Quindi il principale vantaggio della nostra nuova tecnica, l'abbiamo chiamata E più E, che sta per arricchimento più espansione, è che possiamo arricchire ed espandere queste cellule, cellule rare specifiche dell'antigene, contemporaneamente. Questo ci permette di sviluppare un numero sufficiente di cellule che saremo in grado di utilizzare per indagare il loro ruolo in diversi contesti e in diversi contesti clinici o anche per perrci di sviluppare ora un gran numero di cellule che possiamo utilizzare per l'immunoterapia in un modo che prima non potevamo. Il metodo che abbiamo sviluppato, questo E più E, può aiutare a rispondere a domande chiave nell'immunologia di base sulla presenza di neoepitopi.
Cosa sono i neoepitopi? Queste sono le epitopi personalizzate che sappiamo essere ora molto importanti in termini di immunoterapia oncologica e anche di dinamiche specifiche dell'antigene e di come questi fattori influenzano gli stati delle malattie e per una terapia cellulare efficace. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso l'immunoterapia, poiché la cellula artificiale che presenta l'antigene della nanoparticella potrebbe essere un prodotto preconfezionato che è facilmente su misura per le risposte immunitarie dei singoli pazienti.
Per generare cellule antigene artificiali nanoparticelle, rimescolare le particelle liofilizzate in un millilitro di tampone di resuspensione e vortice vigorosamente la sospensione per almeno 15 minuti fino a quando non sono visibili aggregati. Particelle non sufficientemente vortici e rimorsizzate prima della reazione con le proteine si tradurranno in particelle aggregate più grandi che non sono in grado di essere dissociate. Posizionare le particelle magnetiche su un supporto magnetico per rimuovere il supernatante e rimescolarle con 0,5 millilitri di tampone di resuspensione fresco.
Trasferire la sospensione delle particelle su una fiala di scintillazione di vetro per il vortice fino a quando non sono visibili aggregati e aggiungere 0,1 milligrammi di segnali stimolanti totali per un milligrammo di particelle rimorsi. Dopo il vortice, lasciare che la sospensione reagisca per 2,5 ore a temperatura ambiente con miscelazione in un rotatore, seguita dall'aggiunta di 0,1 millilitri di tampone di tempra per un'ulteriore incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente con miscelazione. Al termine della seconda reazione, posizionare il flaconcino a scintillazione sul supporto magnetico e lavare le particelle in un millilitro di tampone di resuspensione quattro volte, rimuovendo il tampone quando diventa chiaro dopo ogni lavaggio e sostituendolo con un fresco tampone di resopensione per il successivo lavaggio sul magnete.
Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare la soluzione e rimuovere le particelle dal supporto magnetico, quindi conservare le particelle in un millilitro di tampone di resuspensione fresco a quattro gradi Celsius per un massimo di sei mesi. Per isolare le cellule CD8+T specifiche dell'antigene, macerare le milza e i linfonodi dai topi 6J neri di tipo selvaggio C57 attraverso un filtro cellulare sterile da 70 micrometri con frequenti risciacqui PBS e utilizzare un kit di isolamento cellulare CD8+T senza contatto secondo le istruzioni del produttore per eliminare le cellule non CD8+T. Dopo il conteggio, raccogliere le cellule CD8+T isolate mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in 100 microlitri di PBS integrati con albumina siere bovina allo 0,5% e EDTA bimolare, quindi incubare le cellule con le cellule di presentazione dell'antigene artificiale della nanoparticella in modo che ci siano una volta 10 all'11 ° MHC-ig caricato peptidico per uno per 10 alla sesta cellule CD8 +T isolate in un sterile , tubo a fondo rotondo in polistirolo da cinque millilitri per un'ora a quattro gradi Celsius con miscelazione continua.
Al termine dell'incubazione, lavare la sospensione cellulare della nanoparticella tre volte sul supporto magnetico come dimostrato, riutilizzando le cellule artificiali che presentano l'antigene e le cellule CD8+T arricchite in 500 microlitri di mezzo fresco e integrato con fattore di crescita cellulare 1%T dopo l'ultimo lavaggio. Per il massimo recupero cellulare, è fondamentale lasciare le particelle e le cellule sulla colonna magnetica per almeno due minuti e aspirare attentamente il buffer senza interrompere le particelle e le cellule soggette al campo magnetico. Dopo il conteggio, sementi 2,5 volte 10 alla quinta cellule CD8+T arricchite e miscela di particelle magnetiche per 160 microlitri di mezzo integrato più 1%TCGF in una piastra con fondo a U da 96 po '.
Il terzo giorno, nutrire le cellule con 80 microlitri di mezzo integrato con un fattore di crescita cellulare del 2%T per pozzo e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare per altri quattro giorni. Il settimo giorno, raccogliere le cellule stimolate in un tubo a fondo rotondo da cinque millilitri per contare e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Rimescolare il pellet in 0,5 millilitri di PBS integrato con lo 0,05% di azide di sodio e il siero bovino fettale al 2% per il conteggio e aliquota da cinque volte 10 alla quarta o cinque volte 10 alla quinta colonna in nuovi tubi a fondo rotondo da cinque millilitri per la colorazione specifica dell'antigene.
Etichettare i tubi appropriati con MHC-ig biotinilato e CD8a anti-mouse per un'ora a quattro gradi Celsius, seguito da un lavaggio di centrifuga in PBS fresco per rimuovere qualsiasi immunoglobulina biotinilata in eccesso, quindi macchiare i campioni con un anticorpo secondario coniugato con streptavidina appropriato e un ceppo di cellule morte fissibile vivo-morto appropriato per 15 minuti a quattro gradi Celsius e leggere le cellule su un citometro a flusso per determinare la specificità e il numero delle cellule CD8+T specifiche dell'antigene secondo protocolli standard. Qui è stata ottenuta una coniugazione proteica di successo utilizzando tre diversi metodi di attaccamento proteico alle particelle. Se la densità del ligando aAPC è troppo bassa, non ci sarà una stimolazione efficace delle cellule CD8+T specifiche dell'antigene.
Il controllo di qualità del dimero biotinilato può essere completato su cellule CD8+T transgeniche per verificare la colorazione. Ad esempio, questi risultati rappresentativi dimostrano una colorazione positiva con celle CD8+T specifiche di gp100 con celle CD8+T b6 non specifiche dell'antigene come controllo di sfondo. Inoltre, la conoscenza della colorazione di fondo del dimero biotinilato è critica, in quanto qualsiasi percentuale inferiore a questa colorazione nei tubi macchiati di affini dovrebbe essere considerata un risultato negativo.
Dopo sette giorni di arricchimento ed espansione, da due per 10 a quattro e due volte 10 alla quinta cella specifica dell'antigene e da cinque a 50%CD8+T ci si può aspettare da un originale cinque per 10 alla sesta popolazione iniziale di cellule CD8+T endogene. La stessa metodologia può essere utilizzata per isolare e stimolare cellule CD8+T specifiche dell'antigene umano con aumenti simili delle percentuali e del numero di cellule CD8+T specifiche dell'antigene osservate dopo una sola settimana di espansione dopo l'arricchimento. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire i controlli di qualità dei reagenti appropriati come descritto.
Seguendo questa procedura, altri metodi come la citometria a flusso per la colorazione intracellulare delle citochine o l'espressione proteica superficiale possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sulla funzionalità o sul fenotipo delle cellule. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia di base per esplorare l'ampiezza, la profondità e la dinamica delle risposte specifiche dell'antigene in altri campi biomedici come il cancro, le malattie infettive o la ricerca autoimmunità.
