Questo potrebbe servire a rispondere a domande chiave su come sintetizzare le molecole DCAF con la neutralizzazione degli anticorpi mirati. Questa tecnica fornisce il modo più semplice per sintetizzare le molecole DCAF con un'alta produttività. Il mondo decide che le molecole DCAF hanno i potenziali interventi all'anticorpo in si occupa di malattie come la febbre dengue e la miastenia gravis.
Questo metodo può essere applicato ad altre molecole DCAF con epitopi diversi per colpire gli anticorpi affini. A dimostrare la procedura sarà Xue Bai, un tecnico senior del mio laboratorio. Per convertire la resina 2-cloro in resina di 2 cloro derivata dall'idrazina, dalla parte superiore del contenitore di sintesi peptidica, aggiungere cinque millilitri di DMF agli 0,25 millimoli di resina 2-cloro.
Riposizionare il cappuccio, scuotere delicatamente il recipiente per 15 secondi e quindi scolarlo su un supporto di ferro. Ripetere il lavaggio DMF altre due volte. Quindi aggiungere cinque millilitri di DCM al recipiente, rimettere il cappuccio, scuotere delicatamente il recipiente per 15 secondi e quindi scolarlo su un supporto di ferro.
Ripetere il lavaggio DCM altre due volte, quindi ripetere il lavaggio DMF altre tre volte. Successivamente, aggiungere sei millilitri di concentrazione del 50% in volume di DMF su DCM per gonfiare la resina per 30 minuti e quindi scolarla. Ora trasferisci sei millilitri di concentrazione del 5% di volume di idrazina e DMF sul recipiente di reazione.
Posizionarlo sullo shaker a 120 giri/min e 30 gradi celsius per 30 minuti, quindi scolare la soluzione con pompa per vuoto. Per purificare la derivata idrazina di un peptide Fc-III, utilizzare il sistema HPLC per purificare il peptide con un'eluizione di allusione gradiente di 30 minuti ad una portata di un millilitro al minuto. Dopo la purificazione delle proteine secondo il manoscritto, aggiungere in un nuovo tubo due millilitri di un milligrammo per millilitro proteina taggata SUMO, un millilitro di proteasi SUMO, un millilitro di tampone di proteasi SUMO 10X e sei millilitri di acqua doppia distillata per preparare la soluzione di reazione.
Incubare la miscela per 12-16 ore a quattro gradi Celsius. Quindi aliquotare la miscela in otto tubi Eppendorf da 1,5 millilitri e centrifugare la miscela a 15.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi celsius. Utilizzare una pipetta per scartare gli aggregati nella parte inferiore, quindi nei supernaganti cancellati da 10 millilitri, aggiungere 0,5 millilitri del liquame di perline NTA al 50% di nichel in PBS da 50 millimolare.
Posizionare il tubo su uno shaker rotante a 200 giri/min e quattro gradi celsius per mescolare delicatamente per 60 minuti. Quindi, caricare la lisade e la miscela di nichel NTA in una colonna con il tappo di uscita inferiore. Rimuovere il cappuccio inferiore e salvare il flusso attraverso un tubo di centrifuga da 15 millilitri.
La proteina HIS TAG SUMO si lega sulla colonna. La parte antigene del linker, che inizia con la CSI per la reazione di legatura chimica nativa, è nel flusso attraverso. Ora pesa 1,8 milligrammi di derivato dell'idrazina di un peptide Fc-III in un tubo Eppendorf a due millilitri e aggiungi 0,8 millilitri di cloruro di guanidinio molare in soluzione di fosfato monosodico molare a pH 3.
Vortice per sciogliere la polvere. Dopo aver centrifugato il tubo a 7.200 volte G per un minuto a temperatura ambiente, trasferire il supernatante in un nuovo tubo. Aggiungere una barra di agitazione nel tubo e mettere il tubo in un bagno di sale ghiacciato su un agitatore magnetico per agitare delicatamente la soluzione per 15 minuti.
Quindi aggiungere 40 microlitri di nitrito di sodio molare 0,5 alla soluzione per ossidare il gruppo dell'idrazina. Agitare delicatamente la soluzione per altri 15 minuti nel bagno di sale ghiacciato. Pesare 11 milligrammi della parte antigene del linker purificato e liofilizzato HPLC e 13,6 milligrammi di MPAA nel tubo di reazione nel bagno di sale ghiacciato.
Mescolare per cinque minuti e quindi regolare il valore del pH a 6,8 a 7,0 a temperatura ambiente temperata con sei idrossido di sodio molare. Il passo più critico per la legatura chimica nativa è quello di regolare attentamente il valore del pH per avviare la reazione di legatura. Dopo 12 ore nel bagno di sale ghiacciato, aggiungere 0,4 millilitri di soluzione neutra TCEP molare al sistema di reazione e mescolare per 20 minuti per terminare la reazione.
Dopo la centrifugazione e la purificazione HPLC, ottenere il picco coniugato III per la desolforazione. Sciogliere in 50 microlitri di cloruro di guanidinio molare in soluzione di fosfato monosodico molare 0,2. Aggiungere quindi 50 microlitri di un TCEP molare, 10 microlitri di tert-butiltiolo e cinque microlitri di VAO molare 0,1 per quattro soluzioni.
Regolare il pH finale della soluzione a 6,9 e mantenere la soluzione a 37 gradi Celsius su uno shaker per circa cinque ore. Centrifugare e purificare di nuovo. Sciogliere il peptide preparato in 200 microlitri di acetato d'argento millimolare, quindi mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per quattro ore.
Per convertire i tiolati d'argento sul peptide in tioli liberi, aggiungere tre microlitri di un DTT molare in sei cloruro di guanidinio molare e 0,2 fosfato monosodico molare a pH 7. Aziona lo spettrometro di massa in modalità di scansione completa e imposta l'intervallo m/z da 300 a 2.000 e la risoluzione a 60.000. Aprire i dati degli spettri di massa e trovare i picchi del prodotto in ogni fase per confermare che la reazione chimica viene eseguita con successo.
Per eseguire il test ELISA dell'interazione tra anticorpo DCAF1 e 4G2, rivestire ogni pozzo di una piastra di microtitolo da 96 porri con un picomolo di anticorpo anti-GST in 100 microlitri di tampone di rivestimento. Sigillare la piastra con nastri di tenuta e incubarla a 4 gradi Celsius durante la notte su uno shaker. Al mattino bloccare ogni bene con 200 microlitri di 1%BSA e PBS.
Sigillare il piatto e incubarlo in camera temperata per un'ora su uno shaker. Quindi utilizzare PBS con 0,05%Tween 20 per lavare ogni bene quattro volte. In questo protocollo è stato utilizzato il metodo di legatura chimica nativa per la semisintesi della molecola DCAF1.
Lo spettro di massa mostra che la molecola finale di DCAF1 ha un peso molecolare deconvoluzionale di 11.053. Durante il test ELISA, il peptide antigene Fc-III e DCAF1 inibiscono in modo competitivo il legame anticorpale 4G2. Sia il peptide antigene che il DCAF1 bloccarono significativamente il legame 4G2, mentre il peptite Fc-III non influenzò l'interazione dell'anticorpo antigene.
Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada a un intervento di malattie dannose associate agli anticorpi. Molte delle regioni utilizzate per la sintesi peptidica e la legatura chimica nativa sono altamente tossiche. Assicurati di fare questi esperimenti nella tua cappa chimica.
