Questo metodo può aiutare a determinare la distribuzione di base della cellula staminale lobitica dopo la consegna intranasale al cervello. Il principale vantaggio di questa tecnica è che facilita la consegna e il tracciamento non invasivi delle cellule staminali mesenchimali al cervello. Inoltre, i dosaggi multipli sono possibili per massimizzare gli effetti terapeutici delle cellule trapiantate nella fase cronica dopo le lesioni.
Questa tecnica massimizza il numero di cellule consegnate al sito di lesione e riduce al minimo la progressione della cellula lobitica in altri tessuti. Sebbene questa tecnica fornisca informazioni sull'uso di cellule staminali mesenchimali nelle terapie traumatiche per lesioni cerebrali, può anche essere utilizzata per l'indagine di lesioni cerebrali non traumatiche. Per l'etichettatura delle cellule staminali mesenchimali con ossido di ferro super paramagnetico, aggiungere sei millilitri di mezzo di etichettatura a una coltura di cellule staminali mesenchimali confluente dell'80% in un pallone T 75 per un'incubazione di 24 ore a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica.
Il giorno dopo, aspirare attentamente il super natale e lavare le cellule due volte con sei millilitri di PBS per lavaggio. Per determinare se le cellule sono state etichettate correttamente, controllare la coltura al microscopio florescente. Per indurre una lesione al CCI, dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale, utilizzare le tosaerba elettroniche per radere la pelliccia dalla superficie dorsale del cranio e pulire più volte l'area rasata con un batuffolo di cotone sterile imbevuto di iodio.
Utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di 70%etanolo per rimuovere lo iodio dopo l'ultimo tampone e posizionare l'animale in una cornice stereotassica. Fissare il mouse con le barre dell'orecchio e del naso e fare un'incisione midsagittale di 2,5 centimetri nella pelle rasata per accedere alla superficie del cranio. Utilizzare un batuffolo di cotone per rimuovere il tessuto che copre il cranio e pulire la superficie del cranio per 10 secondi con un batuffolo di cotone imbevuto di perossido di idrogeno al 3%.
Asciugare il cranio con un batuffolo di cotone fresco e utilizzare una matita per disegnare un cerchio di quattro millimetri intorno alle coordinate di scelta sull'osso esposto. Utilizzando un micro trapano dotato di un bur rotondo di 0,5 millimetri di diametro, assottigliare accuratamente il cranio al cerchio marcato senza applicare pressione. Rimuovere la polvere ossea con un batuffolo di cotone pulito e asciutto e utilizzare le forcep sterili depositate per rimuovere con cura il lembo osseo risultante.
Quando il dura mater è stato esposto, trasferire il mouse nel telaio stereotattico del dispositivo CCI e fissare l'animale con le barre dell'orecchio e del naso in modo che la testa sia livellata nella direzione rostrocaudale. Seguendo le istruzioni riportate sulla scatola di controllo, azzerare la punta del riflettore sulla superficie corticale esposta utilizzando le ruote di controllo X e Y sulla base del riflettore per allineare la punta del riflettore direttamente sopra le coordinate della corteccia desiderate da impartiare. Utilizzare la casella di controllo per impostare i parametri dell'esperimento su una velocità di cinque metri al secondo, un tempo di dimora di 250 millisecondi e una profondità di lesione di un millimetro per indurre una lesione lieve.
Quindi, premere il pulsante di impatto sulla casella di controllo. Tamponare qualsiasi sanguinamento che si verifica con un batuffolo di cotone sterile e rimuovere il mouse dal telaio. Chiudere l'incisione con suture chirurgiche di seta e applicare antibiotici topici sul sito prima di posizionare il mouse su una pastiglia riscaldante con monitoraggio fino a piena reclinata.
Un giorno dopo l'infortunio, trattare l'ossido di ferro super paramagnetico etichettato come coltura di cellule staminali mesenchimali con tre millilitri di tripparina. Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, iniziare la reazione con sette millilitri di mezzo DMEM preri riscaldato, integrato con siero bovino fettale al 10% e raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Sedimentare le cellule mediante centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet in PBS per il conteggio.
Quindi, regolare la concentrazione cellulare a 1,5 per 10 alle cinque celle per 18 microlitri di PBS. Per il parto cellulare, dopo aver confermato la mancanza di risposta al dito del dito, scruffare il mouse immobilizzando il cranio. Posizionare la punta di una pipetta contenente quattro unità di ialuronidasi per microlitro di PBS vicino al laccio del topo con un angolo di 45 gradi e somministrare tre microlitri di sospensione di ialuronidasi in ciascuna narice.
