Questo protocollo facilita la corretta determinazione della struttura del dominio vincolante IKK di NEMO, nella sua forma non vincolata. E dettagli della sua produzione e cristallizzazione. Il protocollo, sfrutta questa stabilizzazione della conferma nativa del frammento di dominio di legame IKK di NEMO, attraverso adattatori a bobina arrotolato, che facilitano la cristallizzazione e la determinazione della struttura.
La biologia strutturale di NEMO, come obiettivo, fornisce un importante vantaggio nello sviluppo di inibitori NEMO per il trattamento di malattie infiammatorie e autoimmuni e cancro. Questo protocollo può essere esteso alla determinazione della struttura dei complessi NEMO, con inibitori peptidici o di piccole molecole per la scoperta o l'ottimizzazione di farmaci. Il ripiecuoteggio e la concentrazione proteica, durante la fase di produzione delle proteine, sono fondamentali per ottenere un dimero NEMO puro.
Limitare l'aggregazione e garantire la solubilità in condizioni di cristallizzazione. A dimostrare le procedure saranno Tamar e Amy, studenti laureati nel nostro laboratorio. Inizia aggiungendo 20 millilitri di fantastica soluzione di brodo.
E 20 microlitri di una soluzione stock di ampicillina da 100 milligrammi per millilitro. A un pallone Erlenmeyer da 125 millilitri. Seguito da alcuni microlitri di stock di glicerolo cellulare, dallo stoccaggio di 80 gradi Celsius, di cellule competenti BL21DE3.
Trasformato con vettore. Dopo aver scosso la coltura iniziale durante la notte, a 37 gradi Celsius e 220 rotazioni al minuto, diluire le cellule a un OD600 di 0,1 e 250 millilitri di brodo terrificante. E aggiungere ampicillina a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro.
Quando l'OD600 della coltura raggiunge 0,8 a 1, aggiungere IPTG alla coltura, a una concentrazione di 500 micromolari. E far crescere le cellule per quattro ore, a 37 gradi Celsius, fino a quando l'OD600 raggiunge i sei-10. Alla fine dell'incubazione, sedimentare le cellule per centrifugazione.
E sospendere di nuovo il pellet in 40 millilitri di tampone di lysis. Dividere le celle ri-sospese in due aliquote da 20 a 25 millilitri. E usa una pressa francese per applicare circa 25.000 libbre per pollice quadrato di pressione alle cellule, da due a tre volte per aliquota, in una stanza fredda.
Quindi, aggiungere l'urea ai lire cellulari, ad una concentrazione finale di otto molari. E incubare la soluzione cellulare su una piattaforma a dondolo per due o 16 ore, a temperatura ambiente. La mattina dopo, trasferire i lire in tubi ultra-centrifuga, ad almeno tre quarti pieni, per tubo.
E la centrifuga di Ulrta, per 45 minuti. Decantare i supernatanti in un tubo conico da 50 millilitri. E caricare il supernatante incubato dall'urea su una colonna IMAC, a tre millilitri al minuto.
Quando tutti i supernatanti hanno attraversato la colonna, lavare la colonna per 10 volumi di colonna, con buffer di associazione, a tre millilitri al minuto. Ed eseguire l'eluizione gradiente della proteina NEMO-EEAA da 10 a 500 millimolare imidazolo, su un gradiente di volume di 12 colonne. Raccolta di un millilitro aliquote dell'eluato, in una piastra di raccolta delle frazioni.
Dopo l'analisi della pagina SDS, estrarre le frazioni contenenti la proteina bersaglio pura e misurare la concentrazione proteica con il saggio di Bradford, secondo il protocollo standard. Selezionare le frazioni eluse contenenti proteine. Per scindere il tag HIS6 e rimuovere l'imidazolo in eccesso dal campione, aggiungere la proteasi TEV, con un rapporto di peso da uno a 10, di proteina tev sciccata, al campione proteico bersaglio.
E dilatare il campione durante la notte in quattro litri di Tris da 20 millimolare. Cloruro di sodio millimolare da 150 millimolare e due soluzioni di DTT millimolare. La mattina seguente, caricare il campione NEMO-EEAA scisso TEV su una seconda colonna IMAC, a un millilitro al minuto.
Raccolta del flusso attraverso in una frazione millilitro, in una piastra di raccolta della frazione di 96 ciotole. Lavare la colonna con cinque volumi di Tris da 20 millimolare, cloruro di sodio 150 millimolare e soluzione di imidazolo millimolare, a un millilitro al minuto. Dopo l'ultimo lavaggio, elutare il TEV e zio ha uncleaved HIS6 NEMO-EEAA, con tre volumi di colonna di Tris da 20 millimolare, cloruro di sodio millimolare 150 millimolare, imidazolo millimolare e due soluzioni di DTT millimolare, in un pallone da 50 millilitri.
Estrarre il flusso attraverso le frazioni, contenente costrutto NEMO-EEAA sciccoso e concentrare il campione con un concentratore di cellule mescolate, a cinque millilitri. Dopo la dialisi notturna come dimostrato, caricare cinque millilitri del campione su colonne cromatografiche di esclusione di dimensioni di 16 millimetri per 60 centimetri. Ripetendo se necessario, in base al volume del campione.
