Il tracciamento 3D a singola molecola può determinare le localizzazioni subcellulari e i comportamenti di movimento delle singole proteine. Osservare il movimento di una proteina in una cellula vivente fornisce importanti informazioni sulla sua interazione con i partner leganti nel suo ambiente nativo. Il metodo qui presentato fornisce un quadro generale per l'analisi dei dati di tracciamento a singola molecola per risolvere gli stati diffusivi delle molecole biologiche.
Può essere applicato sia a traiettorie 2D che 3D che sono limitate a volumi cellulari di forma arbitraria. Dopo aver depositato il tallone fluorescente in un cuscinetto di agarosio pre-preparato come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento, posizionarlo su una lapsus di copertura del microscopio e fissare la la scivolata di copertura al portacampioni del microscopio. Il portacampioni viene quindi montato su un microscopio a fluorescenza invertito.
Quindi inizializzare l'interfaccia utente grafica del microscopio;qui, il software scritto su misura in MATLAB viene utilizzato per il controllo dello strumento. Inizializzare il software della fotocamera HCImage Live. Nella scheda Acquisizione nella sezione Controllo fotocamera impostare il tempo di esposizione su 0,03 secondi, quindi fare clic su Live per iniziare un feed live della fotocamera.
Fare clic sull'apposito pulsante Apri laser sull'interfaccia GUI per sbloccare il laser ed eccitare le perline fluorescenti sul pad di agarosio. Visualizza l'emissione di fluorescenza sulla fotocamera utilizzando la modalità live-stream. Regolare le posizioni X e Y dello stadio del microscopio facendo clic sulle frecce XY-Position nella sezione Micro-Positioning Stage dell'interfaccia utente per posizionare almeno una perla fluorescente al centro del campo visivo.
Se necessario, modificare le dimensioni del passaggio facendo clic sulla casella a discesa sotto le frecce. Quindi regolate la posizione Z dello stadio del microscopio facendo clic sulle frecce di posizione Z sotto la sezione Fase di nano-posizionamento. Impostare l'orientamento della funzione di diffusione del punto a doppia elica della perla fluorescente in verticale.
Questo orientamento verticale è definito come il punto di partenza della calibrazione Z. Scansiona 30 passaggi sopra e sotto la posizione Z iniziale con incrementi di 50 nanometri. Registra 10 fotogrammi in ogni passaggio utilizzando un tempo di esposizione di 0,03 secondi.
Per avviare l'acquisizione automatica dei dati, fare clic su Vai in Calibrazione Z. Centrifugare un millilitro di coltura di Yersinia enterocolitica scioccata dal calore a 5.000 volte la gravità per tre minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere la coltura e scartare il supernatante. Lavare il pellet tre volte con un millilitro di mezzi M2G.
Dopo il risciacquo finale, rimescolare i batteri pelletti in 250 microlitri di mezzi M2G. Aggiungere quindi perline fluorescenti da utilizzare come marcatori fiduciari. La soluzione di perline fluorescenti deve essere aggiunta in modo che ci siano solo da una a due perline per campo visivo se visualizzate al microscopio.
Mescolare delicatamente la sospensione vortice per separare eventuali celle aggregate e piastra 1,5 microlitri della sospensione su un cuscinetto di agarosio dall'1,5 al 2% realizzato con M2G, quindi invertire il pad e posizionarlo su uno scivolo di copertura del microscopio pulito dall'ozono. Aggiungere una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo del microscopio e posizionare il portacampioni sullo stadio del microscopio e fissarlo in posizione. Inizializzare l'interfaccia utente grafica per controllare la fotocamera del microscopio, la fase di esempio e i laser di eccitazione, quindi inizializzare il software della fotocamera.
Nella scheda Acquisizione nella sezione Controllo fotocamera impostare il tempo di esposizione su 0,025 secondi e quindi fare clic su Live per iniziare un feed live della fotocamera. Regolare le posizioni X e Y dello stadio del microscopio facendo clic sulle frecce XY-Position nella sezione Micro-Positioning Stage per scansionare intorno al campione e trovare un campo visivo con una popolazione adeguatamente densa di cellule batteriche. Per massimizzare la velocità effettiva dei dati, la densità cellulare sullo slittamento del coperchio dovrebbe essere il più alta possibile senza che le celle si sovrappongano o si tocchino.
Il campo visivo dovrebbe includere anche almeno una perla fluorescente come marcatore fiduciario in modo che lo spostamento dello stadio possa essere misurato mentre i dati vengono acquisiti. Quindi regola la posizione Z dello stadio del microscopio facendo clic sulle frecce della posizione Z sotto la sezione Fase di nano-posizionamento in modo che i lobi a doppia elica a doppia elica a funzione di diffusione siano verticali. Quindi passare a Sequenza e selezionare Impostazioni di scansione.
Impostare il numero di conteggi dei fotogrammi su 20.000. Scegliere quindi una cartella di destinazione di salvataggio facendo clic sul pulsante etichettato con tre puntini. Infine, fare clic su Inizia per raccogliere fino a 20.000 fotogrammi della fotocamera utilizzando un breve tempo di esposizione di 0,025 secondi.
