Name: stereotactic adoptive transfer of cytotoxic immune cells in murine models of orthotopic human glioblastoma multiforme xenografts
Uploaded: 2018-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts at JoVE.com

Gli autori ringraziano il personale dell'ospedale universitario animale impianto (UTE) di Nantes per zootecnia e cura, il cellulare e tessutale, funzione di memoria dell'Università di Nantes (MicroPICell) di imaging per l'imaging e l'impianto di citometria (Cytocell) da Nantes per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dalla INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa n #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO interregionale 2017) e il Consorzio europeo Transcan2 di ERA-Net (Immunoglio). La squadra è finanziata dalla Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Questo lavoro è stato realizzato nel contesto di LabEX IGO e i programmi di IHU-Cesti, supportato con la nazionale Ricerca agenzia Investissements d'Avenir tramite i programmi ANR-11-LABX-0016-01 e ANR-10-IBHU-005, rispettivamente. Il progetto di IHU-Cesti è anche supportato da Nantes Métropole e della regione Pays de la Loire. Gli autori ringraziano Chirine Rafia per fornire aiuto nella correzione del manoscritto.

Il seguente procedura che coinvolge animali soggetti è stato eseguito secondo le linee guida istituzionali (contratto n. 00186.02; comitato etico regionale della Pays de la Loire [Francia]). PBMCs umano sono stati isolati da sangue raccolto da donatori sani informati (Etablissement Français du Sang Nantes, Francia). Tutti i passaggi sono eseguiti in condizioni di sterilità.
1. non-specifico espansione dei linfociti T citotossici effettori
<ol><li>Preparare e irradiare le cellule di alimentatore a 35 Gy. Per la stimolazione di 2 x 105 - 4 x 105 cellule effettrici, preparare 10 x 106 PBMCs e 1 x 106 BLCLs da tre distinti donatori sani.</li>
	<li>Risospendere le cellule di alimentatore sia cellule effettrici in 15 mL di RPMI completato con 10% FCS inattivati al calore, di 2 mM L-Glutammina, di penicillina (100 UI/mL) e di streptomicina (0,1 µ g/mL) e del-2 ricombinante di 300 IU/mL.</li>
	<li>Aggiungere PHA-L ad una concentrazione finale di 1 µ g/mL, mescolare accuratamente e distribuire 150 µ l della sospensione delle cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti con fondo U.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C e 5% CO2 in atmosfera umidificata.</li>
	<li>Controllare ogni giorno la piastra fino a grandi cellule ciuffi forma nei pozzetti cultura (~ giorno 7).</li>
	<li>Trasferire le cellule in un matraccio di cultura a 1 x 106 cellule/mL nel terreno di coltura fresco.</li>
	<li>Determinare il numero totale delle cellule contando (2 volte alla settimana) e mantenerli a 1 x 106 cellule/mL nel terreno di coltura fresco. Nota: Le cellule immunitarie effettrici dovrebbero essere pronte per la somministrazione terapeutica presso lo stato di riposo (di solito 3 settimane dopo stimolo di amplificazione iniziale). La purezza e la reattività di queste cellule effettrici dovrebbe essere controllati prima in vivo iniezioni (ad es., con saggi in vitro ).</li>
</ol>2. preparazione di cellule effettrici pre-operatoria
<ol><li>Dopo aver controllato il conteggio delle cellule effettrici, raccogliere le cellule effettrici in un tubo da 50 mL mediante centrifugazione (300 x g per 5 min). Nota: Per compensare eventuali perdite, preparare un eccesso di cellule (ad es., 50 x 106).</li>
	<li>Con attenzione rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 15 mL di PBS sterile e centrifugare per 5 minuti a 300 x g per eseguire il lavaggio.</li>
	<li>Attentamente e completamente rimuovere il supernatante e quindi risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Trasferire le cellule sedimento in una microprovetta 1,5 mL per centrifugazione a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Attentamente e completamente eliminare il surnatante pipettando lentamente.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 8 µ l di PBS sterile per topo. Nota: Questo è un passo fondamentale.</li>
