maggiore fino al livello di base della curvatura interna.
Quindi utilizzare i perni Minutien per fissare l'aorta piatta contro il piatto senza allungarsi con il lato del lume rivolto verso l'alto e coprire il tessuto con DPBS fresco. Rispetto ai topi knockout apolipoproteina E, le pareti aortiche dei topi apolipoproteina E knockout a cellule muscolari lisce TGF-beta-R2 mostrano grave aterosclerosi, rendendo difficile sezionare le lesioni. Inoltre, gli aneurismi sono particolarmente estesi al di sotto dell'aorta soprarenale, ricordando molto gli aneurismi aortici umani avanzati.
Qui, viene mostrata un'immagine rappresentativa di un'aorta non aperta da un topo Apolipoproteina E ad alto contenuto di grassi alimentato con dieta ricca di colesterolo ad alto contenuto di grassi e condita con olio rosso O. Il topo ha sviluppato sia un aneurisma aortico ascendente che uno addominale con formazione accelerata di lesioni aterosclerotiche osservata nelle arterie brachiocefala, carotidea, succlavia, iliaca, femorale e renale. Questa colorazione en face Oil Red O del tessuto di topo Apolipoproteina knockout E di TGF-beta-R2 rivela un grave allargamento aneurismatico e un marcato allungamento dell'intera aorta rispetto al gruppo di topi knockout apolipoproteina E.
È importante essere in grado di distinguere le placche macchiate di Oil Red O dal falso sfondo dei tessuti adiposi perivascolari macchiati di Oil Red O. Le placche di aterosclerosi sono fenomeni tridimensionali. Dopo la quantificazione della lesione 2D aortica en face, si consiglia l'analisi del set di placche come le radici aortiche e l'arteria brachiocefalica.
Questo protocollo può anche essere utilizzato per decidere se un particolare fattore genetico, intervento o trattamento influisce sulla progressione o sulla regressione dell'aterosclerosi in questi modelli.
