Name: toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology
Uploaded: 2018-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology at JoVE.com

Gli autori vorrebbero dopo impianto di microscopia Jenkins all'Università del Wyoming per il loro aiuto e i membri del laboratorio Bushman, Kelly Roballo, Hayden True, Wupu Osimanjiang e Dhunghana di Subash, per assistenza nella cura degli animali. Questa pubblicazione è stato reso possibile da un premio per lo sviluppo istituzionale (IDeA) dal National Institute of General Medical Sciences, della National Institutes of Health, sotto Grant n. 2P20GM103432.

Questo progetto sono stati utilizzati ratti Sprague Dawley adulti e tutte le procedure sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali di Università del Wyoming.
1. chirurgia e nel Vivo del nervo fissazione
Nota: Informazioni sul fornitore per tutti i materiali e le attrezzature utilizzate in questo protocollo sono elencati nella Tabella materiali.
Nota: In vivo la fissazione del nervo viene utilizzata per conservare i tessuti e ridurre il degrado strutturale che può verificarsi tra il momento della morte e raccolta dei nervi. Fissazione del tessuto in vivo è una pratica standard per la preparazione del tessuto del sistema nervoso per l'istologia, dove la perfusione è spesso un precursore di questo. Il posizionamento e le dimensioni dei nervi periferici ha permesso per la fissazione in situ. Si sconsiglia di accumulazione e fissazione del tessuto dopo l'eutanasia a causa della possibilità di degradazione del tessuto.
<ol><li>Preparare il ratto per anestesia generale collocandolo in una camera di induzione con 2-3% isoflurane, poi posizionare il ratto anestetizzato in posizione prona sulla cima di una stuoia di dissezione e mantenere a 1-2% di isoflurane via anestetica cono di naso. Per garantire un'adeguata profondità dell'anestesia, test animali per pedale ritiro alle zampe posteriori e verificare l'assenza di riflessi palpebrali agli occhi toccando il canthus mediale dell'occhio. Nota: L'iniezione intraperitoneale di ketamina è un'alternativa comunemente usata per via inalatoria isoflurano.</li>
	<li>Per esporre il nervo sciatico, radersi i capelli dell'hind limb(s) e pulire le zone rasate con etanolo al 70%. Con un bisturi o forbici, praticare un'incisione di 2-3 cm in pelle lungo l'arto dal ginocchio fino al grande trocantere, dove palpazione del femore utilizzando il bisturi sterile per accertare la corretta posizione dell'incisione. Il femore si trova appena prossimale rispetto al segmento più accessibile del nervo sciatico. Anche se si tratta di un intervento chirurgico non-sopravvivenza, mantenere tecniche sterili.</li>
	<li>Dopo aver effettuato l'incisione cutanea, individuare l'aereo tra il muscolo bicipite femorale e del muscolo di maximus del gluteus e usando le forbici microdissection separare la fascia sottostante ed esporre 2-3 cm del nervo sciatico sottolineatura. Per esporre una sezione trasparente del nervo sciatico, è necessario utilizzare un riavvolgitore per ampliare il divario tra i due muscoli (Figura 1A). Con una pinzetta e forbici iris, separare con cura il nervo dal tessuto connettivo, ponendo la massima cura di non comprimere o tagliare il nervo circostante.</li>
	<li>Aggiungere fissativo sufficiente Trump (4% formaldeide, glutaraldeide al 1% in PBS 1X (tamponato fosfato salino) con 1,16 g di NaH2PO4· H2O / 100 mL) nella cavità contenente il nervo per coprire il nervo e lasciate riposare per 10 min. Se necessario, garza posto sotto la cerva gamba per migliorare l'angolo in modo che altro fissativo può essere aggiunto nella cavità. Rimuovere il fissativo dopo 10 min e ripetere questo passaggio altre due volte.</li>
	<li>Usando un microscopio per dissezione, tagliare il nervo da entrambi i lati utilizzando forbici dissezione bene, facendo attenzione a non allungare o pizzicare il nervo sciatico e subito messo le sezioni del nervo in provette da 15 mL contenenti fissativo di briscola a 4 ° C per una settimana, cambiando il fissativo ogni 48 h.</li>
	<li>Non lasciare gli animali incustoditi durante qualsiasi parte della procedura chirurgica. Dopo la rimozione del nervo, eutanasia animali di dislocazione cervicale mentre sotto anestesia.</li>
</ol>2. trattamento tetrossido di osmio e l'incorporamento di resina
<ol><li>Post di fissazione, attentamente rimuovere qualsiasi residuo grasso e tessuti connettivi dal nervo e utilizzare un bisturi affilato per tagliare il nervo in segmenti di circa 5 mm di lunghezza (nervo segmenti possono essere separati e identificati in diversi tubi). Preparare fresco tetrossido di osmio 2% diluito in soluzione fissante di Trump e tenere in un tubo di vetro. Immergere i segmenti del nervo in tetrossido di osmio 2% per 2 h, che può essere in tubi di plastica per questo breve periodo di tempo. Nota: Alcuni tubi di plastica reagiscono con tetrossido di osmio, causando un oscuramento della soluzione, in modo prolungato stoccaggio di tetrossido di osmio in tubi di plastica non è raccomandato.</li>