	<li>Misurare il volume della sospensione cellulare utilizzando una micropipetta. Se necessario, aggiungere PBS sterile (20 x 106 cellule in 15 µ l di PBS per dose) e mescolare con cura.</li>
	<li>Controllare, usando una micropipetta, che il volume finale del mouse è tra 15 e 20 μL (imperativamente < 20 µ l).</li>
	<li>Mantenere le cellule su ghiaccio fino a iniezione stereotactic. Nota: più di 3-h punti temporali non sono stati testati.</li>
</ol>3. stereotassica iniezione
<ol><li>
Installazione dell'apparecchio
	<ol>
<li>Assemblare e calibrare una piccola cornice stereotassica animale secondo le istruzioni del produttore per garantire la precisione delle iniezioni intracraniche (ad es., siringa dimensioni, volume desiderato e tasso di iniezione). Nota: Un tasso di infusione lenta è consigliabile (cioè, 2-3 µ l/min).</li>
		<li>Installare il materiale sotto un armadietto di sicurezza microbica (MSC) per mantenere la sterilità degli strumenti e per proteggere i topi dalle infezioni. Nota: posto "blocchi isotermici" in un bagno di acqua a 37 ° C. Questo sistema limita l'ipotermia dei topi durante l'intervento chirurgico. Termofori, che sono necessari per la cura post-operatoria, deve essere usato durante il monitoraggio continuo della temperatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione pre-operatoria di animale
	<ol>
<li>Anestetizzare un mouse con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (10 mg/mL) e xilazina (0,1 mg/mL) a 10 µ l/g di peso corporeo del mouse.</li>
		<li>Eseguire un test di pizzico di punta per garantire la completa anestesia e analgesia dell'animale. Nota: Ogni movimento è un'indicazione di non-profonda analgesia e, in questo caso, un paio di minuti è necessari prima di ripetere l'operazione.</li>
		<li>Una volta che il mouse è adeguatamente anestetizzato, usare le forbici per rimuovere il pelo dal sito chirurgico (tra le due orecchie, fino al naso).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione pre-operatoria delle cellule
	<ol>
<li>Attentamente risospendere le cellule con una pipetta (più volte) prima di ogni iniezione per prevenire qualsiasi cella che ragruppa.</li>
		<li>Disegnare con attenzione il volume di sospensione cellulare richiesto (15-20 µ l) nella microsiringa 22-G per evitare l'aspirazione di bolle. Nota: Questo passaggio cella-caricamento nella microsiringa è importante ridurre al minimo le variazioni nei volumi iniettati. Ricaricare le cellule per ogni iniezione individuale tra procedure per prevenire qualsiasi cella che ragruppa e garantire un numero pari di somministrazione di cellule effettrici nella coorte.</li>
		<li>Quindi, posizionare la siringa nella pompa a siringa adattato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Assistenza processuale
	<ol>
<li>Disinfettare il sito chirurgico con tamponi imbevuti di soluzione al 5% povidone-iodio almeno 3 x.</li>
		<li>Posizionare una pomata oftalmica lubrificante negli occhi del mouse per evitare qualsiasi asciugatura delle cornee.</li>
		<li>Posizione del mouse anestetizzato sulla cornice stereotassica, su un blocco isotermico caldo coperto con un involucro di plastica sterile per mantenere la temperatura del mouse durante la chirurgia e limitare la mortalità. Nota: Il mouse naso e denti dovrebbero essere opportunamente posizionati sopra la barra di dente, per garantire un flusso respiratorio adeguato durante la procedura.</li>
		<li>Una volta che il mouse è posizionato sopra la barra di dente, stringere le barre di orecchio saldamente sotto le orecchie del mouse per immobilizzare la testa. Nota: Fare attenzione a non danneggiare i timpani o compromettere la respirazione.</li>
		<li>Fare un'incisione sagittale della pelle di 1-2 cm del midline con forbici sterili lungo la parte superiore del cranio dall'anteriore al posteriore per esporre il cranio.</li>
