Con la manipolazione optogenetica di specifiche popolazioni neuronali o regioni cerebrali, il comportamento può essere modificato con un'alta risoluzione temporale e spaziale negli animali che si muovono liberamente. Utilizzando diversi strumenti optogenetici in combinazione con fibre ottiche impiantate cronicamente, è possibile eseguire una varietà di modulazioni neuronali e test comportamentali. L'obiettivo finale dell'optogenetica è la modulazione dei circuiti neuronali ad alta risoluzione temporale e spaziale nell'animale che si comporta.
A differenza delle manipolazioni farmacologiche o elettriche, l'optogenetica consente il controllo preciso di specifici tipi di cellule sui circuiti neuronali. L'optogenetica è il modo perfetto per indirizzare specifici tipi di cellule in una regione appositamente definita durante il comportamento e per esaminare l'effetto diretto dei cambiamenti in tali microcircuiti. Ora presenteremo un passo per guidare come preparare e piantare e condurre l'optogenetica in un topo che si muove liberamente.
Per la preparazione dell'impianto ottico, posizionare un lato piatto ferrule in ceramica in una morsa da banco. Strisciare il codice di una fibra di vetro di 200 micrometri di diametro, con uno strumento di stripping della fibra e tagliare da due a tre centimetri non pezzi con uno scriba in fibra ceramica. Posizionare il pezzo di fibra di vetro nel ferrule ceramico, quindi posizionare una goccia una supercolla sul lato piatto con un cannoulare di iniezione.
Sul lato rotondo del ferrule ceramico, tagliare la fibra di vetro il più corta possibile e posizionare il preimpianto su un disco di lucidatura ferrule per lucidare il lato rotondo su quattro diverse carte di pubblicazione. Successivamente, tagliare la fibra di vetro sul lato piatto del ferrule ceramico, alla lunghezza necessaria per l'impianto. Usa un atlante cerebrale del topo per calcolare la lunghezza dell'impianto.
L'impianto deve terminare direttamente al di sopra della regione di interesse. Prima dell'impianto, viene applicata l'anestesia. La tecnica precisa ed estetica è descritta nel manoscritto.
Quando il mouse raggiunge uno stato profondo di anestesia, posizionarlo su una piastra riscaldante e fissare la testa in un telaio stereotattico. Fissare il naso e i denti nella parte anteriore e le orecchie su entrambi i lati. Applicare un'algesia con un cuprofene subcuntaneamente nella parte posteriore del mouse e applicare un unguento opaco sugli occhi su entrambi gli occhi per proteggerli dall'asciugatura.
Inumidire i capelli sul cuoio capelluto con un tovagliolo di carta bagnato e quindi tagliarlo con le forbici. Assicurarsi di rimuovere tutti i capelli sciolti con un tovagliolo di carta bagnato. Utilizzare un bastoncino di cotone per disinfettare il cuoio capelluto con una tintura contenente iodio.
Sollevare il cuoio capelluto sulla regione di interesse con una pinzetta e tagliare un centimetro lungo la linea mediana. Per irrogitare il cranio per l'impianto, applicare una piccola quantità di acido fosforico sulla cicatrice e lasciarlo avere effetto per 15 secondi. Rimuovere tutto l'acido con un bastoncino di cotone e sciacquare due volte la cicatrice con cloruro di sodio.
Per una corretta iniezione, calcolare il fattore F per le singole coordinate. Posizionare un cannolare di vetro nella cornice stereoctatica e localizzarlo direttamente sopra il bregma. Ora azzerare il sistema di coordinate e spostare la cannula di vetro su Lambda.
Calcolare il fattore F con la formula seguente. Bregma meno Lambda diviso per 4,2 è uguale al fattore F. Le coordinate esatte sono molto importanti per l'iniezione e l'impianto perché altrimenti, se viene stimolata la struttura sbagliata, gli effetti comportamentali non sono specifici.
