Il nostro protocollo aiuta gli scienziati ad analizzare la rete di actomiosina subcellulare nelle singole cellule epiteliali e consente loro anche di eseguire analisi simili su scala multicellulare nei tessuti epiteliali curvi. Il nostro protocollo è un bell'esempio di applicazione Fiji. Ha un'interfaccia utente grafica intuitiva e non richiede alcuna conoscenza dello scripting.
Pertanto, è altamente adatto anche agli utenti alle prime armi sul campo. Sebbene il nostro metodo sia stato sviluppato per le camere delle uova Drosophila, è applicabile anche al di fuori della Drosophila epithelia. Incoraggiamo gli scienziati a testare il nostro protocollo nei loro sistemi modello.
Utilizzare i file di test accompagnati per familiarizzare con questo protocollo. Ti aiuterà a decidere quale parte di questo protocollo è adatta alla tua domanda di ricerca individuale. Questa parte del protocollo consente agli utenti di segmentare le cellule epiteliali nei filmati time-lapse e successivamente analizzare gli impulsi di actomiosina nelle singole cellule nel tempo utilizzando Surface Manager.
Per iniziare, aprire Fiji e importare la macro TissueCellSegmentMovie. ijm come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Quindi, aprite un file TIFF corretto per la candeggina e dividete i canali del file corretto per la candeggina andando alla barra dei menu, selezionando Immagine, seguita da Colore e dividi canali.
Eseguire lo script caricato sul canale della membrana cellulare attiva del filmato time-lapse selezionato premendo l'icona Esegui nello script aperto. Per ottenere una bella maschera cella, impostare la sfocatura gaussiana su 2.500 e la sensibilità di rilevamento delle celle su meno uno e fare clic su OK. Quindi, impostare la tolleranza al rumore stimata tra 10 e 20 per i filmati time-lapse acquisiti con l'obiettivo 63x e fare clic su OK. Una maschera di cella generata viene visualizzata nel filmato time-lapse analizzato, viene visualizzata una nuova finestra chiamata ParticleStack e viene visualizzata anche una piccola finestra chiamata Action Required. Dalla maschera di cella del filmato time-lapse, concentrati solo sulle celle al centro e seleziona quelle in grado di fornire contorni completi e ben definiti durante il filmato time-lapse.
Quando le celle selezionate al centro corrispondono bene alle membrane cellulari reali, salvare ParticleStack come file TIFF. Aprire il file TIFF ParticleStack corrispondente nelle Figi. Con il plug-in Surface Manager installato nelle Fiji, apri il plug-in.
In Surface Manager fare clic sul pulsante Leggi immagine struttura e impostare l'indice Jaccard su 60%Il caricamento dei contorni può richiedere diversi minuti a seconda del numero di celle. Una volta caricata, a ciascuna cella verrà assegnato un numero S e verrà visualizzata nella parte sinistra della finestra di Surface Manager. Fare clic sul numero S selezionato in modo che il contorno della cella importato da ParticleStack1.
tiff appare nel film time-lapse. Controllare ogni numero S importato per la qualità del contorno delle celle durante il filmato e rimuovere le celle indesiderate che visualizzano contorni di cella errati. Per rimuovere una cella indesiderata, evidenziare il contorno della cella e fare clic sul pulsante Elimina.
Usare lo strumento Pennello per correggere i contorni delle celle. Al termine, salvare le celle corrette come RoiSet. zip.
Per identificare se gli impulsi di actomiosina sono presenti nel tessuto analizzato e per comprendere il comportamento dettagliato, così come la direzionalità dei segnali di actomiosina, iniziare aprendo fiji. Aprire un filmato time-lapse, caricare particlestack1 salvato. tiff cell mask e il filmato time-lapse corretto per la candeggina, quindi caricare il plug-in Surface Manager e la corrispondente area di interesse dal RoiSet.
zip. Successivamente, in Surface Manager, attivare un canale con segnali di interesse. Fare clic sul pulsante Statistiche per ottenere la finestra denominata Valore grigio medio Sezione per sezione.
Le intensità media e mediane dei segnali di actomiosina saranno visualizzate nel tempo in unità arbitrarie, così come altri parametri relativi all'area e alla forma della cellula. Salvare i valori come file di foglio di calcolo andando alla finestra Statistiche, facendo clic su File e selezionando Salva con nome. Questa parte del protocollo consente agli utenti di estrarre selettivamente un sottile strato di actomiosina nel tessuto epiteliale curvo nel tempo.
Questi passaggi sono intuitivi e basati su un'interfaccia grafica intuitiva. Aprire Fiji e assicurarsi che sia installato il plug-in Proiezione superficie ellissoide. Quindi, aprire un filmato time-lapse ed esportarlo come file XML/HDF5 facendo clic su Plugins, scegliendo BigDataViewer e esporta immagine corrente come file XML/HDF5.