	<li>Utilizzando una resina epossidica embedding kit medium, preparare la formula finale di incorporamento:<ol>
<li>Mescolare la resina epossidica mezzo di inclusione con soluzione DDSA (anidride dodecenylsuccinic; miscela A) e mescolare la resina epossidica mezzo di inclusione con soluzione NMA (anidride methylnadic; miscela B). Lasciare entrambe le miscele A e B mescolare per almeno 20 minuti agitando con un agitatore magnetico.</li>
		<li>Immediatamente prima dell'uso mescolare la miscela A e B e aggiungere l'acceleratore DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) nella proporzione di 1.5-2.0% del volume totale della miscela. Si noti che la soluzione DPM-30 dovrebbe essere misurata proprio per evitare il blocco da diventando di colore scuro e fragili. Tutti i prodotti chimici resina sono tossici; prestare particolare attenzione per evitare il contatto con la pelle o per inalazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando provette da 1,5 mL, lavare segmenti del nervo con PBS e iniziare il processo di disidratazione collocando i segmenti del nervo in acetone/distillata diversi passaggi dell'acqua: 30%, 60%, 90%, concentrazioni per 10 minuti ciascuno, quindi in 100% di acetone 3 volte per 10 minuti ciascuno.  Si noti che l'etanolo può essere utilizzato al posto di acetone.</li>
	<li>Per l'infiltrazione di resina, posizionare i segmenti del nervo in una miscela di 1 parte della miscela finale di incorporamento e 1 parte 100% acetone per 30 min, poi in una miscela di 2 parti della miscela finale di incorporamento e 1 parte 100% acetone per 30 min , e infine posto il nervo segmenti in finale l'incorporamento di miscela per 30 min.</li>
	<li>Mettere i segmenti del nervo in incorporamento stampi in gomma siliconica (ci hanno usato Lunghezza 106 mm x 71 mm di larghezza x profondità mm 7; bloccare Dimensione Lunghezza 11 mm x 6 mm di larghezza x 3 mm di profondità). Aggiungere delicatamente la resina sopra i nervi, facendo attenzione a coprire i segmenti di intero nervo evitando bolle d'aria. Lasciare lo stampo contenente segmenti di nervo con la resina per polimerizzare a 60 ° C durante la notte.</li>
</ol>3. sezionamento di ultramicrotomo
<ol><li>Preparare la lama di vetro usando un coltellinaio di vetro (Figura 1B) e fare vetro coltelli con barche (Figura 1), che vengono utilizzati per raccogliere le sezioni del nervo che galleggia sull'acqua distillata.</li>
	<li>Posizionare blocchi nervosi resina incorporato nel supporto ultramicrotomo con il trapezio lato rivolto verso l'alto. Utilizzando l'ambito di ultramicrotomo, tagliare qualsiasi eccesso di resina che circonda il tessuto nervoso e rendere il blocco di affrontare una forma trapezoidale e come vicino alla superficie longitudinale del nervo possibile usando una lama di taglio singolo, come una lama di rasoio. Non penetrano la superficie longitudinale del segmento del nervo, che è riconoscibile per la sua colorazione scura di tetrossido di osmio. Nota: Rimozione della resina in eccesso riduce l'area della resina essere sezionato e migliorare le prestazioni di lama e taglio nei passaggi successivi.</li>
	<li>Utilizzando l'ultramicrotomo, rendere più sezioni trasversali sufficiente esporre una superficie di sezione trasversale uniforme del tessuto del nervo usando un coltello di vetro normale. Una volta fatto questo, passare a un coltello di vetro cui barca è riempito con acqua distillata a temperatura ambiente e regolare l'ultramicrotomo a 1-2 μm per tagliare sezioni sottili.</li>
	<li>Trasferimento sezioni sottili galleggiante dalla barca di coltello di vetro a una goccia d'acqua deionizzata su vetrino con anello in metallo (Figura 1). A secco diapositive contenente sezioni passando più volte sopra una fiamma per pochi secondi, facendo attenzione a non surriscaldare le sezioni. Macchia secche sezioni immediatamente con toluidina blu o conservare a temperatura ambiente per diversi giorni prima della colorazione. Nota: Sezioni possono essere asciugati anche utilizzando una piastra scalda a 60 ° C per 15 min. Un lento processo di essiccazione rende liscia le sezioni.</li>
</ol>4. blu di toluidina colorazione
<ol><li>Preparare la soluzione di 1% di blu di toluidina sciogliendo 2 g di borato di sodio in 100 mL di acqua deionizzata, quindi aggiungere 1 g di blu di toluidina e mescolare fino a scioglimento. Filtrare la soluzione utilizzando carta da filtro (dimensione dei pori: 11 µm) e mantenere la soluzione in un flacone opaco a temperatura ambiente fino a due settimane.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta di plastica o micro pipetta, aggiungere una goccia di soluzione di blu di toluidina nella parte superiore le sezioni del nervo e lasciare per 20-30 s.</li>