A un millilitro al minuto, e a due Tris millimolare, cloruro di sodio 100 millimolare e due soluzioni di DDT millimolare. Dopo aver tirato le frazioni, corrispondenti al dimerico NEMO-EEAA, concentrare il campione nel concentratore di cellule mescolate, con una membrana di taglio del peso molecolare di tre kilodalton, ad una concentrazione finale di 113 micromolare. Quindi, aliquota la proteina per la conservazione a quattro gradi Celsius, per un massimo di un mese.
Per lo screening a matrice sparsa, aggiungere 60 microlitri di soluzione a matrice sparsa in ciascuno dei 96 pozzi di una piastra di cristallizzazione a due camere a goccia. Per la diffusione del vapore di seduta e goccia. E aggiungere la soluzione proteica a un drop setter robotico.
Successivamente, utilizzare un drop setter robotico, per erogare 100 nanolitri di soluzione proteica a 1,65 milligrammi per millilitro, in un rapporto uno a uno con soluzione di serbatoio in goccia uno, a un volume finale di 200 nanolitri. E aggiungete 66 nanolitri di soluzione proteica con 134 nanolitri di soluzione di serbatoio, ad un volume finale di 200 nanolitri in goccia due. Quindi, sigillare immediatamente la piastra con nastro di tenuta largo tre pollici.
Quindi, conservare i vassoi in una memoria di imager di cristallizzazione, a 20 gradi Celsius. Controllo automatico delle immagini raccolte, per la presenza di cristalli, a partire da due giorni dopo la conservazione delle lastre. Per la generazione di scorte di semi, trasferire l'intera goccia contenente il cristallo di interesse, in 50 microlitri di soluzione di condizione di cristallizzazione, nella fiala fornita, da un kit di generazione di semi.
E vortice il calcio del seme, con 20 secondi di pulsante e 10 secondi di riposo, per tre minuti. Quindi, diluire in serie il seme, con uno o 10 incrementi, fino a uno a 10.000. E conservare le diluizioni a quattro gradi Celsius, fino a un ulteriore utilizzo.
Da uno a due giorni prima della spedizione al sincrotrone, tagliare il nastro dalla parte superiore del pozzo, con il cristallo di interesse. E aggiungere 0,5 microlitri di soluzione di cristallizzazione contenenti 12%uno, due crioprotettivi DiO propano, direttamente al pozzo. Rimuovere delicatamente il cristallo con un anello criogenico.
Far scorrere il cristallo dal pozzo e conservare il cristallo contenente loop crio in un disco immerso nell'azoto liquido, fino alla spedizione per la diffrazione a raggi X. Dopo aver ricevuto i dati di diffrazione a raggi X, elaborare le intensità ridimensionate nel server STAR e ISO. Utilizzando una media di indicizzazione della cristallografia a raggi X, di 1,2 per la superficie limite di diffrazione per i dati.
E carica su Phoenix. Per determinare la struttura, usa la struttura a raggi X di GCN4 come modello di ricerca per la sostituzione molecolare, usando MRage a Phoenix. La struttura 4DMD, sarà definita come un insieme.
E la soluzione MRage si costruirà con successo nella porzione di struttura, corrispondente all'adattatore a bobina arrotolato terminale finale di NEMO-EEAA. al modello di ricerca, per entrambe le catene nel dimero. La proteina sopra espressa appare in una banda, a circa 14 kilodalton marcatore di peso molecolare, prima della prima purificazione della colonna IMAC.
E mostra una banda monomero e una banda di dimeri, rispettivamente a 14 e 28 kilodalton, dopo la prima eluizione. La scissione TEV è praticamente completa, dopo l'eluizione, attraverso la seconda colonna IMAC. Quasi interamente come un dimero, al peso molecolare previsto.
Cromatografia ad esclusione di dimensioni, mostra un singolo picco, eludendo tra 60 e 65 millilitri, che stanno rispondendo al dimero. Lo screening fine produce cristalli che possono essere utilizzati per produrre uno stock di semi per la produzione di cristalli NEMO-EEAA, per la raccolta dei dati. Qui vengono mostrati i profili rappresentativi di diffrazione dei cristalli NEMO-EEAA.
L'analisi strutturale della proteina NEMO-EEAA rivela una bobina arrotolato parallela irregolare omodimerica, lunga circa 175 angstrom. La regione regolare della bobina arrotolato, comprende la sequenza ideale di adattatori a bobina arrotolato, al capolinea finale. E i primi due eptadi della sequenza propria del NEMO.
Una bobina arrotolato regolare, è presente anche al capolinea C. A partire dal residuo NEMO 97 e comprendendo l'adattatore a bobina arrotolato ideale del terminale C. La struttura beta bound IKK, mostra una conferma della bobina arrotolato più aperta, per ospitare il ligando.
Con una spaziatura interelico più ampia da uno a 2,2 angstrom in questa regione. La struttura di un ligando in NEMO, offre un nuovo obiettivo per la progettazione di inibitori attraverso metodi computazionali. E per lo screening visivo di tasche di legame con librerie di piccole molecole.
Ora abbiamo un percorso per la cristallizzazione del costrutto NEMO ingegnerizzato in complesso con ligandi di piccole molecole. Aiutare nello sviluppo e nell'ottimizzazione di una nuova classe di inibitori.