Tutti i topi hanno deviazioni minime nella dimensione del cranio, quindi il coefficiente è assolutamente obbligatorio. Utilizzare le coordinate regolate per trovare la posizione sulla cicatrice direttamente sopra la struttura di interesse. Utilizzare una cannula di iniezione per praticare un foro nel cranio, ruotando la cannula sul posto.
Per prendere una soluzione virale nella cannula di vetro collegata alla siringa, posizionare una goccia di cloruro di sodio sul cranio e un pezzo di pirofene sopra. Posizionare una goccia di due soluzione di virus microliter sul pirofene e abbassare la punta della cannula di vetro nel virus. Applicare la pressione negativa e attendere che la soluzione virale sia adottata dalla cannula.
Zero a quella coordinata quando la punta del virus con cannula è a livello del cranio e lentamente abbassarla nel foro di trivellazione nella posizione più bassa del lato di iniezione. Applicare una piccola quantità di pressione positiva con la siringa fino a quando il menisco non viene abbassato. Lasciare che il virus si diffonda per due o tre minuti prima di spostare la cannula di vetro verso l'alto nella posizione successiva.
Rimuovere la cannula di vetro molto lentamente e scartarla dopo l'iniezione finale. Ora prepara il cranio per l'impianto. Asciugare il cranio con aria compressa, applicare il primer con questo bastoncino corrispondente e lasciarlo asciugare per 15 secondi.
Applicare il legame con lo stesso bastoncino e polimerirlo per 20 secondi con luce UV. Posizionare l'impianto nel supporto corrispondente e posizionare la punta della fibra di vetro direttamente sopra il foro di trivellazione e abbassarla con attenzione. Interrompere l'abbassamento dell'impianto quando la valvola rimanente della supercolla tocca il cranio.
L'impianto di fibre ottiche può anche essere fatto per strutture bilaterali come l'ippocampo. Ciò consente una leggera stimolazione in entrambi gli emisferi contemporaneamente o consente la stimolazione di due strutture diverse. È anche possibile iniettare il virus in una posizione diversa dall'impianto in fibra ottica.
Se l'iniezione e l'impianto vengono eseguiti in diverse regioni, praticare tutti i fori necessari dopo aver applicato acido fosforico ma prima dell'adesione dei due componenti. Controllare di nuovo se il cranio è ancora completamente asciutto, quindi applicare cemento dentale fluido intorno all'impianto e nell'area circostante quindi curare per 20 secondi con luce UV Applicare altri due cemento minori in un'area del cranio completamente priva di pelliccia e essiccata. Curare ogni strato con la luce UV.
Per completare l'intervento chirurgico applicare l'unguento allo iodio su tutta la ferita. Rilasciare il naso e la fissazione dell'orecchio, portare il mouse in una gabbia fresca e posizionarlo sotto una lampada riscaldante per evitare la perdita di calore corporeo. Controlla il suo stato di salute almeno una volta al giorno e, se necessario, pubblica operativa e algesia dopo tre giorni.
Dopo due settimane di recupero, i topi possono essere utilizzati per esperimenti comportamentali. Aprire il software Pulser e selezionare la porta COM USB a cui è collegata la sorgente luminosa. Scegliere la modalità di funzionamento tre per consentire a un software esterno di controllare la sorgente luminosa.
Scegli la regolazione corretta per la stimolazione di 20 Hertz con un impulso luminoso di cinque millisecondi. Per individuare la divisione per comunicare con il pulser, premere la sequenza iniziale. Questo stato rimarrà fino al termine degli esperimenti.
A questo punto, creare un nuovo esperimento in EthoVision XT, passare al file, scegliere nuovo dal modello e selezionare applica un modello predefinito. Scegli il tracciamento dal vivo e seleziona la fotocamera con la sorgente e conferma la camma Puslar Gen-Eye collegata. Scegli il mouse come animale che dovrebbe essere registrato.
Selezionare il modello di arena, il quadrato del campo aperto e il centro del modello di zona, il bordo, gli angoli. Confermare un soggetto che deve essere tracciato e selezionare il punto centrale, il punto del naso e la base della coda. Verificare che il colore animale rispetto allo sfondo sia più scuro e che la frequenza di campionamento consigliata per completare il passaggio.
