Double in utero electroporation è un metodo potente per studiare gli aspetti importanti della corticogenesi dei mammiferi come l'interazione tra le cellule neuronali, generata in luoghi diversi ed età dello sviluppo. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di esaminare le interazioni imperturbate tra queste diverse popolazioni cellulari in modo rapido, dettagliato ed economico. Un'implicazione sorprendente del nostro metodo è che facilita una migliore comprensione di quanto simile sia il nostro cablaggio alterato in disturbi neuronali come autismo e schizofrenia.
Questo studio non è limitato alla neocorteccia ma può anche essere impiegato per analizzare le interazioni cellula-cellula, in aree esocortico come il sepalium o il cervelletto. Uno dei passaggi più impegnativi è l'iniezione di DNA nei ventricoli laterale dei primi embrioni. L'uso di una sorgente luminosa è essenziale per iniezioni di successo.
Per ogni intervento preparare prima una soluzione di 10 microliter contenente un microlitro di colorante verde veloce, un microgrammo per microliter soluzione di DNA plasmide di interesse per ogni plasmide e il volume appropriato sul tampone TE privo di endotossina. E precaricare una pipetta microcapillare di vetro con l'appropriata soluzione di DNA preparata. Per il primo in utero chirurgia di elettroporazione, applicare un unguento agli occhi di un topo incinta anestetizzato opportunamente temporizzato e utilizzare un rasoio per radere l'addome.
Disinfettare la pelle esposta due volte con salviette sequenziali al 70% di etanolo e iodio prima di procedere con l'incisione sul lato destro dell'addome. Una volta che l'utero è accessibile, utilizzare le forcep ad anello per estrarre attentamente l'organo. Utilizzando un tubo aspiratore controllato dalla bocca, iniettare circa 0,5 microlitri di soluzione nel ventricolo laterale dell'emisfero sinistro degli embrioni E11.5 per la strategia A.Oppure nel ventricolo laterale dell'emisfero destro degli embrioni E13.5 per la strategia B, fino a quando il colorante verde veloce non è visibile all'interno del ventricolo.
Quando tutta la soluzione è stata iniettata, posizionare gli elettrodi di platino di tipo forceps lateralmente intorno alla testa degli embrioni iniettati, con il polo positivo orientato alla parete mediale per colpire l'orlo corticale per la strategia A, o orientato alla corteccia laterale per la strategia B, facendo attenzione ad evitare il cuore e la placenta. Utilizzare un elettroporater ad onde quadrate per applicare la sequenza appropriata di impulsi elettrici per ogni età embrionale, come indicato nella tabella. Quando tutti gli embrioni sono stati iniettati ed elettroporati, utilizzare le flessione per restituire attentamente l'utero alla cavità addominale e riempire l'addome con soluzione salina calda.
Usando una sutura ago 6-0, chiudere la parete addominale e chiudere attentamente l'incisione cutanea. Quindi riportare l'animale nella sua gabbia di casa con monitoraggio fino al pieno recupero. Due giorni dopo l'intervento chirurgico iniziale, conferma che il topo sta mostrando un comportamento normale e non presenta segni di dolore o angoscia.
Prima di preparare l'animale per il secondo in utero elettroporazione come appena dimostrato. Iniettare 0,5 microlitri della soluzione di DNA desiderata nel ventricolo cerebrale laterale sinistro degli embrioni E13.5 per la strategia A, e nel ventricolo cerebrale laterale sinistro degli embrioni E15.5 per la strategia B.Dopo ogni iniezione, posizionare gli elettrodi con il polo positivo orientato alla corteccia laterale dell'emisfero iniettato per la strategia A e la strategia B.E gli embrioni elettroporati come indicato nella tabella. Al termine dell'elettroporazione, riportare l'utero nella cavità addominale e completare l'intervento chirurgico e le cure post-chirurgiche come dimostrato.
Quando si implementa la strategia A, quattro giorni dopo la seconda elettroporazione, raccogliere l'utero del giorno embrionale 17,5 topo femmina incinta in una piastra di Petri di PBS sul ghiaccio. E usa le pinzette per trasferire gli embrioni in un nuovo piatto di PBS al microscopio sezionato. Usando le forcep, afferrare attentamente la testa di ogni embrione per facilitare la rimozione della pelle sopra la testa e il cranio.
Usa le forcep o una spatola per sollevare il cervello esposto. Quindi utilizzare il cucchiaio per trasferire ogni cervello in singoli pozzi di una piastra di 48 porri contenente circa 600 microlitri di soluzione fissativa per pozzo. Quando tutti i cervelli sono stati raccolti, fissare il cervello a quattro gradi Celsius durante la notte su uno shaker orbitale, seguito da tre lavaggi di dieci minuti in PBS.
Dopo l'ultimo lavaggio, incorporare il cervello in agarosio del 4% a basso punto di fusione in PBS per circa dieci minuti. Dopo che l'agarosio si è solidificato, utilizzare la colla cianoacrilato per fissare ogni cervello a un lato bulbo olfattivo porta tessuto vibratomo verso l'alto. Posizionare il supporto all'interno del contenitore del vibratomo e riempire il contenitore con PBS.
