Questo protocollo è significativo per due motivi principali. Numero uno, consente a un utente di essere in grado di determinare gli stati del ciclo cellulare delle cellule della pelle che sono state isolate da un modello animale. Ci permette anche di essere in grado di analizzare l'espressione proteica nelle fasi discrete del ciclo cellulare.
Rispetto ai precedenti metodi di determinazione della proliferazione cellulare, il nostro metodo consente una determinazione più precisa delle diverse fasi del ciclo cellulare, e possiamo anche analizzare più di 40 marcatori diversi nelle varie fasi della divisione cellulare. Ciò migliora notevolmente l'applicazione e la versatilità del metodo. Questo protocollo può essere utilizzato nella ricerca sul cancro e in qualsiasi altro tipo di malattia in cui è necessario determinare modelli specifici di espressione proteica del ciclo cellulare.
Inoltre, questo protocollo può essere modificato in altri tipi di cellule e in altri organismi modello. La prima volta che l'utente dovrebbe concentrarsi sul ottenere la migliore preparazione cellulare di qualità possibile. Ciò richiede la lavorazione tempestiva della pelle sperimentale utilizzando reagenti freschi, un tempo minimo di digestione dei tessuti e un attento smaltimento del supernatante dopo la centrifugazione per preservare l'integrità e la quantità delle cellule.
Per iniziare, progetta un pannello anticorpale con tag metallico utilizzando un software di progettazione di pannelli online gratuito, come descritto nel manoscritto. Quindi preparare una soluzione di stock idU sciogliendo la polvere idU a 10 milligrammi per millilitro in idrossido di sodio normale 0,1 a 60 gradi Celsius. Dopo aver aliquoto la soluzione stock idU in tubi a microcentrifugo, congelarli a meno 20 gradi Celsius per lo stoccaggio a lungo termine.
Immediatamente prima dell'uso, regolare il pH della soluzione IdU a 7,5 con 12 acido cloridrico normale e testare con una striscia di pH su un'aliquota di scarto per assicurarsi che la soluzione sia a pH 7,5. Per preparare una soluzione di fissaggio a due x paraformaldeide, combinare cinque millilitri di 10 x PBS e un millilitro di 16%PFA con 44 millilitri di pura acqua distillata di livello molecolare. Per preparare 100 millimolare soluzione di cisplatino, sciogliere 300,5 milligrammi di polvere di cisplatino in 10 millilitri di DMSO.
Per gli esperimenti da utilizzare per un giorno, preparare una soluzione di lavoro a cisplatino da 10 millimolare. Pesare i topi e quindi determinare una dose a 0,1 milligrammi di IDU per grammo di peso corporeo. Somministrare la dose calcolata di IDU mediante iniezione intraperitoneale e attendere due ore prima della raccolta delle cellule.
Utilizzare un paio di forbici chirurgiche per rimuovere chirurgicamente l'orecchio del topo eutanasiato precedentemente iniettato con IdU alla base dell'orecchio. Posizionare l'orecchio su una piastra di Petri asciutta di 100 millimetri. Separare accuratamente la parte anteriore dalla pelle posteriore utilizzando forcep fini per creare una tasca al centro o al bordo dell'area tagliata, quindi separare i due lembi della pelle e procedere con la pelle anteriore e posteriore.
Posizionare con cura le pelli anteriori e posteriori di un orecchio in un unico pozzo di un piatto di coltura da 12 pozzetti, riempito con un millilitro di soluzione di dispasi/collagenasi preparata al momento, con il lato derma della pelle che tocca la soluzione. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora per digerire la pelle. Posizionare l'orecchio digerito o la pelle neonatale in una piastra di Petri pulita con il lato epidermide che tocca la superficie del piatto.
Usando le forcelle, appiattire la pelle e far scorrere delicatamente il derma dall'epidermide lavorando dal centro ai bordi con un motivo circolare. Con le forcep, afferrare l'epidermide ai bordi e sollevarla delicatamente staccandola dalla superficie della piastra di Petri. Posizionare con cura l'epidermide su una soluzione di distacco cellulare prerifuocata in un pozzo di una piastra.
Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius o 20 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare forcep sterili per afferrare l'epidermide e strofinare trascinando l'epidermide contro il fondo del piatto per dissociare le cellule. Aggiungere un millilitro di DMEM contenente l'1%FBS e passare attraverso un setaccio cellulare di 40 micrometri in un tubo di raccolta.
Risciacquare bene con altri due millilitri di DMEM e aggiungere alla sospensione cellulare. Dopo aver centrifugato a 120 volte g per cinque minuti, aspirare con cura il supernatante. Riutilizzarlo in uno o due millilitri di DMEM contenente l'1%FBS e pelletare nuovamente le celle come in precedenza.
Per etichettare le cellule per determinare le cellule vive e morte, resuspend da uno a tre milioni di cellule in un millilitro di DMEM contenente 25 micromolare cisplatino e incubare per un minuto. Tempra mediante pipettazione con un volume uguale di FBS. Dopo aver centrifugato a 120 volte g per cinque minuti, decantare il supernatante in un bicchiere contenente candeggina diluita e invertire i tubi per drenare la soluzione rimanente su un tovagliolo di carta.
