I supercomplessi sono assemblaggi supramolecolari formati da complessi di catene respiratorie nella membrana interno-mitocondriale. Si ritiene che la formazione di questi supercomplessi conferise diversi vantaggi strutturali e funzionali, che includono la diminuzione della produzione di specie reattive dell'ossigeno, la stabilizzazione e l'assemblaggio più efficace dei singoli complessi della catena respiratoria, la regolazione dell'attività della catena respiratoria e la prevenzione dell'aggregazione proteica nell'ambiente ricco di proteine della membrana interna. I cambiamenti nell'assemblaggio e nella composizione dei supercomplessi sono dinamici e sono sempre più mostrati alla base dei cambiamenti nella funzione mitocondriale osservati durante l'adattamento fisiologico, così come una varietà di malattie genetiche e acquisite.
Questo video presenta un protocollo IBRIDO CLEAR/BLUE NATIVE PAGE per risolvere e analizzare i supercomplessi in modo preciso ed efficace nel tempo. Il principale vantaggio di questo metodo ibrido page nativo chiaro/blu è che combina in modo ottimale vari aspetti dei tradizionali protocolli PAGE nativi blu e chiari, che consente di ridurre al minimo l'esposizione a detergenti e composti anionici rispetto ai protocolli pubblicati. La separazione e l'analisi ottimali dei supercomplessi si ottiene su grandi gel gradienti.
Questa procedura prevede diversi passaggi delicati che richiedono abilità manuali e un'attenta esecuzione. Il supporto visivo al protocollo scritto fornisce suggerimenti importanti che facilitano l'implementazione della tecnica. A dimostrare la procedura è Alexandria, dottoranda del mio laboratorio.
Per iniziare, centrifuga i mitocondri isolati dal tessuto animale in un tubo da 1,5 millilitri a 16.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e aggiungere il volume calcolato del tampone di estrazione del freddo ghiacciato contenente digitonina al tubo per rimescolare il pellet mitocondriale. Posizionare i tubi su un mini rotatore di tubi e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius a una velocità di rotazione media.
Centrifuga campioni a 20, 400 volte G per 45 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere frammenti insolubilizzati. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo sul ghiaccio. Se l'elettroforesi non viene eseguita lo stesso giorno, conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius.
Aprire la camera di colata. Posizionare una piastra di vetro esterna di 20 centimetri per 22 centimetri nella camera. Posizionare un set di distanziale da 1,5 millilitri utilizzando la scheda di allineamento per assicurarsi che siano posizionati saldamente contro il lato e gli angoli della camera.
Posizionare una piastra di vetro interna sopra i distanziale per formare il sandwich di gel e mettere un foglio di separazione in plastica sopra la piastra di vetro. Disporre altri tre gruppi sandwich in gel. Aggiungere altri blocchi acrilici o lastre di vetro se necessario per prendere lo spazio rimanente nella camera.
Posizionare una striscia di parafilm nella scanalatura prima di sedersi saldamente la guarnizione nella tacca della guarnizione. Posizionare la piastra del soffitto sulla camera e stringere tutte e sei le viti. Stare in piedi la camera di colata.
Posizionare il primo gradiente su una piastra di agitazione con un agitatore magnetico nella camera di miscelazione della luce. Collegare il tubo della camera di colata al primo gradiente e fissare il tubo nella cassetta della pompa peristaltica. Assicurarsi che il fineo del primo gradiente sia chiuso.
Per lanciare quattro gel, preparare 60 millilitri di 4% e 60 millilitri di soluzioni di gel al 12% in due flaconi Erlenmeyer e ruotare accuratamente per mescolare. Versare la soluzione di gel al 4% nella camera di miscelazione leggera e il 12% nella camera del serbatoio pesante del primo gradiente. Impostare la velocità di agitazione della piastra di agitazione a 350 giri/min.
Quindi aprire il fermapo e accendere la pompa a 35 giri/min. Una volta che il livello di soluzione della frazione leggera è inferiore alla frazione pesante, mettere in pausa la pompa e aprire lo stelo della valvola tra serbatoi leggeri e pesanti. Lasciare che le frazioni di volume equilibrano e riavviino la pompa.
Assicurarsi che nessuna bolla entri nel sistema e rimanere intrappolati tra le piastre di vetro. Una volta versato completamente il gel gradiente, arrestare la pompa e sovrapporre un millilitro ad ogni sandwich di gel per evitare l'essiccazione del gel. Lascialo polimerizzare per due ore.
Preparare il gel impilabile da 25 millilitri nel pallone Erlenmeyer e ruotare per mescolare accuratamente. Invertire delicatamente il montaggio per rimuovere l'acqua e inserire pettini da 15 pozzi in ogni sandwich di gel. Versare il gel impilamento e lasciarlo polimerizzare per due ore.
