Questo metodo può essere utilizzato come strumento diagnostico per il cancro per analizzare il DNA tumorale circolante. Questa tecnica interroga l'alterazione genetica multipla nelle regioni di mutazioni a grappolo in una singola reazione. Questo aiuta a salvare preziosi campioni di pazienti.
Questo metodo può fornire informazioni sul carico tumorale sul suo profilo mutazionale. Ora può anche essere applicato ad un'analisi molecolare come alternativa al qPCR per ottenere una quantificazione assoluta delle sequenze bersaglio dell'acido nucleico. Raccogliere campioni di sangue in tubi EDTA da sette millilitri.
Si consiglia a due tubi di raccogliere circa quattro millilitri di plasma. Centrifugare i campioni di sangue per 10 minuti a 820 volte la gravità entro tre ore dall'estrazione del sangue per separare globuli rossi, globuli bianchi e plasma. Il tempo tra il campionamento e la centrifugazione è fondamentale per ottenere DNA di alto grado e privo di cellule T non contaminato dal DNA rilasciato dai globuli bianchi.
Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere il supernatante senza toccare lo strato di globuli bianchi. Circa due millilitri di plasma vengono solitamente recuperati per tubo EDTA. Dopo aver trasferito i plasmi in due tubi millilitro, centrifugare le aliquote a 16.000 volte la gravità per 10 minuti a 15 gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari.
Raccogliere con cura il plasma senza disturbare il pellet e trasferirlo in due tubi criogenici millilitri. Conservare a -80 gradi Celsius fino a quando necessario. Inizia aggiungendo 400 microlitri di proteinasi K a un tubo da 50 millilitri.
Quindi, aggiungere quattro millilitri di plasma e 3,2 millilitri di tampone di lisi ACL contenente un microgrammo di RNA portante dal kit di estrazione. Chiudere il tubo e mescolare vortici per 30 secondi per ottenere una soluzione omogenea. Quindi, incubare a 60 gradi Celsius per 30 minuti.
Dopo l'incubazione, aggiungere 7,2 millilitri di tampone ACB al lisato per ottimizzare il legame degli acidi nucleici circolanti alla membrana silicea. Mescolare con vortice per 15-30 secondi. Quindi, incubare il tubo sul ghiaccio per cinque minuti.
Attaccare la colonna e l'estensore da 20 millilitri alla pompa per vuoto. Chiudere le porzioni inutilizzate per consentire l'aspirazione del vuoto. Dopo aver centrifugato brevemente il tubo, introdurre con cura la miscela nell'estensore del tubo.
Quindi accendere la pompa per vuoto e lasciare che il lisato venga disegnato completamente attraverso le colonne. Rimuovere e scartare l'estensore del tubo. Applicare quindi 600 microlitri di buffer ACW1 alla colonna.
Quando il buffer ACW1 ha disegnato attraverso la colonna, aggiungere 750 microlitri di tampone ACW2 e, infine, 750 microlitri dal 96 al 100% di etanolo. Quindi, posizionare la colonna in un tubo di raccolta pulito da due millilitri e centrifugare a tutta velocità per tre minuti per eliminare l'etanolo. Dopo aver posizionato la colonna in un nuovo tubo di raccolta a due millilitri, aprire il coperchio e quindi incubare a 56 gradi Celsius per 10 minuti per asciugare completamente la membrana.
Dopo l'incubazione, posizionare la colonna in un tubo pulito a bassa legatura da 1,5 millilitri. Applicare con cura 36 microlitri di acqua priva di RNasi con azide di sodio dello 0,04%. Quindi, chiudere il coperchio e incubare a temperatura ambiente per tre minuti.
Centrifugare di nuovo a tutta velocità per un minuto per elutare gli acidi nucleici. Quindi, conservare a -20 gradi Celsius fino a quando necessario. Iniziare scongelando ed equilibrando i componenti di reazione a temperatura ambiente in una cappa PCR pulita.
Quindi preparare un mix 20 volte di primer e sonde in acqua distillata priva di RNasi e Dnase con ogni primer a concentrazione micromolare 18 e ogni sonda a cinque concentrazione micromolare. Per tutte le singole reazioni PCR, preparare un mix di campioni combinando 10 microlitri di supermix ddPCR due volte, un microlitro di 20 volte primer e sonde mixare e fino a 10 nanogrammi del campione di DNA in 20 microlitri di acqua distillata. Vortice la miscela di reazione accuratamente per garantire omogeneità.
E centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto nella parte inferiore del tubo prima di erogare. Inserire la cartuccia ddPCR nel supporto e caricare 20 microlitri di miscela di reazione del campione nei pozzi centrali della cartuccia per la generazione di goccioline. Aggiungere 70 microlitri di olio generatore di goccioline nei pozzi inferiori.
Inserire la cartuccia con una guarnizione nel generatore di goccioline. Le goccioline saranno prodotte nei pozzi superiore della cartuccia. Aspirare lentamente e delicatamente 40 microlitri delle goccioline dalle cartucce e erogare in una piastra PCR da 96 po'.
Sigillare la piastra PCR finale con un foglio di alluminio utilizzando un sigillante a piastre immediatamente dopo il trasferimento delle goccioline per evitare l'evaporazione. Centrifugare brevemente la piastra per raccogliere il contenuto nella parte inferiore dei pozzi. Eseguire un'amplificazione PCR convenzionale su un ciclore termico.
Al termine della corsa, centrifugare brevemente la piastra per raccogliere il contenuto nella parte inferiore dei pozzi. Dopo l'amplificazione PCR, utilizzare il lettore di goccioline per contare le goccioline positive PCR e PCR negative seguendo le istruzioni del produttore. Di seguito sono riportato i risultati rappresentativi ottenuti durante le fasi di ottimizzazione del saggio ddPCR drop-off.
Questa immagine mostra il rilevamento del DNA mutante e del DNA di tipo selvatico in una reazione contenente il 100% di DNA mutante, il 5% di DNA mutante e il DNA al 100% di tipo selvaggio. Questa immagine mostra esempi di campioni di plasma analizzati con i test ddPCR drop-off KRAS ed EGFR che mostrano il rilevamento di singoli nucleotidi e sostituzioni multiple nell'esone due di KRAS e una cancellazione nell'esone 19 EGFR. Durante il tentativo di questa procedura, è importante procedere con attenzione in ogni passaggio con un'attenzione speciale alla generazione di goccioline, che è un passaggio critico di questo metodo.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada a ricercatori e clinici nel campo della ricerca sul cancro per ottimizzare l'analisi delle mutazioni tumorali utilizzando la biopsia liquida.