	<li>Lavare via tutte le soluzione di blu di toluidina in eccesso delicatamente immergendo i vetrini in acqua deionizzata vaschetta e ripetere 3 - 4 volte fino a quando le sezioni sono chiare. Asciugare i vetrini almeno 15 min a 60 ° C o una notte a temperatura ambiente e poi coprire le sezioni con un vetrino coprioggetto utilizzando il mezzo di montaggio regolare. Esaminare le diapositive montate immediatamente o conservare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Esaminare sotto un microscopio chiaro. Un obiettivo ad immersione X 100 è consigliato per immagini dettagliate utilizzate per calcolare i rapporti di g.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development:+What+small+animal+models+can+tell+us.">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li><li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury:+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies.">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li><li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+fillers+in+nerve+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair.</a> Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).</li><li>Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+paraffin-embedded+myelin+sheath+staining+with+osmium+tetroxide+for+light+microscope+observation.">A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+part+II-morphological+techniques.">Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques.</a> International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+myelin+sheath+and+collagen+reorganization+pattern+in+a+model+of+peripheral+nerve+regeneration+using+an+integrated+histochemical+approach.">Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach.</a> Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).</li><li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue:+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility.">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).</li><li>Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue+and+Lugol's+iodine+application+in+the+assessment+of+oral+malignant+disease+and+lesions+at+risk+of+malignancy.">Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 21, 160-163 (1992).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering.">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).</li><li>Dykstra, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).</li><li>Vleggeert-Lankamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+evaluation+methods+in+the+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration+through+synthetic+conduits:+A+systematic+review.">The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).</li><li>Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+uses+and+methods+of+processing+of+fresh+frozen+sections+of+peripheral+nerve.">Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve.</a> Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).</li><li>Castro, J., Negredo, P., Avenda&#241;o, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve+and+its+modification+during+regeneration+through+a+sieve+electrode.">Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode.</a> Brain research. , 65-77 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+Part+II-morphological+techniques.">Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques.</a> International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).</li><li>Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., B&#246;cker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microstructured+and+interconnected+pore+channels+in+a+collagen-based+nerve+guide+on+axonal+regeneration+in+peripheral+nerves.">The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves.</a> Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).</li><li>Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+nerve+biopsies:+A+practical+guide+for+neuropathologists.">Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists.</a> Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).</li><li>Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+repair+by+means+of+vein+filled+with+muscle+grafts.+II.+Morphological+analysis+of+regeneration.">Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration.</a> Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).</li><li>Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+staining+methods+for+resin-embedded+peripheral+nerve.">Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve.</a> Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).</li><li>Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+immunohistochemistry+on+improved+glycol+methacrylate-resin+sections.">High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections.</a> Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).</li><li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+stains:+A+literature+review+and+case+study.">Histological stains: A literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).</li><li>Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+and+nonporous+nerve+conduits:+the+effects+of+a+hydrogel+luminal+filler+with+and+without+a+neurite-promoting+moiety.">Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety.</a> Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).</li><li>Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits.">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun conflitto di interessi.

