Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti l'organizzazione di reti astrocitiche nelle strutture cerebrali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che propone un metodo imparziale per contare le cellule etichetta e documentare la loro organizzazione anatomica all'interno di una struttura definita. Aprire ImageJFIJI, selezionare il file desiderato e fare clic su OK nella finestra delle opzioni di importazione del formato bio.
Per ridefinire una pila Z che conterrà solo le fette ottiche necessarie per lo stack Z finale, selezionare prima il progetto STK e Z, quindi fare clic sulla manopola dello stack nella barra degli strumenti. Selezionate intensità massima nell'impostazione del tipo di proiezione. Salvare il file e denominarlo file stack.
Se il file di imaging contiene più canali, utilizzare il colore dell'immagine e i canali divisi per visualizzare solo il canale con l'immagine della rete astrocitica. Controllare le impostazioni dei pixel dell'immagine selezionando immagine, proprietà, pixel, con uno per la dimensione dei pixel. Quindi utilizzare lo strumento sottrai sfondo aprendo il processo e sottrarre lo sfondo per rimuovere l'etichettatura della biocitina di sfondo.
Utilizzate la funzione di anteprima per impostare il raggio della palla rotolante, che in genere è impostato su 50 pixel. Se è necessaria un'ulteriore riduzione del rumore dopo il passaggio di sottrazione dello sfondo, selezionare processo, disturbo e rimuovere gli outlier. Selezionare luminoso nell'impostazione degli outlier e utilizzare la funzione di anteprima per impostare il raggio e la soglia.
Fai attenzione a utilizzare lo strumento remove outlier, poiché potrebbe sfocare i dati, come mostrato qui. Regola la soglia usando l'immagine, regola, soglia. Selezionare la modalità predefinita e la modalità B e W.
Clicca su applica. Convertire l'immagine in un'immagine binaria con lo strumento processo binario selezionando processo, binario e rendere binario. Salvare il file come file tiff e denominarlo file binario.
Per contare le celle, impostare innanzitutto il tipo di misurazione facendo clic su analizza e imposta misurazione. Quindi selezionare l'opzione baricentro. Verificare che il file binario sia aperto sullo schermo.
Ancora una volta, aprite il menu analizza e questa volta selezionate analizza particelle. Selezionare quindi mostra e contorni. In questo modo viene generato un nuovo file che mostra il risultato del rilevamento.
Ottimizzare i parametri per perfezionare il rilevamento. Per rilevare solo le celle, utilizzare un valore di dimensione compreso tra 30 e 6000 e una circolarità tra zero e uno, in cui si definisce un cerchio perfetto e zero una forma casuale. Eseguire il rilevamento facendo clic su OK. Verranno visualizzate due tabelle, una tabella denominata riepilogo che fornisce il numero di celle rilevate e una tabella denominata risultati che fornisce le coordinate X e Y di ogni cella.
Copiare i valori e incollarli in un'applicazione foglio di calcolo. Salvare questa tabella sotto la tabella di rilevamento dei nomi. Apparirà anche un file con un grafico di celle rilevate.
Salvare il file come file tiff sotto il file di rilevamento dei nomi. Se un gruppo di due o più celle etichettate viene rilevato come una singola cella con lo strumento analizza particelle, utilizzare lo strumento spartiacque sull'immagine binaria selezionando processo, binario e spartiacque prima di applicare lo strumento analizza particelle. Per misurare l'area di superficie delle reti, utilizzare il file di rilevamento in ImageJ.
Fare clic con il pulsante sinistro del mouse per selezionare lo strumento di selezione poligono sulla barra degli strumenti. Fare di nuovo clic con il pulsante sinistro del mouse per iniziare a tracciare un'area di interesse, o ROI, che collega tutte le celle situate nella periferia esterna della rete. Fare clic con il pulsante destro del mouse per chiudere il poligono.
Aprire la finestra di misurazione impostata e selezionare l'opzione area. Quindi aprire il gestore del ROI e aggiungere il poligono tracciato nel gestore del ROI facendo clic su aggiungi. Eseguire la misurazione facendo clic su misura nel gestore del ROI.
La misurazione dell'area apparirà in una tabella ed sarà espressa in pixel. Non dimenticare di convertire questo valore con un fattore di conversione per il microscopio utilizzato per ottenere il valore in micrometri quadrati. Aprite il file dello stack in ImageJFIJI e identificate la cella patchata con la sua maggiore intensità di etichettatura.
