Qui presentiamo un sistema automatizzato basato sulla tomografia a coerenza ottica o OCT. Questo ci permette di monitorare la struttura dei biofilm su grandi scale spaziali o lunghi periodi di tempo. L'imaging OCT è adatto per risolvere strutture nell'intervallo del micrometro, tuttavia è attualmente limitato a un'area massima di circa 250 millimetri quadrati.
I biofilm spesso superano questa scala, specialmente quando la differenziazione è guidata da gradienti ambientali su larga scala. La configurazione sperimentale ci permette di monitorare la morfogenesi tridimensionale dei biofilm su grandi scale spaziali e lunghi periodi di tempo. Il sistema è veloce, preciso e funziona in modo autonomo.
Abbiamo studiato la morfogenesi dei biofilm nei flussi in cui guidano importanti processi ecosistemici. Tuttavia, il sistema può essere utilizzato per studiare biofilm in altri sistemi naturali o ambienti ingegnerizzati. Il software per il posizionamento, l'acquisizione di immagini e l'analisi è scritto in Python.
Sono disponibili tramite jupyter notebook. Si tratta di soluzioni facili da usare, liberamente disponibili e flessibili. Crediamo che la rappresentazione visiva della configurazione aiuti altri utenti a riprodurre l'installazione e a comprendere meglio il software.
Speriamo che questo ispiri altri ricercatori ad adottare approcci simili. Ecco una panoramica dell'installazione. Il sistema è composto da un dispositivo di posizionamento di precisione, la sonda OCT, ed è assemblato attorno a un flume in plexiglass.
Inizia collegando il dispositivo di posizionamento seguendo insieme alle istruzioni pubblicate su GitHub. Una volta connesso, installare il server GRBL come descritto in una pagina GitLab separata. Il sistema di posizionamento può ora essere controllato attraverso questa pagina web;in alternativa può essere controllato attraverso uno script Python come mostrato nell'esempio lavorato.
Posizionare il computer e l'unità di base dello Strumento di personalizzazione di Office su un banco accanto alla configurazione sperimentale contenente dispositivi microfluidici, camere di flusso, fumi o sistemi di filtrazione. Se non è già installato, installare il sistema dello Strumento di personalizzazione di Office insieme al software disponibile come descritto dal produttore. Quindi installare i pacchetti software per l'acquisizione automatica della scansione dello Strumento di personalizzazione di Office come descritto nei documenti GitLab collegati qui.
Per iniziare l'acquisizione dell'immagine, montare la sonda tomografica a coerenza ottica sul dispositivo di posizionamento utilizzando un supporto a coda di rondine compatibile. Se necessario, installare un adattatore ad immersione sull'obiettivo, quindi alimentare il sistema dello Strumento di personalizzazione di Office e il dispositivo di posizionamento. Aprire il software dello Strumento di personalizzazione di Office commerciale, individuare un sito di interesse, concentrarsi sul campione e regolare il braccio di riferimento e l'intensità della sorgente luminosa per una qualità dell'immagine ottimale.
Prendete nota delle coordinate e ripetete questa procedura per un certo numero di posizioni mantenendo la stessa lunghezza e intensità del braccio di riferimento. Aprire ImageAcquisition. ipynb trovato nel file complementare 2 di questo articolo nel quaderno Jupyter.
Ogni cella contiene codice per eseguire attività specifiche e può essere eseguita separatamente premendo Cella, quindi Esegui o Controlla e Invio o Invio e Invio. Seguire l'esempio elaborato per impostare il percorso delle librerie necessarie per collegare il dispositivo di posizionamento per calibrare il dispositivo di posizionamento per inizializzare lo scanner dello Strumento di personalizzazione di Office. Quindi regolare i parametri di acquisizione, incluso l'indice di rifrazione, le dimensioni del campo visivo e il numero di scansioni A per scansione B.
Inoltre, impostare i limiti del segnale della scansione dello Strumento di personalizzazione di Office in base agli istogrammi di intensità delle scansioni preliminari e alla cartella di destinazione per i dati e i metadati acquisiti. A seconda del campo visivo e della risoluzione, le dimensioni del file possono raggiungere fino a 1,5 gigabyte per scansione dello Strumento di personalizzazione di Office. Questi due parametri determinano la dimensione dei voxel nel set di dati finale e le dimensioni del file di output.
