Descriviamo un protocollo per sezionare, immunocolorare e montare cervelli larvali e adulti di Drosophila con particolare enfasi sui lobi ottici. Data la complessa organizzazione tridimensionale del lobo ottico, si prevede che il protocollo qui descritto fornirà ai ricercatori una maggiore comprensione della relazione tra l'orientamento di montaggio e le strutture del lobo ottico visualizzate. Questo protocollo descrive tre strategie di montaggio sia per i lobi ottici larvali che per quelli adulti, ognuna delle quali fornisce un angolo ottimale per visualizzare una specifica struttura del lobo ottico durante l'imaging.
Prima di iniziare la dissezione, riempire tutti i pozzetti di una piastra a tre pozzetti con 400 microlitri di PBS per pozzetto e utilizzare una pinza per selezionare delicatamente 15 larve vaganti di terzo stadio che strisciano all'interno di una fiala o di una bottiglia di Drosophila. Metti tutte le larve nel primo pozzetto della piastra a tre pozzetti e trasferisci una larva nel pozzetto centrale della piastra. Usando la mano non dominante, trattenere il corpo della larva alla base del pozzo e usare la mano dominante per afferrare delicatamente l'uncino della bocca della larva.
Tirare il gancio per la bocca lontano dal corpo per rimuovere il cervello. Successivamente, rimuovere i tessuti accessori, compresi i dischi immaginali. Quindi posizionare il cervello nel terzo pozzetto della piastra.
Quando tutti i cervelli sono stati sezionati, utilizzare una pipetta P200 per rimuovere con cura il PBS dal terzo pozzetto, lasciando una soluzione sufficiente a mantenere il cervello sommerso. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di fissazione a freddo appena preparata nel pozzetto. Mescolare delicatamente la soluzione con la pinza in modo che il cervello ruoti nel piatto e coprire il pozzetto con un vetrino da microscopio.
Quindi mettere il piatto sul ghiaccio per 30 minuti per fissare il fazzoletto. Lava il cervello cinque volte con 400 microlitri di PBS fresco più tritone per lavaggio. Il cervello è ora pronto per l'incubazione degli anticorpi primari.
Per le dissezioni cerebrali adulte, anestetizzare da 10 a 15 mosche adulte e posizionarle su una salvietta da laboratorio su ghiaccio. Usa una pinza per trasferire delicatamente una mosca adulta dall'ala in un pozzetto di una piastra di dissezione a tre pozzetti contenente 400 microlitri di PBS. Usa un paio di pinze nella mano non dominante per tenere il torace della mosca contro la base del pozzetto e usa una pinza ultra sottile con la mano dominante per tirare delicatamente la testa dal resto del corpo.
Gettare il corpo su una salvietta da laboratorio con la mano non dominante e utilizzare la mano dominante per tenere la testa contro la base del pozzetto vicino alla proboscide. Usa entrambe le pinze per staccare ogni regione della cuticola tra gli occhi, fino a quando il cervello non è esposto, e rimuovi tutti i tessuti accessori che rimangono attaccati al cervello. Posizionare il cervello pulito nel terzo pozzetto e sezionare il cervello successivo come dimostrato, fino a quando non sono stati ottenuti 15 cervelli o è trascorso un periodo massimo di dissezione di 30 minuti.
Fissare il cervello con 500 microlitri di soluzione di fissazione per 20 minuti a temperatura ambiente e lavare il cervello cinque volte con PBS più tritone, come dimostrato. Il cervello adulto è ora pronto per l'incubazione primaria degli anticorpi. Sostituire l'ultimo lavaggio con due gocce di terreno di montaggio fluorescente sicuro per immergere il cervello e aggiungere una singola goccia di terreno di montaggio al centro di un nuovo vetrino per microscopio in vetro.
Usa una pinza per afferrare ogni cervello larvale dal cordone nervoso ventrale per il trasferimento sul vetrino. Per visualizzare i progenitori e i neuroni dalla regione centrale del centro di proliferazione esterno, lamina o tappo della lobula, assicurarsi che il cordone nervoso ventrale sporga sopra i lobi, posizionare il cervello larvale sul vetrino con il lato anteriore del tessuto rivolto verso l'alto. Per visualizzare le cellule appartenenti alle punte dei centri di proliferazione esterni o interni, assicurarsi che il cordone nervoso ventrale sporga da sotto i lobi.
Posizionare il cervello larvale sul vetrino con il lato posteriore del tessuto rivolto verso l'alto. Per visualizzare la mezzaluna di neuroni dai centri di proliferazione interni ed esterni sia nell'asse ventrale dorsale che in quello laterale mediale, utilizzare un paio di pinze affilate o un ago di tungsteno per dividere i lobi cerebrali attraverso il cordone nervoso ventrale, a partire dal punto di scissione tra i lobi. Riorientare ogni lobo con il lato laterale rivolto verso l'alto.