Resuspend il pellet cellulare in due millilitri di PBS privo di cationi di bario e centrifugarli di nuovo come descritto in precedenza. Per fissare le cellule, risosopendare il pellet cellulare in un millilitro di PBS privo di cationi bario. Vortice le cellule sotto bassa potenza continua e aggiungere un millilitro dei due x PFA buffer di fissazione drop-wise.
Posizionare su una piattaforma a dondolo e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo aver centrifugato a 500 volte g per cinque minuti, decantare con cura il supernatante. Lavare le celle con due millilitri di PBS privo di bario, centrifugare di nuovo nelle stesse condizioni e ripetere la fase di lavaggio.
Infine, resuspend il pellet in due millilitri di PBS privo di cationi di bario. Centrifugare le cellule a 500 volte g per cinque minuti e decantare con cura il supernatante. Risospendire le cellule in un millilitro di un tampone di fissazione x e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti e ripetere la centrifugazione.
Per lavare le celle, aggiungere un millilitro di buffer di permeabilizzazione del codice a barre. Durante la centrifugazione cellulare a 500 volte g per cinque minuti, preparare i codici a barre aggiungendo loro 100 microlitri di buffer di permeabilizzazione dei codici a barre e mescolare immediatamente. Resuspend il pellet cellulare in 800 microlitri di tampone di permeabilizzazione dei codici a barre.
Aggiungere la soluzione di codici a barre alle cellule, mescolare e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Centrifuga a 500 volte g per cinque minuti. Lavare nuovamente le cellule in due millilitri di tampone di colorazione cellulare e centrifugare.
Successivamente, resospendare da uno a tre milioni di cellule in un millilitro di soluzione di lavoro tampone di colorazione dell'antigene nucleare e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo aver centrifugato a 500 volte g per cinque minuti, decantare con cura il supernatante. Rimospendare le cellule in un millilitro di tampone di permeabilizzazione dell'antigene nucleare e centrifugare di nuovo.
Dopo la resuspensione ripetuta e la centrifugazione, rimorsi il pellet cellulare nel volume residuo con un vortice delicato. Aggiungere 50 microlitri di cocktail di anticorpi intracellulari, mescolare e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. Aggiungere due millilitri di tampone di colorazione cellulare.
Centrifugare di nuovo nelle stesse condizioni del passaggio precedente e rimuovere il supernatante. Rimospendare il pellet in due millilitri di tampone di colorazione cellulare, centrifugare a 500 volte g per cinque minuti e ripetere la sospensione e la centrifugazione. Resospendare le cellule in un millilitro di soluzione di intercalazione e conservare per uno o tre giorni a quattro gradi Celsius.
Dopo aver centrifugato nuovamente le cellule, lavare il pellet con due millilitri di tampone di colorazione cellulare, centrifugare nelle stesse condizioni ed eseguire due lavaggi aggiuntivi con due millilitri di acqua, con la stessa centrifugazione. Rimescolare il pellet cellulare ad una concentrazione di un milione di cellule per millilitro con soluzione diluita di perline EQ, quindi eseguire i campioni sul citometro di massa. Vengono determinate le rese cellulari previste e la vitalità dall'orecchio adulto del topo e dalla pelle neonatale.
La resa approssimativa dipende dalla superficie della pelle. La pelle neonatale è una scelta migliore per gli esperimenti che richiedono un numero maggiore di cellule. Viene mostrata la strategia di gating di base da selezionare per le cellule intatte, singole e vitali, dopo la normalizzazione e la deconvoluzione dei dati di citometria di massa codificati a barre.
La percentuale di cellule vitali può essere indicativa della qualità o delle condizioni delle cellule prima della colorazione. Vengono mostrate anche differenze di vitalità tra le cellule carcinoma coltivate rispetto alle cellule isolate dell'orecchio del topo. Le cellule vitali sono state gated sulla lunghezza dell'evento rispetto al CD45 per escludere le cellule ematopoietiche.
L'inclusione di marcatori di lignaggio consente la selezione delle popolazioni cellulari di interesse in diverse fasi del ciclo cellulare. Il profilo del ciclo cellulare di base è ottenuto dal rilevamento di BrdU contro PI nella citometria a flusso a base fluorescente. Tuttavia, l'inclusione di altri marcatori di proliferazione con citometria di massa, consente un'identificazione più precisa delle fasi del ciclo cellulare.
Seguendo questo approccio, i profili del ciclo cellulare possono essere costruiti per diversi tipi di cellule o condizioni sperimentali, come i profili per le celle positive CD45 negative rispetto a CD45 dello stesso esperimento. In un altro esempio, l'analisi dei marcatori che definiscono le vie di segnalazione EGFR e mTOR PI3K nella fase G-one, ha rivelato profili di espressione simili nelle celle negative CD45, mostrate in arancione, e nelle cellule positive CD45, mostrate in blu. La citometria di massa richiede molte cellule di alta qualità.
Se un utente è interessato a una popolazione cellulare rara, potrebbe essere necessario un numero maggiore di celle. Le cellule vive isolate possono essere utilizzate per l'analisi del DNA o dell'RNA, studi biochimici o possono essere utilizzate nella coltura tissutale prima della fissazione e della colorazione per la citometria di massa. L'utente deve utilizzare attrezzature di protezione individuale e un armadietto di sicurezza quando necessario, quando lavora con paraformaldeide, acido cloridrico o idrossido di sodio.