Assegnare all'esperimento il nome appropriato e scegliere una posizione da salvare. Fino a quando non trovi le impostazioni dell'arena, la fotocamera aprirà automaticamente un'immagine di sfondo. Adatta le zone predefinite all'arena reale usando la freccia e i due simboli su di essa è a destra.
Se alcune zone non sono necessarie, eliminarle. Premere la scala di disegno per calibrare e mettere una linea da un angolo del labirinto all'altro. Inserisci la lunghezza della distanza reale in centimetri.
Ripeterlo per l'altro asse. Per definire le impostazioni del controllo di prova, preparare la regola principale regolando il tempo delle condizioni a 20 minuti. La condizione per Star Trek dovrebbe essere, quando il soggetto è nell'arena per due secondi, per uno stato automatico del tracciamento quando il mouse è nell'arena.
Per creare una sottoretità per la stimolazione della luce, vai alle strutture, di più e seleziona la sottoretia. Posizionarlo sotto la regola principale e stendere le due caselle. Vai a condizioni, tempo e dagli un nome come luce su uno, regola le condizioni che si incontra dopo cinque minuti.
Posizionare la casella direttamente dietro la casella di inizio della regola della sotto regola. Vai all'hardware personalizzato d'azione e denominalo con la luce su uno. Selezionare l'azione da eseguire come:Ne metterò uno alto.
Posizionare la scatola direttamente dietro la casella delle condizioni. Ripetere i passaggi per programmare la luce su in luce. Ora vai alle strutture, sottoreti di riferimento e controlla che il riferimento appartenga alla sotto regola corretta.
Scegliere le condizioni di inizio come senza indugio e le condizioni di inizio come eseguite una volta per condizione iniziale. Posizionare la casella di riferimento tra i libri extra uno e i libri delle condizioni due della regola principale. Ora definisci le impostazioni di rilevamento per mostrare al sistema cosa dovrebbe tenere traccia.
Posiziona un'miglia di prova nell'arena e seleziona la configurazione automatizzata. Scegli il roditore come tipo animale e usa il cursore del mouse per disegnare una scatola intorno ai topi nell'arena. Conferma i risultati della domanda di cura con sì.
Per l'esperimento a campo aperto, portare il mouse sperimentale nella stanza del comportamento proprio prima dell'esperimento per garantire un adeguato livello di ansia. Accoppiare il mouse essere una fessura della sorgente luminosa premendolo delicatamente sulla griglia della gabbia. Mettilo in una gabbia d'attesa con lettiera fresca per 10 minuti per acclimatarlo al cavo leggero.
Inizia l'acquisizione premendo il pulsante di arresto e ti per visionare XT. Trasferire il mouse dalla gabbia di attesa nell'angolo superiore sinistro del campo aperto. Lasciare il campo visivo del mouse durante l'esperimento e mantenere la calma. Dopo 20 minuti, al termine dell'esperimento, rimuovere il mouse dal labirinto, scollegare il cavo luminoso e rimetterlo nella propria gabbia.
Con una visualizzazione di controllo, le differenze nel tempo centrale tra la luce spenta e la luce sui volti possono essere viste direttamente. Il mouse trascorre meno tempo al centro quando la luce è accende. Per l'esperimento sul labirinto di Barnes, porta tutti i topi sperimentali nella stanza del comportamento circa un'ora prima dell'esperimento.
Prepara il labirinto barnes chiudendo tutti i fori tranne uno e ora quale scatola di fuga è posizionata. Collegare un mouse nella sorgente luminosa di entrambi gli impianti e posizionarlo direttamente nel mezzo del labirinto barnes. Premi start e devi visitare la prossima T e rimuovere la scatola di cartone.
Preparati a interrompere manualmente la prova nel caso in cui il software non riconosca l'intera transizione. Togliere il mouse dal labirinto e rimuovere il collegamento al cavo luminoso. Quando si esegue, si apprende e si indaga sull'attività di memoria, non solo viene studiato l'effetto immediato della manipolazione, ma anche l'effetto a lungo termine della manipolazione durante l'acquisizione, il consolidamento o il recupero.