Successivamente, inserire morsetti in gel e sandwich e rimuovere il pettine. Con la piastra di vetro corta rivolta verso il basso, inserire il sandwich di gel nel nucleo di raffreddamento. Ripetere sull'altro lato e posizionare il nucleo nel serbatoio di elettroforesi.
Versare 300 millilitri di tampone di catodo blu nella camera interna del serbatoio di elettroforesi. Con una pipetta e punte di carico, caricare da 75 a 175 microgrammi di proteine per pozzo. Nella stanza fredda a quattro gradi Celsius, collegare gli elettrodi all'alimentatore e accenderlo a 150 volt, e far funzionare il gel per un'ora e mezza, o fino a quando i campioni non sono entrati tutti nel gel gradiente.
Replica del carico del campione in pozzi separati per consentire la determinazione parallela delle attività in gel e l'analisi immunoblot dei complessi OXPHOS. Rimuovere il tampone catodo blu con pipetta. Sostituire con 300 millilitri di tampone catodo libero blu Coomassie e eseguire gel a 200 volt durante la notte nella stanza fredda.
Prima della fine dell'elettroforesi, preparare tamponi di attività in gel secondo il manoscritto e tenerli al buio a temperatura ambiente. Interrompere l'elettroforesi e recuperare il gel. Taglia il sacchetto di plastica in modo che possa essere aperto come un libro.
Tagliare le corsie e trasferire le corsie in gel in sacchetti di plastica. Utilizzare una sigillare termica per sigillare due dei tre lati. Se vengono eseguiti esperimenti di controllo negativo, aggiungere inibitori ai buffer di dosaggio.
Per tre campioni sperimentali, aggiungere 20 millilitri di tampone di attività in gel. Rimuovere le bolle e sigillare il quarto lato del sacchetto di plastica. Incubare le corsie in gel a 37 gradi Celsius al buio e controllare ogni 15 minuti.
Il tempo di incubazione varia a seconda della quantità di proteine e complessi. Dopo l'incubazione, sciacquare le corsie di gel in acqua per interrompere la reazione e l'immagine su uno sfondo bianco per il complesso I, complesso II, IV complesso o sfondo nero per il complesso V.Per questo esempio, è stata eseguita una complessa attività in gel IV per visualizzare supercomplessi isolati dai mitocondri del fegato di topo fresco. La quantità ottimale di digitonina per questo campione è di quattro grammi per grammo, in quanto fornisce una buona risoluzione del complesso monomerico IV e supercomplessi ad alto peso molecolare.
Ad un rapporto inferiore, le bande non sono chiare e si risolvono in uno striscio durante l'elettroforesi, mentre l'uso di un rapporto più elevato di digitonina porta all'interruzione di supercomplessi ad alto peso molecolare. I mitocondri epatici isolati da un topo sono stati trattati con la quantità ottimale di digitonina per estrarre supercomplessi respiratori. La mobilità elettroforetica dei complessi OXPHOS è leggermente ridotta quando le proteine vengono separate utilizzando condizioni di PAGE native ibride chiare / blu, rispetto alla PAGINA nativa standard, a causa della ridotta quantità di blu Coomassie.
Questo spostamento di mobilità è maggiore per i monomeri IV complessi, seguiti da complessi monomeri V e complessi I.Lo sfondo blu è più basso nella PAGINA nativa nativa /blu chiara ibrida rispetto alla PAGINA nativa blu. Alti livelli di fondo che seguono la PAGINA nativa blu mascherano completamente la colorazione dell'attività in gel per il complesso II e migliorano il rumore di fondo associato all'attività di dimeri IV complessi. Per questo protocollo, la titolazione dei campioni di interesse con varie quantità di digitonina è fondamentale al fine di identificare le condizioni che consentono una solubilizzazione ottimale, preservando al contempo l'attività enzimatica e le interazioni fisiologiche proteiche.
Tutte le fasi relative alla fusione del gel devono essere eseguite meticolosamente alla formazione di un gradiente ottimale per una corretta separazione del campione. Si dovrebbe anche prestare estrema attenzione alla manipolazione di questi gel grandi e fragili. Tienili sempre con diverse dita usando l'estremità alta percentuale del gel.
Con questo metodo ibrido PAGE nativo chiaro/blu, i campioni vengono esposti brevemente al colorante anionico Coomassie blue all'inizio dell'elettroforesi senza esposizione ad altri detergenti. Ciò consente di separare e risolvere i supercomplessi in modo efficace come con i tradizionali metodi PAGE nativi blu, evitando l'effetto negativo di alti livelli di blu coomassie sui test di attività in gel e sulle interazioni proteina-proteina labile all'interno di supercomplessi. Con questo protocollo, è quindi possibile combinare misurazioni precise e rapide dell'attività in gel con tecniche analitiche che coinvolgono l'elettroforesi 2D, l'immunodetezione e/o l'analisi proteomica a cui si fa riferimento di supercomplessi.