Dovrebbero corrispondere alla risoluzione ottica della sonda OCT. Come evidenziato nell'esempio elaborato, è possibile acquisire una singola analisi dello Strumento di personalizzazione di Office con parametri predefiniti o acquisire una singola scansione specificando un set diverso di parametri. È inoltre possibile fornire coordinate specifiche per spostare il dispositivo di posizionamento e acquisire una singola scansione dello Strumento di personalizzazione di Office.
Questa funzione consente di tornare ripetutamente nella stessa identica posizione nell'esperimento con un'elevata precisione spaziale. I dati vengono salvati in 8 bit. formato non elaborati per risparmiare spazio di archiviazione.
I metadati, incluse le impostazioni e le coordinate dello Strumento di personalizzazione di Office, vengono salvati nella stessa cartella in un file json con la stessa convenzione di denominazione. In alternativa, specificare un elenco di posizioni di interesse e acquisire automaticamente le rispettive scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office. Al fine di caratterizzare le strutture morfologiche del biofilm attraverso grandi gradienti ambientali, acquisire scansioni in un motivo a mosaico.
Per questo, specificare il numero di riquadri adiacenti con una sovrapposizione predefinita del 30%Le scansioni non elaborati dello Strumento di personalizzazione di Office appaiono distorte. Ciò è dovuto alle differenze nella lunghezza del percorso attraverso il sistema ottico. Abbiamo sviluppato un algoritmo che corregge questa distorsione come mostrato negli esempi lavorati.
Per iniziare la correzione dell'immagine, aprire il notebook Jupyter ImageProcessing.ipynb. Seguendo questo esempio, ritagliare prima le scansioni oct per escludere segnali spuri e riorientare il set di dati in modo che il biofilm appaia sopra il substrato. Successivo corretto per l'aberrazione sferica.
A tale scopo, l'algoritmo localizza una superficie piana altamente riflettente nell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office e la utilizza come riferimento per appiattire le scansioni. Attraverso una griglia 20 per 20, l'algoritmo identifica quindi i massimi locali nell'intensità del segnale per localizzare la superficie di riferimento. Quindi una superficie polinomiale di secondo ordine viene montata su questi punti e utilizzata per spostare ogni pixel della scansione OCT in direzione Z.
I parametri di questo algoritmo devono essere regolati in base alle caratteristiche della scansione dello Strumento di personalizzazione di Office. Questa correzione consente una superficie di riferimento omogenea su più immagini e facilita quindi la cucitura di immagini su larga scala. Una volta appiattita l'immagine, le immagini vengono corrette per il rumore di fondo identificando un'area vuota dell'immagine sopra il biofilm e sottraendo l'intensità media dello sfondo.
Quindi calcola una mappa di elevazione dal set di dati dello Strumento di personalizzazione di Office 3D. A tale fine, definire una superficie di riferimento come il substrato e scegliere una soglia di intensità appropriata. Quindi viene eseguito il rendering di una mappa di elevazione con l'altezza del biofilm riportato come valore in scala di grigi.
Se le immagini sono state acquisite in un motivo a mosaico, cucire le rispettive mappe di elevazione applicando l'algoritmo di cucitura. Utilizzando l'imaging oct automatizzato, la morfogenesi spatiotemporale dei biofilm a flusso fototrofico è stata esaminata utilizzando esperimenti sui fumi. I flumes sono fatti di plexiglass e si allargano gradualmente dall'interno al deflusso.
Ciò si traduce in un gradiente nella velocità del flusso. Ecco una mappa di elevazione di un biofilm che cresce lungo l'intero gradiente di velocità del flusso. È importante sottolineare che il sistema automatizzato di imaging OCT consente una misurazione continua di parametri strutturali come lo spessore del biofilm, la rugosità e il biovolume in diverse condizioni di flusso che vanno dalla velocità a basso flusso alle condizioni di velocità ad alto flusso.
Insieme ai cambiamenti morfologici, il biovolume medio è diminuito significativamente in funzione della distanza dall'ingresso nel flume. La qualità delle scansioni oct dipende in modo critico dalla lunghezza del braccio di riferimento e dalla distanza di messa a fuoco. Potrebbe essere necessario riadattare questo parametro durante gli esperimenti.
Per garantire l'accuratezza del dispositivo di posizionamento, ricordarsi di eseguire regolarmente operazioni di homing. Questo dispositivo di imaging automatizzato può essere facilmente accoppiato con la profilazione del microsensore per una caratterizzazione funzionale dei biofilm. Oct è una tecnica di imaging emergente e prevediamo che il sistema qui presentato stimoli la ricerca sulla struttura del biofilm.
Ciò può essere rilevante per tecnologie come il trattamento dell'acqua potabile o il biotrattamento.
