Questo metodo consente una trasfezione efficiente delle colture cellulari 3D come gli organoidi. Varie applicazioni dell'ingegneria genetica possono essere facilitate. Il protocollo è universale e può essere eseguito entro un giorno.
Non ha bisogno di una preparazione estesa o di speciali tamponi di elettroporazione ad alta intensità di costi. Questo metodo di trasfezione è stato dimostrato nei tumori e negli organoidi sani, ma può essere adattato anche agli sferoidi e alla coltura cellulare 2D. Se si esegue questo protocollo per la prima volta, è importante gestire gli organoidi con cura a causa della loro proliferazione individuale e reazione alla dissociazione.
Monitorarli microscopicamente durante l'intera procedura. Inizia prewarming piastre di 48 pozzi a 37 gradi Celsius per la semina post elettroporazione, quindi prepara mezzi basali e organoidi specifici della coltura secondo le indicazioni manoscritte. Coltivare cinque pozzi di organoidi per campione di elettroporazione in una piastra da 48 porvili, preparare 230 microlitri di reagente di dissociazione con 10 micromolare Y-27632 per pozzo.
Monitorare gli organoidi al microscopio. Rimuovere il mezzo di coltura dai pozzi e dissociare meccanicamente gli organoidi nella miscela di dissociazione preparata. Mettere in piscina cinque pozzi per campione di elettroporazione in un tubo da 15 millilitri.
Mescolare il contenuto del tubo vortice e incubarlo per cinque-15 minuti a 37 gradi Celsius fino a quando non si verificano cluster da 10 a 15 cellule, controllando la dissociazione con un microscopio. Interrompere la digestione aggiungendo fino a 10 millilitri di mezzo basale senza antibiotici. Centrifugare il tubo a 450 volte g per cinque minuti, scartare il supernatante e lavare le cellule due volte con quattro millilitri di tampone di elettroporazione.
Centrifugare e scartare il supernatante dopo ogni lavaggio. Dopo i lavaggi, rimescolare il pellet organoide in 100 microlitri di tampone di elettroporazione con 30 microgrammi di DNA plasmide. Distribuire la miscela dna-organoide completa in una cuvetta di elettroporazione.
Assicurarsi di evitare bolle d'aria. Impostare i parametri di elettroporazione come descritto nel manoscritto di testo e toccare la cuvetta con un dito per mescolare delicatamente le celle. Posizionare la cuvetta nella camera di cuvetta e premere il pulsante di impedenza sull'elettroporatore per prendere nota del valore di impedenza.
Premere il pulsante Start per avviare il programma di elettroporazione e controllare i valori delle correnti, delle tensioni e delle energie visualizzate. Dopo l'elettroporazione, aggiungere immediatamente 500 microlitri di mezzo di coltura senza antibiotici alle cellule e mescolare pipettando su e giù. Trasferire il campione in un nuovo tubo da 15 millilitri e sciacquare la cuvetta con mezzo basale per raccogliere le cellule rimanenti, quindi incubare le cellule a temperatura ambiente per 40 minuti.
Centrifugare le cellule a 450 volte g per cinque minuti e scartare il supernatante. Resuspend il pellet in 100 microlitri di matrice seminterrata e gocce di semi da 20 microlitri in una piastra prebellica da 48 pozzetti. Incubare la piastra per 10 minuti a 37 gradi Celsius per la polimerizzazione e aggiungere 250 microlitri di mezzo di coltura integrati con Y-27632 e CHIR99021 per pozzo.
Per determinare l'efficienza di trasfezione, controllare la fluorescenza nel controllo della trasfezione al microscopio dopo 24-48 ore. Per l'analisi FACS, raccogliere le cellule come descritto in precedenza e digerire per 10-20 minuti fino a quando non sono presenti singole cellule. Aggiungere fino a 10 millilitri di PBS e centrifugare le cellule a 450 volte g per cinque minuti, quindi aspirare e scartare il supernatante.
Per discriminare le cellule viventi, rimescolare il pellet in un millilitro di PBS e aggiungere un anticorpo o uno ioduro di propidio adatto. Mescolare delicatamente le cellule toccandole e incubandole a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con 10 millilitri di PBS, quindi centrifugare e scartare il supernatante.
Rimescolare il pellet cellulare in 200 microlitri di PBS e filtrare la sospensione attraverso un filtro da 100 micrometri in un tubo FACS. Analizzare le celle con una macchina FACS utilizzando la strategia di gating appropriata e determinare l'efficienza di trasfezione. Gli organoidi di quattro diverse entità tumorali sono stati elettroporati almeno tre volte usando 30 microgrammi di un piccolo plasmide o di un grande plasmide.
Sono stati analizzati con citometria a flusso 48 ore dopo l'elettroporazione e gated per la forma cellulare, le singole cellule, le cellule viventi e l'espressione eGFP. In tutte e quattro le entità organoidi, il piccolo plasmide è stato transetto con una maggiore efficienza rispetto a quello più grande. La trasfezione più efficiente del piccolo plasmide è stata raggiunta negli organoidi PDAC con il 92,1% di cellule positive alla GFP, che il grande plasmide è stato trasfetto con un'efficienza del 46,7%Il plasmide più grande è stato trasfetto in modo più efficiente negli organoidi CRC con un'efficienza media del 53,4%, mentre il piccolo plasmide è stato trasfetto con un'efficienza media dell'84,3%L'entità più difficile da trasfetto erano gli organoidi del cancro gastrico , che ha dimostrato la più bassa efficienza di trasfezione per entrambi i plasmidi.
Come prova del concetto, gli organoidi dello stomaco normale umano sono stati elettroporati con una codifica plasmide per Cas9, GFP e 2sgRNAs che prendevano di mira TP53. I cloni sono stati selezionati dalla somministrazione di Nutlin3 e il knockout TP53 è stato confermato dal sequenziamento degli alleli. Come abbiamo dimostrato con gli organoidi dello stomaco umano, un'elettroporazione efficiente consente varie manipolazioni di base CRISPR Cas9 di colture organoidi, come knockout o knockins, in modo da poter modellare diverse malattie.