Gli esami delle strutture morfologiche della lesione del nervo periferico e la rigenerazione sono soggetti frequenti di Studio13. In questo protocollo, descriviamo la procedura per ottenere immagini di alta qualità per quantificazioni di dati istologici utilizzando tessuto di nervo sciatico del ratto incorporato in blocchi in resina e colorato con blu di toluidina. Questa tecnica fornisce un'immagine della morfologia del nervo in cui la rigenerazione del nervo può essere quantificata misurando il numero di assoni, grado di mielinizzazione, presenza di tessuto fibrotico infiltrativo e i nervi di salute. Mentre le immagini mostrano sezionamento e lavorazione dei nervi illesi come campioni, gli stessi passaggi e materiali sono applicabili ai nervi feriti e nervi rigenerati con canalette o tessuto innesti, fornito tale fissazione del tessuto è adeguata20, 21.
Mentre tutti i passaggi del protocollo sono essenziali, alcuni di questi passaggi sono più probabilità di portare a sezioni di scarsa qualità o immagini. Disidratazione del tessuto insufficiente può condurre ai fori nelle sezioni del nervo (figura 5B). Una possibile spiegazione è l'immiscibilità di resina con acqua, e l'acqua in eccesso nel tessuto impedisce l'infiltrazione del tessuto di resina. Di conseguenza, permettendo un tempo sufficiente e l'uso di acetone assoluto è essenziale per garantire il passaggio di disidratazione corretta. Anche se abbiamo usato acetone in questo protocollo, etanolo può anche essere utilizzato. Molte resine, tuttavia, non sono reattive con etanolo, così il tessuto dovrà essere trattato con ossido di propilene per servire come una transizione tra la disidratazione di etanolo e l'incorporamento di resina.
A causa della magrezza delle sezioni, trasferimento sezioni del nervo del coltello di vetro sul vetrino deve essere effettuato con grande cura (Figura 5). 1-2 μm sezioni sono molto fragili, e improprio trasferimento della sezione potrebbe causare la sezione di rompere. Se la sezione è raccolto nella parte centrale della sezione con un ago, la sezione è incline a piegare su se stesso e spesso sarà difficile da spiegare quando trasferito alla diapositiva. Diversi strumenti possono essere utilizzati per il trasferimento della sezione sul vetrino, compresi aghi e loop, e ciascuno deve essere testato per l'utente specifico determinare che produrrà la migliore trasferimento di risultati. Per i nostri scopi, utilizzando un ciclo che potrebbe comprendere l'intera sezione notevolmente ridotto la piegatura delle sezioni quando sono stati trasferiti dal coltello di vetro per il vetrino da microscopio (Figura 1).
In generale, la gestione corretta dei nervi è essenziale come compressione dei nervi possa causare crepe si verificano nelle sezioni del nervo (Figura 5A). Compressione del tessuto di nervo può accadere durante il trasferimento di segmenti del nervo nei processi di esposizione in animale, fissazione, disidratazione e l'incorporamento di resina. Per evitare la compressione del nervo del tessuto, segmenti del nervo dovrebbero essere trasferiti da una pinzetta e raccolto su un'estremità del segmento idealmente da solo lo strato epineurial, così l'intero nervo non ne risentiranno. La presenza di crepe e linee (segni di coltello) nelle sezioni del nervo può verificarsi anche a causa di vetro opaco o abusato coltelli. Per garantire il sezionamento ottimali, si consiglia di making coltelli bicchiere fresco e cambiando il coltello di vetro che ogni 25-30 tagli, meno se sezionamento tramite nervo racchiuso all'interno di un condotto.
Le resine può essere relativamente costose, sono inadeguate quando sezioni longitudinali del nervo sono necessari e possono richiedere costosi strumenti quali un ultramicrotomo e un coltellinaio di vetro. Nonostante queste limitazioni, sezioni di toluidina blu macchiatura della resina incorporata periferico del nervo è ancora considerato il gold standard per la visualizzazione di sezioni trasversali di nervo periferico morfometria4,5. Sezioni longitudinali può anche rivelare caratteristiche importanti dei nervi periferici, come continuità assonale e nodi di Ranvier, ma è più utile con immunohistochemistry. In questi casi è la prassi generale per elaborare differenzialmente due sezioni del nervo stesso, uno per toluidina blu sezioni trasversali e l'altro per l'immunoistochimica longitudinale. A causa della maggiore incidenza del trauma periferico del nervo e le lesioni e le esigenze di un modo migliore di valutare strutture morfologiche del nervo, questo metodo può continuare ad essere applicata come strumento essenziale per ottenere dati istologici di danno del nervo e di rigenerazione.