Posizionare l'animale a faccia in su su un tampone pulito per cinque minuti prima di ripetere il trattamento quattro volte per un totale di 100 unità di trattamento con ialuronidasi. Dopo l'ultimo trattamento, riposizionare il mouse sul pad per 30 minuti, prima di trattenere il mouse come appena dimostrato. Con la testa immobilizzata, somministrare tre microlitri della sospensione delle cellule staminali mesenchimali in ogni narice per un periodo di tre secondi per consegna della soluzione, tenendo il mouse in posizione per 30 secondi fino a quando le gocce del campione non sono completamente scomparse.
Dopo due minuti, ripetere la consegna fino a tre volte fino a quando non è stato consegnato l'intero volume della cellula staminale mesenchimale. Quindi, riportare il mouse nella sua gabbia con il monitoraggio fino alla piena rimisurata. Per monitorare la migrazione delle cellule staminali mesenchimali mediante risonanza magnetica, posizionare il mouse anestetizzato sul supporto di imaging dell'imager MR.
Quindi, fissare l'animale in posizione e spostare il supporto al centro della bobina di risonanza magnetica. Impostare il tempo di ripetizione su 1500 millisecondi e il tempo di eco su 2,8 millisecondi. Quindi, impostare il campo visivo su 16 per 16 millimetri, la matrice di acquisizione a 128 per 128 e lo spessore della fetta a 0,75 per 0,8 millimetri con quattro medie di segnale e un angolo di capovolgimento di 90 gradi per acquisire scansioni ponderate a stella T2 utilizzando una sequenza di eco di rotazione.
Dopo aver completato le scansioni, ritrarre il supporto del mouse dal centro della bobina della risonanza magnetica e riportare il mouse nella gabbia con il monitoraggio fino alla completa rimidulità. Per tenere traccia e quantificare le cellule staminali mesenchimali etichettate sulle immagini ponderate a stelle T2, aprire i dati nel software di snap del caso IT e selezionare l'etichetta attiva. Per creare segmentazioni delle aree di ipointense e della lesione o di altre parti cerebrali di interesse, utilizzando colori di etichetta diversi per ogni segmento.
Utilizzare lo strumento poligono nella barra degli strumenti principale per selezionare le aree di ipointense che rappresentano l'ossido di ferro super paramagnetico etichettato come cellule staminali mesenchimali e fare clic su accetta. Le aree segmentate appariranno nello stesso colore dell'etichetta attiva assegnata a quel particolare segmento. Quando tutte le fette sono state segmentate, utilizzare lo strumento bisturi per sviluppare una mappa 3D delle aree segmentate per rappresentare la distribuzione delle cellule staminali mesenchimali in tutto il cervello.
Per eseguire un'analisi quantitativa del volume e della media di intensità delle aree di ipointense segmentate che rappresentano le celle etichettate, fare clic sulla segmentazione e selezionare volume e statistiche. 24 ore dopo la consegna intranasale, le cellule staminali mesenchimali con ossido di ferro super paramagnetico etichettate come forti aree ipointense mediali alla lesione corticale sulle immagini ponderate a stelle T2, indicando la migrazione mirata dell'ossido di ferro super paramagnetico al sito della lesione. Questa migrazione rimane visibile fino a 14 giorni dopo la consegna senza alcuna notevole riduzione del segnale.
Gli animali feriti trattati con PBS non mostrano aree ipointense in nessun momento, indicando che le aree di ipointense osservate corrispondono all'ossido di ferro super paramagnetico etichettato come cellule staminali mesenchimali e non sono dovute a artefatti del segnale. La bio-distribuzione delle cellule staminali mesenchimali etichettate può essere vista usando la ricostruzione 3D, istologicamente mediante colorazione blu prussiana, o mediante rilevamento di florescence di ossido di ferro super paramagnetico taggato FITC all'interno delle cellule staminali mesenchimali etichettate. Assicurati di convalidare i risultati della risonanza prima di tutto con l'estologia o altri metodi.
Poiché le particelle super magnetiche di ossido di ferro possono rimanere nei tessuti dopo la morte della cellula, portando a falsi segnali positivi. Seguendo questa procedura, è possibile applicare un possibile tracciamento temperato non invasivo nella quantificazione per rispondere a domande riguardanti l'affinamento delle capacità e la ritenzione di cellule staminali mesenchimali nel cervello. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della medicina rigenerativa per esplorare metodi per migliorare la leccatura cellulare in aree specifiche del cervello.