Per l'analisi dei dati, si trova la condizione di trattamento trattata o controllata, si passa alla nidificazione e si seleziona lo stato del controllo di prova. Scegli l'intervallo di stato dall'azione dell'elemento Star Trek alla luce d'azione dell'elemento che si accende. Posizionare la casella di nidificazione tra il trattamento della scatola del filtro e la casella dei risultati corrispondente.
Questo intervallo definito è di uno. Ripetere i passaggi per intervalli su uno dei due e su due come anche per il gruppo di controllo. Definire anche i parametri da analizzare nel profilo di analisi.
Scegliere la variabile dipendente nella zona e selezionare il centro della zona, il punto del corpo, il punto centrale e passare alle statistiche di prova. Selezionare la frequenza, la durata cumulativa e lasciare che veda la prima. Aggiungere anche lo spostamento della distanza come variabile.
Con questo profilo, sono disponibili i dati per il tempo trascorso al centro, le voci del centro e gli viene detto di spostarsi a distanza. Per estrarre i dati da ogni divisione, passare ai risultati e selezionare statistiche e grafici, premere calcola per visualizzare i dati analizzati. Premere esporta i dati e selezionare le statistiche di valutazione e il percorso da salvare.
I dati esportati vengono salvati come file excel e con singoli valori per ogni mouse. Inoltre, vai alla visualizzazione della mappa termica e premi le mappe di calore della trama, seleziona le prove a destra per vedere le singole mappe di calore per ogni mouse e prova. Fai un clic con il pulsante destro del mouse ed esporta le mappe di calore come immagini.
Successivamente, aprire il file excel del computer e calcolare la media e gli euro standard SCM per tutte e quattro le prove e ogni gruppo di condizionamento misurato. Per generare grafici e plottaggio Sigma, copiate i mezzi e SCM nell'ordine corretto dal file aggiuntivo al plottaggio Sigma. Le righe devono contenere i dati per uno spento, uno su uno e le colonne contengono trial, mean e SCM hertz.
Selezionare tutte e tre le colonne e passare alla creazione di grafici. Selezionare la casella della barra e scegliere una casella non raggruppata con freccia. Etichettare l'intero grafico, andare a casa, selezionare la casella del grafico e premere esporta.
Selezionare la cartella di destinazione e scegliere metafile come formato. Per calcolare le statistiche per i dati ottenuti, copiare i dati giusti da Xcel uno contro uno, eccetera, e in singole colonne del plottaggio Sigma. Contrassegnare le colonne da confrontare e passare all'analisi, scegliere Test T e premere Esegui.
Infine, i dati comportamentali possono essere mostrati divisi in let off e in prova con una specializzazione aggiuntiva della mappa termica. Nell'esperimento a campo aperto, durante la stimolazione leggera di Channelrhodopsin2 e neuroni piramidali, la durata centrale è diminuita, il che indica un aumento dei livelli di ansia. Attraverso l'immunoistochimica, è possibile determinare il sito di iniezione e l'espressione del virus, anche alla specificità della speciale linea del topo cre-dipendente può essere convalidata.
Si può vedere chiaramente che la stimolazione della luce di Channelrhodopsin2 migliora i neuroni mentali di questa specifica regione della corteccia aumenta i livelli di ansia, rispetto all'ansia di base prima di quella stimolazione. Questo effetto immediato della manipolazione sul comportamento è il motivo per cui l'optogenetico viene utilizzato oggi per così tante domande di ricerca sul comportamento. Questa procedura può essere utilizzata per la modulazione optogenetica di qualsiasi tipo di cellula desiderata o circuito neuronale nel cervello del topo.
Combinando questa procedura con test comportamentali adatti per la tua ricerca, è possibile ottenere una visione più profonda dei circuiti neuronali coinvolti in comportamenti e malattie di interesse.