Nervi periferici si estendono in tutto il corpo, che innervano tessuti bersaglio con assoni sensoriali o motori1. Nervo periferico difetti causati da patologie mediche e trauma rappresentano un problema importante di sanità pubblica e avere grande impatto economico2,3. Nonostante i progressi nel valutare gli esiti delle lesioni del nervo periferico e comprensione di rigenerazione del nervo, metodi tradizionali come l'istologia del nervo e tecniche di colorazione sono strumenti essenziali per qualitativamente e quantitativamente valutare la salute del nervo come una misura di esito terminale in modelli animali o asportato tessuto umano. Questo è spesso accoppiato con misurazioni elettrofisiologiche della funzione di nervo periferico, dove morfometria può rivelare perché rigenerazione funzionale del nervo ha fatto o non si è verificato.
Blu di toluidina colorazione di sezioni semi-sottile nervo periferico resina incorporata è un metodo specializzato per l'imaging di fibre di nervo myelinated, fornendo l'alta qualità e immagini dettagliate di strutture nervose4,,5,6 chiare . Blu di toluidina è una macchia di leucodistrofia acidofile, scoperta da William Henry Perkin nel 18567ed è stato utilizzato in diverse applicazioni mediche8. Sezioni blu-macchiato del nervo periferico di toluidina ottenute da segmenti di resina-incastonato del nervo consente una visualizzazione chiara delle strutture nervose. Visualizzazione della struttura della guaina di mielina può essere migliorata mediante l'uso di osmio tetrossido di post-fissazione4,9. Tetrossido di osmio è un ossidante e del lipido fissativo agente tossico che interagisce con i legami doppi in lipidi, con conseguente crudamente definito foderi di myelin ricca di lipidi10. Tuttavia, tetrossido di osmio è tossico, costoso, richiede un'incubazione più lungo dei segmenti del nervo e non viene sempre utilizzato.
Metodi alternativi di lavorazione e colorazione sono stati sviluppati per la visualizzazione della morfologia del nervo periferico; Paraffina, sezionamento criogenico e resina epossidica resina-incastonato del nervo sezionamento seguita mediante colorazione con blu di toluidina o soluzione fenilendiamina è stato utilizzato per quantificare i cambiamenti morfologici del nervo periferico rigenerazione 11,12 . Questi metodi ogni hanno vantaggi e resa essenziale dati sul numero di assoni, mielina spessore, diametro dell'assone e diametro dell'assone a fibra myelinated diametro (g-ratio) 11,13,14,15 .
La distinzione principale di resina-incorporare in questo protocollo è che facilita ottenere sezioni di spessore 1-2 μm a causa della durezza della resina pur mantenendo le qualità istologiche del nervo. Queste sezioni sottili, in contrasto con le sezioni di spessore di 4-5 μm ottenute da paraffina incorporamento, forniscono sezioni periferiche del nervo con risoluzione superiore, consentendo una più accurata quantificazione del myelination assone, come il rapporto di g, che non può essere ottenuti da più spesso sezioni16. Mentre criogenico di sezionamento può essere utilizzato per ottenere le sezioni 1-2 µm, è stato la nostra esperienza che è più difficile da ottenere sezioni senza numerose fessure di grandi dimensioni. Tali sezioni fessurate possono causare imprecisi conteggio del numero degli assoni e aspetti di mielinizzazione.
