Lo studio di nuovi meccanismi di resistenza acquisiti contribuirà allo sviluppo di strategie terapeutiche più efficaci e sicure nei pazienti con cancro resistente agli agenti tumorali e resectabile. Sfortunatamente, i casi in cui la resistenza ai farmaci non è riuscita a svilupparsi non sono generalmente segnalati. Questo metodo di escalation della dose graduale è considerato la tecnica più affidabile per ottenere cellule a resistenza acquisita.
Per determinare l'appropriata concentrazione di resistenza all'afatinib, coltura di cellule PC-9 in mezzo di crescita in un piatto trattato in coltura cellulare di 10 centimetri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Rimescolare le cellule PC-9 a quattro volte-10-le-quattro cellule per millilitro di concentrazione media di crescita, e seduti le cellule a 50 microlitri di sospensione cellulare per pozzo in una micropiatta da 96 pozzetti. Dopo un'incubazione notturna nell'incubatore di coltura cellulare, trattare le cellule con 50 microlitri di soluzione di afatinib per pozzo, a sei repliche delle concentrazioni indicate e, dopo un'incubazione di 96 ore nell'incubatore di coltura di abbattimento, aggiungere 15 microlitri di colorante MTT ad ogni pozzo.
Dopo quattro ore nell'incubatore di coltura cellulare, aggiungere 100 microlitri di solubilizzazione / stop soluzione ad ogni pozzo e riportare la piastra all'incubatore durante la notte. La mattina seguente, misurare la densità ottica a 570 nanometri su un lettore di micropiastri. Per un'esposizione continua all'afatinib, coltura di cellule PC-9 in piatti P-100 contenenti 10 millilitri di mezzo di crescita fino a quando le cellule raggiungono la subconfluenza.
Trasferire le colture subconfluenti in tre nuovi piatti P-100 di nove millilitri di mezzo di crescita per piatto di coltura iniziale e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare. La mattina seguente, aggiungere 0,1 nanomolare, o 1/10 della concentrazione inibitoria semi-massima di afatinib, ad ogni set di tre piatti di coltura. Quando le cellule trattate con afatinib diventano subconfluenti, utilizzare una pipetta da un millilitro per mescolare accuratamente le colture e trasferire un millilitro di cellule da ogni piatto a nove millilitri di mezzo di crescita fresco in nuovi piatti P-100.
Aggiungere dal 10% al 20% di concentrazioni più elevate di afatinib alle nuove colture, aumentando la concentrazione di afatinib aumentando gradualmente l'escalation della dose ogni volta che le colture raggiungono la subconfluenza su un periodo di 10-12 mesi. Quando viene raggiunta una concentrazione di afatinib di un micromolare, eseguire il saggio MTT come dimostrato per confermare che le cellule hanno sviluppato resistenza all'afatinib. Per determinare la curva di crescita per le linee cellulari, coltura parental PC-9 e le tre linee cellulari resistenti agli afatinib nel mezzo di crescita nell'incubatore di coltura cellulare per 24 ore.
Rimescolare le cellule da ogni coltura a cinque volte-10-al-terzo cellule per millilitro di concentrazione media di crescita, e ospitare 12 100 microlitri replicati di ogni popolazione cellulare per pozzo in una micropiatta 96-ben. Quindi eseguire il test MTT nei giorni zero, uno, due, tre, cinque e sette di cultura come dimostrato, e tracciare i risultati utilizzando un programma software di analisi statistica appropriato. Per identificare le alterazioni nel recettore del fattore di crescita epidermico, o espressione genomica del DNA EGFR, mediante l'analisi della catena della transcriptasi polimerasi inversa, isolare il DNA genomico dalla coltura cellulare di interesse utilizzando un kit di purificazione del DNA secondo le istruzioni del produttore.
Misurare la concentrazione di concentrazioni di 25 nanogrammi-microliter del DNA genomico isolato su uno spettrofotometro. Quindi amplificare 50 nanogrammi di DNA genomico usando un mix di master verde SYBR, e analizzare i risultati utilizzando un sistema di rilevamento della reazione a catena della polimerasi della transcriptasi inversa basato sulla fluorescenza. Per identificare le alterazioni nell'espressione genomica del DNA EGFR sequenziando, amplificare il DNA genomico utilizzando primer specifici per esoni EGFR da 19 a 21.