Quindi utilizzare il vibratomo e una spazzola per ottenere sezioni seriali coronali spesse 100 micrometri. Trasferimento fino a sette sezioni per pozzo e sei pozzetti per embrione, in una nuova piastra di 48 pozzetti contenente 600 microlitri per pozzo di PBS fresco, integrata con conservanti antifungini man mano che vengono raccolti. Una volta acquisite tutte le sezioni, utilizzare una spazzola fine per montare ogni sezione su uno scivolo del microscopio in vetro e coprirle con una coverlip in vetro per valutare l'efficacia dell'elettroporazione su un microscopio a epifluorescenza verticale.
Quando si implementa la strategia B, il giorno 15 postnatale, dopo aver confermato una mancanza di risposta al topinch, fissare il mouse in posizione supina e utilizzare le forbici per fare un'incisione della pelle della linea mediana per esporre la gabbia toracica e il diaframma e tagliare il diaframma per ottenere l'accesso al cuore. Usando forbici fini, fare un'incisione nell'atrio destro e utilizzare un ago da 25 gage collegato a un tubo flessibile a una pompa perfusione peristaltica per penetrare nel ventricolo sinistro. Quando l'ago è in posizione, consegnare almeno 25 millilitri di paraformaldeide al 4% per perfusione trascardica, a flusso costante a 5,5 millilitri al minuto.
Dopo circa cinque minuti, interrompere la perfusione e utilizzare le forbici per rimuovere la pelle sopra la testa. Rimuovere il cranio e usare una spatola per rimuovere il tessuto cerebrale. Posizionare il cervello in un pozzo di una piastra di 24 porcile contenente 1,5 millilitri di paraformaldeide fresca al 4%, per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius su uno shaker orbitale.
Quindi acquisire sezioni di 40 micrometri del cervello postnatale come appena dimostrato. Per l'imaging affetta cerebrale embrionale e postnatale, posizionare le diapositive contenenti le sezioni cerebrali montate di interesse su un supporto per vetrine al microscopio. Introdurre il porta cursore nel microscopio confocale e selezionare il canale appropriato per i fluorofori utilizzati nell'esperimento.
Eseguire la scansione del campione per ottenere immagini cartografiche di ogni sezione cerebrale a due diverse lunghezze d'onda per una visione generale della doppia uscita di elettroporazione. Una volta terminato, selezionare l'obiettivo 10x, nella modalità di osservazione time lapse Z-stack multi-area. In ciascuna delle regioni XY selezionate, impostare i perimetri di imaging appropriati e la profondità della scansione lungo l'asse Z in base ai piani del campione, in cui la fluorescenza è visibile.
Ottenere immagini a basso ingrandimento di tutte le aree scelte ed esportare le immagini dal formato OIF al formato TIFF nel software di visualizzazione del microscopio. Quindi seleziona l'obiettivo 60x e cattura immagini ad alto ingrandimento come appena dimostrato, per osservare le interazioni da cella a cella a un livello più dettagliato. Il divario temporale tra il doppio negli interventi di elettroporazione utero consente alle cellule toresiali CAG mirate nel giorno embrionale 11.5 in uno dei suoi luoghi di origine di raggiungere la zona marginale della neocorteccia laterale compresa l'area somatosensoriale, in tempo per stabilire contatti con i neuroni di proiezione corticale, etichettati nel giorno embrionale 13.5.
I principali processi dei neuroni di proiezione che esprimono una GFP potenziata si rialzano abbondantemente nella zona marginale della corteccia e si mescolano con i processi di M-cherry che esprimono cellule cataretziali. In utero l'elettroporazione al giorno embrionale 13.5, l'uso di un BFP che esprime plasmide facilita l'etichettatura dei neuroni di proiezione attraverso diversi strati corticali. Una seconda elettroporazione nel lato contralaterale del giorno embrionale 15.5 prende di mira la sottopopolazione dei neuroni di proiezione callosale dello strato superiore, ma non i neuroni di proiezione dello strato inferiore che si sviluppano nelle fasi precedenti.
I neuroni mirati a strato superiore estendono i loro assoni all'emisfero contralaterale, con il caratteristico modello di arborizzazione. L'alto ingrandimento consente una visualizzazione più dettagliata dell'innervazione dell'assone callosalo dei neuroni di proiezione mirati all'interno dell'emisfero contralaterale. Quando si tenta questo protocollo, è importante pianificare i tempi di elettroporazione, l'emisfero da iniettare e la posizione degli elettrodi in base alle popolazioni cellulari da prendere di mira.
Seguendo questa procedura tutti i metodi, come l'elettroporazione è quello interessante. Per entrambi i tipi di cellule può essere eseguito per studiare possibili alterazioni del circuito in vivo. Utilizzando questa tecnica, è possibile studiare le interazioni fini tra due diverse cellule mirate.
Includendo nuove informazioni scientifiche in vivo, mediante l'elettroporazione di proteine sinaptiche fluorescenti.