Aprire quindi il file esportato in Proiezione superficie ellissoide andando a Plugins, facendo clic su BigDataViewer, seguito da Proiezione superficie ellissoide e selezionando file XML. Questo aprirà una nuova finestra con viste sagittali della camera delle uova e apparirà una finestra di dialogo per guidare l'utente attraverso l'elaborazione. La finestra di dialogo, denominata Proiezione ovaie, ha diverse schede.
Nella prima scheda della finestra di dialogo, denominata riquadro delimitazione, definite i bordi x e y di una camera uovo nel filmato time-lapse insieme alla larghezza z del rettangolo di selezione e premete impostate. Le parti selezionate della camera delle uova sono evidenziate in rosa. Definire quindi le dimensioni dei BLOB di segnale nella scheda della finestra di dialogo denominata trova BLOB nella finestra Proiezione ovaie.
Definire il sigma e il valore minimo di picco. Quindi, premere calcola per identificare i segnali di actomiosina, che appariranno come blob verdi. Riprovare questo passaggio con parametri diversi fino a trovare circa 100 punti.
Identificare i segnali di actomiosina è un passo cruciale. Dipende dalla qualità del segnale e dalle dimensioni corrette dei BLOB rilevati. Se non ci sono macchie verdi visibili nell'immagine, il passaggio successivo non funzionerà.
Per progettare l'ellissoide, continuare con la scheda denominata ellissoide fit. Impostare campioni casuali su 10.000, la distanza di taglio esterna/interna su uno a 10 e quindi fare clic su calcola. Successivamente, la scheda chiamata proiezione si aprirà automaticamente e consentirà la definizione dell'estrazione della superficie.
Nella scheda proiezione impostare una distanza di proiezione minima e massima come larghezza dell'ellissoide desiderato. La distanza di proiezione minima e massima deve adattarsi in modo che la regione ellissoide definita rosa includa l'intero strato esterno della camera delle uova. Quindi, definire la distanza della fetta come una sola.
Assicurarsi che la regione rosa dell'ellissoide con il con definito sulla camera delle uova sia visibile prima di premere il calcolo. Aiuta a valutare la qualità di una nuova vestibilità ellissoide. Impostare quindi una larghezza di output dell'ellissoide maggiore o uguale a 800 e un'altezza maggiore o uguale a 400.
Quindi, impostate la durata dell'estrazione della superficie e scegliete una proiezione sferica o cilindrica. Se necessario, capovolgere Z e allineare il calcolo Y.Press per ottenere un'estrazione di superficie per entrambi i canali in nuove finestre denominate immagine. Regolare la luminosità e il contrasto delle finestre dell'immagine ottenute per poter vedere i segnali di actomiosina proiettati facendo clic su Immagine, andando a Regola e selezionando Luminosità/Contrasto.
Se l'estrazione della superficie ha un bell'aspetto, salvare entrambi i canali separatamente come file TIFF. Inoltre, salvare il file della finestra Log per riferimento futuro su come è stata estratta la superficie di questa particolare camera a uovo. Quindi, unisci i canali con un codice colore preferito nelle Fiji e salva i risultati come file TIFF.
Questo protocollo consente agli scienziati di indagare il comportamento delle reti di actomiosina nei tessuti epiteliali. Questo è possibile solo quando un'analisi dettagliata del comportamento dell'actomiosina su scala cellulare locale è combinata con un'analisi simile su scala tissutale. Qui sono mostrati esempi rappresentativi del comportamento dinamico della miosina II su scala cellulare locale e su scala tissutale per il controllo e le camere delle uova drosophila mutanti grass2.
Sul singolo piano basale, la catena di luce regolatoria modificata verde dei segnali di miosina II si sposta perpendicolarmente all'asse anteriore-posteriore delle camere di controllo delle uova. Questa polarità si perde nelle camere delle uova mutanti fat2 e porta a impulsi di miosina II anisotropica, oscillazioni A livello di tessuto, la catena di luce regolatoria modificata verde della miosina II nel campione di controllo genera la forza sincronizzata necessaria per promuovere la rotazione epiteliale. Al contrario, l'epitelio follicolo di una camera uovo mutante grasso2 pulsa fortemente sul lato basale e non riesce a generare la forza sincronizzata necessaria per promuovere la rotazione epiteliale.
In una sottile regione apicale della camera delle uova Drosophila, il mutante fat2 presenta anche un comportamento dinamico alterato della catena di luce regolatoria modificata verde della miosina II.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come analizzare una rete di actomiosina su scala locale e tissutale nelle camere delle uova drosophila usando fiji. Per ulteriori suggerimenti pratici e la risoluzione dei problemi, vedere la parte di discussione dopo il protocollo. Se hai domande relative alle Fiji o ai nostri plugin, consulta le rispettive pagine web o contattaci.