Quindi purificare i prodotti PCR amplificati utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore e sequenziare gli ampliconi. Per identificare le alterazioni nell'espressione della proteina del recettore del fattore di crescita epidermico mediante analisi western blot, trattare le cellule con afatinib per 24 ore. Dopo 24 ore, lavare le colture cellulari due volte con cinque millilitri di PBS ghiacciato per coltura per lavaggio.
Lire le cellule nel tampone di dosaggio di radioimmunoprecipitazione, integrato con cocktail inibitore della proteasi all'1% e inibitori della fosfatasi cocktail due e tre per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, raccogliere i lisati per centrifugazione. Utilizzare il saggio dell'acido bicinchoninico per determinare la concentrazione proteica dei campioni di lisato.
Regolare i campioni proteici a 0,5, o a un microgrammo per concentrazioni di microliter, in tampone campione 4-X e far bollire i campioni a 96 gradi Celsius per cinque minuti. Per l'analisi western dei campioni, assemblare lastre e distanziali in vetro pulite con etanolo e caricare lo stampo con un gel di poliacrilammide all'8% con gli opportuni integratori sperimentali. Mentre il gel è polimerizzante, aggiungere la soluzione di gel impilamento a uno stampo appropriato, inserire il pettine e consentire al gel impilamento di polimerizzare per 20-30 minuti a temperatura ambiente.
Quando entrambi i gel si sono polimerizzati, posizionarli nell'apparato di elettroforesi e riempire il serbatoio con un tampone di corsa. Quindi caricare un volume da 20 a 30 microliter di ogni campione proteico in ogni pozzo ed eseguire il gel a 180 volt. Interrompere l'elettroforesi dopo circa 60 minuti, una volta che la parte anteriore del colorante esce dal gel, e lavare il gel con soluzione salina tris-tamponata, integrata con Tween, per uno o due minuti.
Trasferire le proteine su una membrana di fluoruro di polivinilidene mediante gonfiore semi-secco per una e 1/2 ore ad una corrente costante di 300 milliarti. Bloccare la membrana con latte secco non grasso al 5% diluito con soluzione salina tris-buffered più soluzione Tween per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, sondare la membrana con gli anticorpi appropriati di interesse a quattro gradi Celsius durante la notte.
La mattina seguente, lavare le membrane con tre lavaggi di 10 minuti di salina tris-tamponata fresca per lavaggio prima di esporre la membrana all'anticorpo secondario appropriato per una o una e 1/2 ore a temperatura ambiente. Quindi lavare la membrana cinque volte con una nuova salina tris-tamponata per lavaggio ed esporre la membrana a una soluzione di chemiluminescenza migliorata per la visualizzazione del segnale utilizzando pellicole. Qui viene illustrata la diminuzione osservata nella proliferazione cellulare delle cellule PC-9 parentali in risposta alle crescenti concentrazioni di afatinib, confermando che le cellule PC-9 sono sensibili all'esposizione all'afatinib.
Tuttavia, nessuna delle tre linee cellulari resistenti agli afatinib dimostra una soppressione della proliferazione cellulare sotto esposizione all'afatinib. Le linee cellulari resistenti agli afatinib mostrano curve di crescita significativamente più lente rispetto alle cellule PC-9 parentali. Le cellule resistenti agli afatinib esprimono livelli significativamente più elevati di DNA genomico EGFR ed espressione proteica EGFR rispetto alle cellule PC-9 parentali.
Il sequenziamento EGFR dimostra che le celle PC-9 presentano 15 eliminazioni di coppie di basi nell'esone 19 EGFR e EGFR di tipo selvaggio nell'esone 20. Le cellule a linea cellulare resistenti agli afatinib, tuttavia, mostrano un'amplificazione dell'esone 19 di tipo selvaggio EGFR. La linea cellulare resistente agli afatinib tre cellule contengono le stesse 15 eliminazioni della coppia di basi nell'esone 19 EGFR come nelle cellule PC-9, ma una mutazione puntiva in T790M è osservata nell'esone 20 EGFR.
La crescita cellulare può diventare piuttosto lenta quando la concentrazione dell'inibitore è vicina al valore IC-50. Non discutere di cultura, poiché la cellula continuerà a proliferare gradualmente. Queste strategie sono state sviluppate per imitare le condizioni in cui i pazienti oncologici sviluppano una resistenza clinicamente rilevante per valutare i meccanismi di resistenza acquisiti e sviluppare strategie terapeutiche sicure ed efficaci.