Aprire quindi il file denominato tabella di rilevamento in un'applicazione foglio di calcolo e individuare il numero associato alla cella con patch e le relative coordinate. Se non è in grado di determinare con precisione la cella patchata, utilizzare lo strumento poligono per circondare l'area in cui il deposito di biocitina è più denso e fare riferimento a questa posizione come quella della cella patchata. Utilizzare il gestore del ROI come in precedenza per disegnare un ROI nella posizione della cella patchata e aggiungerlo al gestore del ROI.
Impostare quindi la misurazione e selezionare l'opzione baricentro. Nel gestore RIO, clicca su misura per ottenere le coordinate del baricentro dell'area tracciata. Utilizzare queste coordinate come punto di riferimento per questa rete specifica.
Utilizzare questa formula per calcolare le coordinate di ogni cella in riferimento all'astrocita patchato. Esprimere le coordinate di ogni cella in riferimento all'astrocita patchato è un passo importante per calcolare il vettore dagli astrociti patchati. Utilizzare questa formula per calcolare le coordinate del vettore principale di orientamento preferenziale.
Il principale vettore di orientamento preferenziale della rete è la somma di tutti i vettori calcolati in precedenza per ogni cellula costituita nella rete. Dividere la lunghezza del vettore principale per il numero di celle della rete, meno una per escludere la cella con patch, per normalizzare i valori e consentire confronti tra reti. Per determinare la posizione di ogni rete nel nucleo di interesse, apri prima l'immagine a quattro x con un editor di immagini vettoriali.
Moltiplicate le quote nella finestra delle quote per cinque per aumentare le dimensioni dell'immagine a quattro x. Qui, l'immagine è stata campionare a 800 per 800 pixel e quindi la risoluzione di campionamento viene modificata in 4000 per 4000 pixel. Esportare il file in formato tiff e denominarlo ridimensionato di quattro x.
Allineare l'angolo superiore sinistro dell'immagine a quattro x ridimensionata con l'angolo inferiore sinistro del documento di Adobe Illustrator. Il software fornisce coordinate da un punto referenziale dell'angolo in basso a sinistra. Aprire l'immagine 20 x della rete.
Utilizzare il file binario o il file di rilevamento perché sono più facili da allineare. Quindi, gioca con lo strumento opacità sul file binario dell'immagine 20 x per allinearlo all'immagine quattro x ridimensionata. Al termine dell'allineamento, selezionate e tenete premuto lo strumento pipetta in modo che venga visualizzato lo strumento misura e selezionatelo sulla barra degli strumenti sinistra.
Usate lo strumento misura per fare clic nell'angolo in alto a sinistra dell'immagine 20 x per ottenere le coordinate del punto referenziale 20 x sull'immagine a quattro x ridimensionata. Queste coordinate referenziali 20 x sono utili per esprimere la posizione di ogni rete su un disegno schematico del nucleo. Per riassumere i dati, viene utilizzata la normalizzazione del nucleo come rettangolo.
Per fare ciò, utilizzare lo strumento poligono per circondare il nucleo nell'immagine a quattro x ridimensionata. Quindi aprire il gestore del ROI e aggiungere il ROI disegnato. Utilizzare l'immagine con luci trasparenti se i bordi del nucleo non possono essere visti, nel qual caso ricordarsi di ridimensionarla prima.
Nella misurazione impostata, selezionare l'opzione rettangolo di delimitazione per calcolare il rettangolo più piccolo all'interno del nucleo disegnato. Infine, fare clic su misura, quindi seguire i passaggi del protocollo scritto per esprimere le coordinate delle celle etichettate in un nucleo normalizzato rappresentato dal rettangolo di delimitazione. Un singolo astrocita nella parte dorsale del nucleo sensoriale principale trigemino, etichettato da SR101, è stato preso di mira per la registrazione a cellule intere e riempito con lo 0,2% di biocitina.
La stimolazione elettrica del quinto tratto ha aumentato l'etichettatura della biocitina nella parte dorsale del nucleo sensoriale principale trigemino, rappresentando un aumento del numero di cellule accoppiate. Le reti astrocitiche rimangono confinate all'interno della parte dorsale del nucleo sensoriale principale trigemino e del loro orientamento principale. Questa tecnica è stata sviluppata per posizionare le reti astrocitiche all'interno di una struttura definita, ma può essere utilizzata per esprimere la posizione della popolazione di cellule etichettate in qualsiasi struttura.
