Questo protocollo aiuterà i ricercatori a generare un nuovo tipo di modello di topo per ricapitolare lo sviluppo del cancro al seno umano da diversi sottoinsiemi di cellule epiteliali mammarie. Questa tecnica consente ai ricercatori di generare modelli di topi del cancro al seno nel tessuto dello stadio di sviluppo in modo specifico di tipo cellulare e senza la necessità di un allevamento estensivo di topi. Per iniziare questa procedura, generare, mantenere e anestetizzare topi flox come descritto nel protocollo di testo.
Portare il mouse in un'area separata da dove deve essere eseguito l'intervento chirurgico. Dopo aver confermato l'anestesia eseguendo un pizzico di dito, iniettare Meloxicam come analgesia per via sottocutanea a una dose di cinque milligrammi per chilogrammo per prepararsi alla procedura chirurgica. Esporre il sito chirurgico del capezzolo applicando diverse gocce di crema per la depilazione.
Rimuovere la crema eccessiva e i capelli sciolti con asciugamani di carta morbidi. La rasatura non è raccomandata per evitare danni ai capezzoli. Disinfettare il sito chirurgico con iodofori prima seguito dal 70% di alcol e terminare con un'applicazione finale di iodofori scrub.
Eseguire questa procedura con un movimento circolare dal centro dell'area di lavoro verso la periferia utilizzando una spugna di garza o un applicatore con punta di cotone. Ripetere il ciclo da tre a quattro volte. Utilizzare tecniche asettiche durante la procedura chirurgica.
Fai un sito di incisione sulla pelle a una lunghezza di circa un centimetro tra le due quattro ghiandole mammarie inguinali. Separare accuratamente il lembo della pelle dal peritoneo parietale in modo da visualizzare l'albero duttale mammario. Tenere con cura il capezzolo con le pinza degli orologiai per rimuovere il capezzolo esterno senza tagliare la pelle vicina usando una forbice a microdisezione.
Caricare da tre a cinque microlitri della miscela di iniezione di Cre-adenovirus in una siringa Hamilton da 25 microlitri con un ago del mozzo metallico calibro 33 apposto. Stimare il volume della miscela di iniezione nella siringa in base al colorante blu incluso nella miscela. Tenere delicatamente il bordo del lembo cutaneo con una pinzetta curva fine e iniettare lentamente la miscela di iniezione di Cre-adenovirus nel capezzolo mentre si monitora la diffusione del colorante blu nell'albero duttale mammario.
Mantenere la velocità di iniezione il più lentamente possibile per evitare danni al lume duttale. Un'iniezione intraduttale di successo è indicata da fluidi iniettati che si diffondono in tutto l'albero duttale senza perdite nel compartimento stroma. Ritirare delicatamente l'ago dal capezzolo per evitare perdite del fluido iniettato.
Esaminare il lato distale della ghiandola mammaria o l'area circostante del capezzolo iniettato. La diffusione del colorante nello stroma vicino come mostrato qui indica un'iniezione di cuscinetto di grasso mammario piuttosto che un'iniezione intraduttale di successo. Chiudere le ferite chirurgiche nella pelle con clip per ferite.
Rimuovere il mouse dall'anestesia e posizionarlo su una pastiglia di riscaldamento all'interno di una gabbia pulita per il recupero. Monitorare lo sviluppo del tumore mammario come descritto nel protocollo di testo. I topi femmine più giovani per i quali l'iniezione intraduttale può essere eseguita con successo sono quelli di circa tre settimane di età.
Sebbene per la maggior parte degli esperimenti di induzione tumorale mammaria, vengono utilizzati giovani topi femmine adulti. L'iniezione intraduttale con un volume maggiore della miscela di iniezione può essere eseguita nei topi femmine durante la gestazione precoce-media per colpire le cellule alveolari. Per indirizzare diverse sottopopolazioni di cellule epiteliali mammarie per l'induzione del tumore mammario, sono stati utilizzati per l'iniezione cre-adenovirus sotto il controllo di diversi promotori specifici del sottoinsieme di cellule epiteliali mammarie.
Ad esempio, il Cre-adenovirus sotto il controllo del promotore della cheratina 8 è stato utilizzato per colpire le cellule epiteliali mammarie luminali. Il cre-adenovirus sotto il controllo del promotore della cheratina 5 ha preso di mira il lignaggio basale che porta alla marcatura genetica solo delle cellule epiteliali mammarie basali. Per una femmina di topi omozigoti floxed P53 con un reporter ROSA26-YFP, l'iniezione intraduttale di cheratina 8 Cre-adenovirus ha portato allo sviluppo di tumori mammari diversi mesi dopo l'iniezione.
A causa dell'inclusione del reporter condizionale R26-Y, le cellule epiteliali tumorali erano tipicamente marcate dall'YFP e potevano essere rilevate dalla citometria del flusso. Le cellule possono essere arricchite dallo smistamento del flusso delle cellule positive YFP per ulteriori analisi. Le cose più importanti da ricordare quando si tenta questa procedura sono usare un piccolo volume di iniezione, iniettare lentamente e anche ritirare lentamente l'ago.
Seguendo questa procedura, si può monitorare la progressione delle cellule epiteliali mammarie positive YFP mirate alle fasi pre-maligne e tumorali per citometria del flusso o colorazione co-immunofluorescenza della ghiandola iniettata. Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori per studiare le cellule di origine del cancro al seno, come rispondono a diversi eventi autogenici e come progrediscono verso le cellule tumorali. Sia l'adenovirus che l'ago per iniezione sono potenzialmente pericolosi.
Pertanto, si dovrebbero sempre indossare guanti e utilizzare aghi e siringhe di sicurezza quando si esegue l'iniezione intraduttale.