Quando il cervello larvale è stato orientato in modo appropriato, posizionare una piccola goccia di terreno di montaggio su entrambi i lati del cervello. Posiziona un vetrino coprioggetti su ogni goccia e posiziona un vetrino coprioggetto finale sul cervello in modo che i bordi destro e sinistro poggino sugli altri due vetrini, formando un ponte coprioggetti. Quindi utilizzare lo smalto per unghie per sigillare i bordi del ponte di scorrimento coprioggetto per fissare i cervelli montati.
Dopo l'ultimo lavaggio con anticorpi secondari, eseguire un lavaggio finale con 400 microlitri di PBS. Sostituire il PBS con tre gocce di mezzo di montaggio fluorescente sicuro per immergere il cervello. Aggiungere una goccia di materiale di montaggio ai terzi sinistro e destro di un vetrino per microscopio in vetro.
Posiziona un vetrino coprioggetti su ogni goccia per costruire un ponte coprioggetti. Sigillare i bordi esterni del vetrino coprioggetto destro con smalto per unghie e aggiungere una singola goccia di supporto di montaggio tra i vetrini. Usando una pinza, trasferisci delicatamente il cervello sul vetrino con particolare cautela per evitare di danneggiare i lobi ottici.
Per visualizzare i corpi cellulari dei neuroni della lamina e del midollo, utilizzare un ago di tungsteno per orientare il cervello in posizione anteriore con i lobi dell'antenna che sporgono verso l'esterno. Per visualizzare i neuroni del complesso della lobula, orientare il cervello in una parte posteriore con i lobi antennali rivolti verso il basso contro la posizione del vetrino. Per visualizzare tutti i neuropil del lobo ottico su un unico piano, orientare il cervello in posizione orizzontale, allineare i cervelli in un supporto anteriore, quindi utilizzare un ago di tungsteno per ruotare ciascun cervello di 90 gradi verso l'alto in modo che si trovi sul lato ventrale, appoggiato sul bordo del vetrino coprioggetto.
Quando il cervello adulto è stato orientato in modo appropriato, posizionare un vetrino coprioggetto finale sul cervello in modo tale che i bordi destro e sinistro si sovrappongano agli altri due vetrini coprioggetti per formare un ponte, sigillare il vetrino con smalto per unghie. Ecco un'immagine di un lobo ottico larvale con orientamento di montaggio anteriore. Nell'orientamento di montaggio anteriore, l'epitelio del centro di proliferazione centrale più rumoroso, i neuroblasti del midollo e i neuroni della lamina appaiono in superficie come bande di cellule che avvolgono il cervello.
Più in profondità nel cervello, al centro dello Z-stack, sono visibili l'epitelio principale del centro di proliferazione esterno e i rispettivi neuroblasti e neuroni. Inoltre, l'epitelio del centro di proliferazione interno e i neuroni del tappo della lobula sono visibili in queste fette intermedie. Le fette Z più profonde raffigurano l'altro lato del cervello dove si trovano le punte posteriori del centro di proliferazione esterno.
È presente anche la punta superficiale del centro di proliferazione interno. Si noti che queste sarebbero le prime strutture visibili se il lobo ottico fosse montato posteriormente. Ecco un'immagine da un lobo ottico montato su un lato.
Sulla superficie del supporto laterale è visibile la mezzaluna della lamina e la mezzaluna della spina della lobula si trova tra i suoi bracci. La mezzaluna neuronale del midollo appare in una posizione Z leggermente più profonda. Ecco un'immagine di un lobo ottico adulto montato con orientamento anteriore.
Poiché il midollo si trova sulla superficie della montatura anteriore, la corteccia midollare è immediatamente visibile. I corpi cellulari nella corteccia proiettano le loro arborizzazioni nel neuropil, che può essere visualizzato in una posizione Z intermedia. A questo livello appare anche la lobula, orientata perpendicolarmente al midollo.
Nella posizione Z più profonda, il neuropilo finale del lobo ottico, è visibile la placca della lobula. Si noti che la placca lobula sarebbe la prima struttura visibile in una montatura posteriore. Ecco un'immagine di un lobo ottico adulto montato con orientamento orizzontale.
Quando il cervello viene capovolto di 90 gradi su un lato in posizione orizzontale, tutti i neuropili e le cortecce del lobo ottico sono visibili su un unico piano. Quando si esegue questo protocollo, la cosa più importante da ricordare è mantenere il tessuto cerebrale immerso nella soluzione per tutta la durata del protocollo. Se il cervello è esposto all'aria, la qualità della macchia e, quindi, le immagini finali saranno notevolmente ridotte.
Comprendere in che modo l'orientamento del montaggio influisce sulla visualizzazione del lobo ottico è importante per l'imaging dal vivo. I cervelli larvali e adulti possono essere coltivati e sottoposti a imaging per diversi giorni per seguire le divisioni cellulari o i cambiamenti nella propria morfologia. In questo caso, l'orientamento del montaggio è fondamentale, poiché i tipi di cella di interesse devono essere vicini al vetrino coprioggetto per un rilevamento ottimale del segnale fluorescente in vivo.
