Questo protocollo facilita l'isolamento dei sottoinsiemi di fibroblasti funzionalmente distinti dalla pelle umana mediante smistamento FAC in base all'espressione del marcatore della superficie cellulare. Per la prima volta, i fibroblasti papillari e reticolari possono essere isolati direttamente dalla pelle senza manipolazione in vitro. Questo è un enorme progresso rispetto ai metodi di isolamento precedentemente stabiliti che utilizzano colture di espianto.
I sottoinsiemi di fibroblasti dermici ospitano funzioni distinte in condizioni omeostatiche. Con questo strumento, è possibile indagare le differenze funzionali nelle patologie cutanee, tra cui il cancro o le malattie infiammatorie della pelle. Poiché la manipolazione del tessuto umano richiede una certa pratica per raggiungere rese cellulari soddisfacenti, vorremmo fornire una dimostrazione visiva per facilitare e accelerare questo processo.
Per preparare il derma a pieno spessore, posizionare un pezzo di pelle umana su una carta filtrante spessa con l'epidermide rivolta verso il basso. Tenere l'epidermide saldamente con le forcep e raschiare lo strato di grasso sottocutaneo con un bisturi. Quindi, affettare il tessuto in strisce larghe cinque millimetri prima di metterle in una piastra di Petri.
Per sessare il derma in strati papillari e reticolari, posizionare un pezzo di pelle su una spessa carta filtrante con l'epidermide rivolta verso l'alto. Tenere la pelle saldamente sui bordi con le forcep e affettare una sezione di spessore di 300 micrometri con un dermatoma elettrico. Trasferire il primo strato costituito da epidermide e derma papillare in una piastra di Petri.
Quindi, procedere immediatamente per separare l'epidermide e il derma o aggiungere 1x PBS per evitare che il tessuto si asciughi. Quindi, regolare il dermatoma su uno spessore di taglio di 700 micrometri e tagliare il derma rimanente. Posizionare la fetta superiore, definita come derma reticolare superiore, in una piastra di Petri separata.
Successivamente, raschiare via lo strato di grasso sottocutaneo con un bisturi dallo strato dermico reticolare inferiore residuo e scartarlo. Raccogliere il derma reticolare inferiore in un'altra piastra di Petri. Procedere immediatamente alla procedura di digestione enzimatica o aggiungere 1x PBS per evitare che il tessuto si asciughi.
Per eseguire la digestione enzimatica, posizionare le strisce cutanee di cinque millimetri o il derma epidermide /papillare con l'epidermide rivolta verso l'alto in una piastra di Petri con 10 millilitri della soluzione enzimatica dissociante. Quindi, incubare la piastra di Petri a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione, trasferire l'epidermide/derma papillare nel coperchio della piastra di Petri.
Separare l'epidermide dal derma superiore con due forcep, ognuna delle quali tiene il bordo del derma. Successivamente, tritare ogni strato dermico nel modo più completo possibile. Più piccoli sono i pezzi, migliore è la digestione dei tessuti.
Quindi, preparare il mix di digestione. Trasferire il tessuto tritato con 10 millimetri della miscela di digestione preparata in un tubo da 50 millimetri. Incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per un'ora sotto agitazione.
Invertire il tubo più volte durante la digestione. Per preparare una sospensione a una cellula, interrompere la digestione enzimatica dei tessuti aggiungendo 10 millilitri di mezzo fibroblasto al tessuto digerito sul ghiaccio. Quindi, versare il contenuto di ogni tubo attraverso un normale colino sterile per tè inossidabile e raccogliere la sospensione cellulare in una piastra di Petri pulita.
Lavare il colino con mezzo e schiacciare i pezzi di tessuto non digeriti con il bordo di uno stantuffo per siringhe. Successivamente, pipettare la sospensione cellulare raccolta attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo da 50 millilitri. Risciacquare il filtro cellulare con il mezzo e raccogliere il flusso attraverso lo stesso tubo.
Quindi, centrifugare il tubo a 500 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il supernatante e lavare il pellet cellulare con cinque millilitri di mezzo fibroblasto. Ripetere nuovamente il passaggio di centrifugazione.
Successivamente, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro del tampone di lysis degli etitrociti ACK. Lasciare le cellule in tampone dilisi per circa un minuto a temperatura ambiente. Quindi, interrompere la lisi aggiungendo nove millilitri di 1x PBS con 10%FCS.
Centrifugare nuovamente il tubo a 500 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti e scartare successivamente il supernatante. Dopo che le cellule sono state macchiate per lo smistamento FAC seguendo protocolli standard, ordinare tre sottopopolazioni di fibroblasti in tubi di microcentrifugo separati riempiti con 350 microlitri di tampone di lysis per l'isolamento dell'RNA o 350 microlitri di mezzo di crescita dei fibroblasti per la coltura cellulare. Invertire immediatamente i tubi e mettere i tubi tampone di lisi in azoto liquido o mettere i tubi medi di crescita dei fibroblasti sul ghiaccio.
Dopo FACS, ruotare le cellule verso il basso a 500 volte g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, placcare una quantità uguale di cellule nel mezzo di crescita dei fibroblasti in un piatto di coltura cellulare di 24 po 'e lasciarle crescere fino a raggiungere il 70% di confluenza. Quindi, sostituire il mezzo cellulare coltivato con il mezzo di differenziazione degli adipociti e lasciare che le cellule si distinguano per 14 giorni.
Al giorno di differenziazione 14, fissare le celle con 4%PFA per 20 minuti. Lavare i pozzi con il 60% di isopropanolo e lasciarlo evaporare completamente. Quindi, macchiare le cellule con cinque millimolari di olio filtrato Rosso O per 20 minuti.
Dopo 20 minuti, lavare le celle macchiate quattro volte con acqua distillata. Immagini le cellule immerse nell'acqua con un microscopio invertito con ingrandimento 10x con luce trasmessa. Questo protocollo consente l'identificazione di tre popolazioni di fibroblasti nella pelle umana, che presenta diverse localizzazioni intradermiche, profili di espressione genica e funzioni.
I CD90 negativi fap sono arricchiti nel derma papillare, mentre il CD90 positivo fap e il FAP-negativo CD90-positivo sono più abbondanti nel derma reticolare. Tutte e tre le sottopopolazioni ordinate mostrano la tipica morfologia dei fibroblasti sulla coltura per sette giorni. È interessante notare che si comportano in modo diverso in un saggio di adipogenesi.
Dopo 14 giorni di coltura, i CD90 negativi FAP non si differenziano in adipociti, mentre i CD90 positivi fap e i CD90 negativi FAP-positivi subiscono prontamente l'adipogenesi. La profilazione dell'espressione genica mostra che le cellule CD90-negative fap-positive esprimono alti livelli di marcatori comunemente attribuiti ai fibroblasti papillari, come CD26, NTN e PDPN, mentre le cellule CD90-positive esprimono i marcatori reticolari noti, come CD36, actina muscolare liscia e PPAR-gamma ad alti livelli. Concludiamo che le cellule FAP-positive CD90-negative appartengono alle cellule papillari e CD90-positive appartengono al lignaggio reticolare.
La digestione funziona meglio se i pezzi dermici vengono accuratamente tritati e incubati in una quantità sufficiente di mezzo di digestione. I sottoinsiemi di fibroblasti dermici sono funzionalmente diversi. Esplorare la loro funzione nel contesto della patogenesi della malattia spianerà la strada a nuovi interventi diagnostici e terapeutici.