Oltre alla macchiatura17blu di toluidina, un argento che macchia il metodo18 e di colorazione tricromica di Masson4 utilizzabile anche per mostrare gli assoni del nervo. Tuttavia, utilizzando resina l'incorporamento delle sezioni del nervo mediano di ratto macchiato con ematossilina ed eosina o di Masson tricromica ha mostrati deboli foderi di myelin e strutture non riconosciuti, considerando che la macchiatura blu della toluidina ha mostrato la guaina mielinica chiara immagine e può facilmente essere quantificati4. Nonostante alcune limitazioni, i nervi che macchia di resina incorporata periferico blu di toluidina è una tecnica importante che può essere utilizzata quando sono necessarie immagini ad alta risoluzione della morfologia del nervo.
Lo svantaggio principale per l'incorporamento di resina è che richiede tempo e non consente di immunostaining del tessuto stesso a causa della difficoltà di ricupero dell'antigene rispetto alla paraffina e tecniche di sezioni congelate incorporato. Così, non è generalmente possibile utilizzare lo stesso tessuto per immunostaining che viene elaborato tramite l'incorporamento di resina per la macchiatura blu della toluidina. Anche se non usato qui, se non si desidera immunohistochemistry in resina sezioni embedded, l'utilizzo di incorporamento resine di metacrilato di glicole consente immunohistochemistry essere eseguita su sezioni di tessuto, ma è relativamente costoso19. Questo può essere un po' mitigato tagliando il nervo periferico in segmenti separati, alcuni per l'incorporamento di resina ed altri per l'immunocolorazione direttamente dopo la fissazione.
Il processo di macchiatura blu della toluidina di resina incorporati i nervi periferici, come con l'analisi istopatologica più, può essere suddiviso in cinque fasi, tra cui la fissazione, la disidratazione, l'incorporamento, sezionamento e macchiatura20. Qui ci proponiamo di fornire un protocollo e una guida pratica per l'utilizzo di resina incorporati ratto nervo sciatico sezioni macchiate con immagini di alta qualità per acquisire blu di toluidina.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffer Saline</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Tetraborate Decahydrate</td><td>Acros Organics</td><td>205950010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Embedding Medium Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>To adjust Trump&#039;s fixative pH</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Chemical</td><td>170942</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td></td></tr><tr><td>Pelco Embedding Cast</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9671811</td><td></td></tr><tr><td>Glass Knife Maker</td><td>RMC Products</td><td>GKM-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC Products</td><td>MT-XL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Tube</td><td>Falcon</td><td>ISO 9001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>4 mL Glass Vial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>For trimming resin block</td></tr><tr><td>Perfect Loop</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70944</td><td>For picking up thin resin sections</td></tr><tr><td>Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>100 Watt Oven</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>6350115</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filter Paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL plastic pipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z331740</td><td></td></tr><tr><td>Micro-surgical Kit</td><td>World precision instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus fluorescence microscope</td><td></td><td></td><td>Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80</td></tr></tbody></table>

toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology

Nervi periferici si estendono in tutto il corpo, che innervano tessuti bersaglio con gli assoni motori o sensoriali. Grazie alla distribuzione capillare, i nervi periferici sono spesso danneggiati a causa di trauma o della malattia. Come sono state sviluppate metodi e strategie per valutare la lesione periferica del nervo in modelli animali, funzione e rigenerazione, analizzando la morfometria del nervo periferico è diventata una misura essenziale risultato terminale. Sezioni di macchiatura del nervo trasversale blu di toluidina ottenute da sezioni del nervo resina incorporata è un metodo riproducibile per le valutazioni qualitative e quantitative dei nervi periferici, consentendo la visualizzazione del numero di morfologia degli assoni e grado di mielinizzazione. Questa tecnica, come con molti altri metodi istologici, può essere difficile da imparare e padroneggiare utilizzando protocolli standard scritte. L'intento di questa pubblicazione è pertanto per accentuare i protocolli scritti per la macchiatura dei nervi periferici con videografia del metodo, utilizzando i nervi sciatici raccolti dai ratti blu di toluidina. In questo protocollo, descriviamo in vivo fissazione del nervo periferico e raccolta del tessuto e la post-fissazione con 2% tetrossido di osmio, l'incorporamento dei nervi in resina epossidica e ultramicrotomo sezionamento dei nervi allo spessore di 1-2μm. Sezioni del nervo poi trasferito ad un vetrino e colorato con blu di toluidina, dopo che essi sono quantitativamente e qualitativamente valutati. Esempi dei problemi più comuni sono indicati, così come passaggi per attenuare questi problemi.

Resina incorporati nervo periferico sezioni colorate con toluidina blu consentono quantificazioni di accurati dati istologici. Una panoramica della procedura è illustrata nella (Figura 2). Nervo sciatico sezioni incorporato nel terreno di resina e colorato con blu di toluidina ha mostrato chiare immagini con risoluzione ottimale (figure 3). Danno del nervo può causare molti cambiamenti nel nervo strutture morfologiche, ad esempio, cambiamenti nelle fibre nervose, diametro dell'assone e spessore della guaina mielinica. Questo metodo può preservare la struttura nervosa nella sua forma naturale, che facilita la misura di diversi parametri come il rapporto del diametro dell'assone al diametro della fibra totale (g-rapporto; Figura 4). Una varietà di fattori può portare a sezioni meno ottimale del nervo periferico, tra cui la presenza di cricche (Figura 5A) nella sezione a causa di uso improprio del nervo. Fori possono verificarsi anche nella sezione (figura 5B) a causa di insufficiente disidratazione. Un altro possibile errore nella procedura è pieghevole delle sezioni (Figura 5), che possono essere risolto utilizzando loop da inoculo per sezione trasferimento su lastra di vetro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig1.jpg"> Figura 1: chirurgia e sezionamento. (A) del nervo sciatico del ratto durante la fissazione in vivo . (B) vetro coltello maker (C) vetro coltelli con la barca. (D) Anelli di metallo utilizzati per trasferire galleggiavano sezioni sottili dai coltelli di vetro per una goccia di acqua deionizzata su vetrino. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig2.jpg"> Figura 2: schema del metodo utilizzato in questo protocollo. (A) adulti Sprague Dawley, ratto è anestetizzato, seguita da in vivo del nervo fissazione del nervo e (B) raccolta (C). Il passo successivo è post-fissazione con 2% tetrossido di osmio (D) e resina incorporamento (E). Incorporato del nervo sezioni sono poi tagliati (F) e sezionato (G) utilizzando un ultramicrotomo in resina. Infine, nervo sezioni su vetrino sono macchiati con toluidina blu (H). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig3.jpg"> Figura 3: sezione trasversale di un nervo sciatico di ratto tinto con toluidina blu. Mostra sezioni sotto diversi ingrandimenti (10x, 20x, 40x e 60 X) di chiara immagine con risoluzione ottimale. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig4.jpg"> Figura 4: sezione trasversale di un nervo sciatico di ratto tinto con toluidina blu. Questa immagine ad alta risoluzione (100 X) può essere utilizzata per misurare il rapporto del diametro dell'assone al diametro della fibra totale (g-rapporto). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig5.jpg"> Figura 5: sezioni trasversali di un nervo sciatico di ratto tinto con toluidina blu sotto diversi ingrandimenti. Mostrato sonoaltri dei problemi che possono verificarsi durante l'esecuzione del presente protocollo. (A) e (B). La presenza di crepe e buchi all'interno della sezione del nervo causata da manipolazione impropria della sezione e insufficiente disidratazione del tessuto, rispettivamente. (C). Folding delle sezioni, che può accadere durante il trasferimento delle sezioni dai coltelli di vetro alla diapositiva. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology at JoVE.com