Al termine, bloccare l'illuminazione laser facendo clic sul pulsante Chiudi laser appropriato nell'interfaccia utente grafica. Quindi raccogli 200 fotogrammi di immagini scure usando lo stesso tempo di esposizione. Selezionare la casella accanto al LED Thorlabs, quindi fare clic su Attiva/disattiva specchio su.In questo modo la luce LED verrà attivata sopra il campione e il microscopio dal percorso di fluorescenza alla via di contrasto di fase.
Inizializzare il software di acquisizione dati nel percorso di contrasto della fase e premere il pulsante Start/Stop Live Display per visualizzare un feed live dalla fotocamera. Quindi fare clic su Acquisisci e vai per salvare l'immagine per raccogliere un'immagine di contrasto di fase delle celle nel campo visivo corrente. Montare il tallone fluorescente per l'uso come marcatore fiduciario.
Trova e adatta tutte le localizzazioni e tutti i fotogrammi della fotocamera usando le soglie del modello come descritto nel protocollo di testo. Nella sezione Localize DHPSF SM della GUI Easy-DHPSF fare clic su Esegui per adattare i segnali a singola molecola, quindi fare clic su OK nelle seguenti finestre popup per mantenere le impostazioni predefinite. Il software troverà segnali di fluorescenza a singola molecola che assomigliano alla funzione di diffusione del punto a doppia elica e quindi tenterà di adattarli usando un modello a doppia gaussiana.
Durante l'esecuzione dello script, l'utente vedrà una visualizzazione dei dati grezzi dell'immagine e un'immagine ricostruita dei segnali a singola molecola montati con successo. Utilizzando un software scritto su misura in MATLAB, iniziare selezionando manualmente cinque coppie di punti di controllo nella finestra popup stimando e facendo clic approssimativamente sui poli cellulari delle stesse cinque celle sia nei dati di localizzazione a singola molecola che nei contorni delle celle. Eliminare le celle contenenti meno di 10 localizzazioni e rimuovere le celle posizionate parzialmente al di fuori del campo visivo, quindi eliminare eventuali celle indesiderate aggiuntive nella finestra popup facendo clic all'interno del contorno della cella.
Infine, assegnare a tale cella localizzazioni che risiedono entro il limite del contorno di una cella. Eliminare eventuali localizzazioni che non si trovano all'interno di alcun contorno di cella. Un fattore critico per il successo dell'applicazione di questo protocollo è garantire che i segnali a singola molecola siano ben separati l'uno dall'altro.
Se c'è più di una molecola fluorescenza in una cellula allo stesso tempo, allora la localizzazione può essere assegnata erroneamente alla traiettoria di un'altra molecola. Questo protocollo funziona per eliminare il problema di collegamento eliminando tutte le traiettorie per le quali sono presenti contemporaneamente due o più localizzazioni nella stessa cella. Pertanto, se i segnali a singola molecola sono troppo densi, una grande quantità di questi dati viene automaticamente scartata durante l'elaborazione.
A seconda dei livelli di espressione delle proteine di fusione etichettate fluorescentmente, è possibile generare da 200 a 3.000 localizzazioni per cellula. Queste localizzazioni possono produrre tra 10 e 150 traiettorie. Un gran numero di traiettorie sono necessarie per produrre distribuzioni ben campionare.
Qui è mostrato l'istogramma dei coefficienti apparenti di diffusione per quasi 80.000 traiettorie a singola molecola della proteina di secrezione Yersinia enterocolitica di tipo 3 YscQ etichettata con proteina fluorescente eYFP. L'YscQ si lega agli iniettori incorporati nella membrana con conseguente frazione di molecole, circa il 24% che non si diffondono, come indicato dalla distribuzione mostrata in nero. Le restanti molecole di YscQ si diffondono liberamente nel citosolo.
Durante il metodo qui descritto, si stabilisce che le molecole di YscQ non legate esistono in almeno tre distinti stati diffusivi. Questa conclusione è stata raggiunta adattando la distribuzione dei coefficienti apparenti di diffusione ad una libreria di distribuzioni simulate con coefficienti di diffusione noti. Quando si tenta di risolvere più stati diffusivi, è necessario raccogliere diverse migliaia di traiettorie a singola molecola per garantire che le distribuzioni apparenti del coefficiente di diffusione siano campioate molto bene.
Il tracciamento a singola molecola può essere eseguito in cellule di tipo selvatico o in mutanti a delezione genetica per determinare se specifici stati diffusivi si manifestano solo quando è presente un partner di legame molecolare. Risolvendo gli stati diffusivi delle proteine citosoliche e dei complessi proteici utilizzando il tracciamento 3D a singola molecola, i ricercatori possono determinare dove, quando e come si formano i complessi proteici oligomerici nelle cellule viventi. Lavorare con sorgenti laser ad alta potenza e agenti patogeni umani vivi può essere estremamente pericoloso.
Devono sempre essere seguiti adeguati protocolli di sicurezza laser e biosicurezza.