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Qui presentiamo un protocollo per visualizzare strutture fini dei nervi periferici ottenendo e macchiatura blu 1-2 µm sezioni con toluidina

Blu di toluidina macchiatura delle sezioni incastonate in resina per la valutazione della morfologia del nervo periferico

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.8K Views.  University of Wyoming. Qui presentiamo un protocollo per visualizzare strutture fini dei nervi periferici ottenendo e macchiatura blu 1-2 µm sezioni con toluidina

Video: Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Ricerca

Neuroscienze

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una protesi retinica per analisi istopatologica localizzato

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Medicina

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Biologia dello sviluppo

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo microscopia a due fotoni di Endings singolo nervo in pelle

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Demielinizzazione sperimentale e rimielinizzazione di Murine midollo spinale da iniezione focale Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear pelle

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to degeneration and injury of small-diameter sensory neurons, referred to as small fiber neuropathy. Present animal models of small fiber neuropathy affect both large- and small-diameter sensory fibers and thus create a neuropathology too complex to properly assess the effects of injured small-diameter sensory fibers. Therefore, it is necessary to develop an experimental model of pure small fiber neuropathy to adequately examine these issues. This protocol describes an experimental model of small fiber neuropathy specifically affecting small-diameter sensory nerves with resiniferatoxin (RTX), an ultrapotent agonist of transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), through a single dose of intraperitoneal injection, referred to as RTX neuropathy. This RTX neuropathy showed pathological manifestations and behavioral abnormalities that mimic the clinical characteristics of patients with small fiber neuropathy, including intraepidermal nerve fiber (IENF) degeneration, specifically injury in small-diameter neurons, and induction of thermal hypoalgesia and mechanical allodynia. This protocol tested three doses of RTX (200, 50, and 10 &#181;g/kg, respectively) and concluded that a critical dose of RTX (50 &#181;g/kg) is required for the development of typical small fiber neuropathy manifestations, and prepared a modified immunostaining procedure to investigate IENF degeneration and neuronal soma injury. The modified procedure is fast, systematic, and economic. Behavioral evaluation of neuropathic pain is critical to reveal the function of small-diameter sensory nerves. The evaluation of mechanical thresholds in experimental rodents is particularly challenging and this protocol describes a customized metal mesh that is suitable for this type of assessment in rodents. In summary, RTX neuropathy is a new and easily established experimental model to evaluate the molecular significance and intervention underlying neuropathic pain for the development of therapeutic agents.

This study establishes an experimental model of pure small fiber neuropathy with resiniferatoxin (RTX). A unique dose of RTX (50 &#181;g/kg) is optimal for developing a small fiber neuropathy model that mimics patient characteristics and could help investigate the nociceptive molecular significance underlying neuropathic pain.

Che istituisce un modello murino di una neuropatia pura piccola fibra con l'agonista Ultrapotent di Transient Receptor potenziali vanilloidi tipo 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...