		<li>Identificare l'intersezione delle suture sagittali e coronale (Bregma) per servire come punti di riferimento per la localizzazione stereotassica prima dell'iniezione (illustrato nella Figura 1).</li>
		<li>Posto la microsiringa sopra questo punto.</li>
		<li>Spostare la microsiringa laterale di destra 2 e 0,5 mm anteriore del Bregma.</li>
		<li>Utilizzando un microdrill, fare un piccolo foro nel cranio con una punta sterile alle coordinate predeterminate. Fare attenzione a rimanere superficiale al fine di evitare qualsiasi lesione traumatica del cervello. Nota: Nel presente protocollo, le cellule immuni sono state iniettate all'interno di un tumore stabilito (una settimana dopo l'iniezione delle cellule del tumore). La pelle dovrebbe essere riaperta (cicatrice) e l'iniezione viene eseguita presso le stesse coordinate usate per l'impianto delle cellule del tumore (il foro è generalmente ancora presento fino a 2 settimane dopo l'iniezione). Le coordinate sono state selezionate per l'iniezione di cellule del tumore ed effettrici nel parenchima cerebrale13,14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Iniezione di cellule immunitarie effettrici
	<ol>
<li>Inserire con cautela la microsiringa nel foro e, muovendo lentamente, in avanti l'ago 3 giù nella dura e poi indietro 0,5 mm ad una profondità finale di 2,5 mm prima di iniettare le cellule effettrici.</li>
		<li>Eseguire l'iniezione di cellule effettrici a 2-3 µ l/min e monitorare i topi lungo tutto il tempo di iniezione.</li>
		<li>Una volta completata l'iniezione, ritirare l'ago per solo 1 mm e conservare la microsiringa in luogo per un ulteriore minuto prima lentamente ritirando completamente la microsiringa, per evitare eventuali perdite dalla sede di infusione. Nota: Dopo la rimozione dell'animale dal dispositivo stereotassica, pulire immediatamente l'apparecchiatura di iniezione per i prossimi esperimenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Assistenza post-operatoria e follow-up del mouse
	<ol>
<li>Rimuovere l'animale dalla cornice stereotassica e immediatamente applicare soluzione 5% povidone-iodio nel sito di incisione e chiudere la pelle con una sutura chirurgica appropriata.</li>
		<li>Applicare gel di lidocaina 2% direttamente sulla ferita e 0.15 µ g/g di buprenorfina per amministrare un'iniezione sottocutanea per analgesia post-operatoria.</li>
		<li>Posto indietro il mouse anestetizzato per sua gabbia sopra un rilievo di riscaldamento impostato a 37 ° C per mantenere la temperatura corporea di un mouse appropriato ed evitare qualsiasi ipotermia. Nota: Involucro separato non è necessario.</li>
		<li>Monitorare il mouse fino a quando non è completamente recuperato dall'anestesia e trasferirlo in una camera di alloggiamento. Nota: Ad oggi, questo protocollo è ben supportato come poche complicazioni impreviste si sono verificati (< 5% dei topi iniettati).</li>
		<li>Ogni giorno monitorare i topi e li eutanasia quando vengono osservati eventuali segni di salute in declino (ad es., postura ricurva, mobilità ridotta, prostrazione o perdita di peso significativa [≥ 15%]).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Un trasferimento adottivo di selezionato nativo o cellule effettrici immuni ingegnerizzati rappresenta un promettente approccio per trattare efficacemente i tumori, quali i tumori al cervello infiltrativo, avendo cura di limitare le reattività contro le cellule non trasformate15, 16,17,18. Tuttavia, il sistema nervoso centrale, che comprende il cervello, ha una particolare condizione immune, in particolare a causa dell'esistenza della barriera sangue - cervello e la mancanza di un sistema di drenaggio linfatico classica19,20. Queste caratteristiche fisiologiche influenzano tessuto traffico e potrebbero compromettere sistemiche iniezioni di cellule immunitarie. Per superare questi ostacoli, intraparenchymal iniezioni sono state esplorate sul principio che le cellule antitumorali piuttosto localmente vengono consegnate, strettamente al luogo del tumore, per quanto riguarda le microsfere contenenti composti farmacologici21, 22. da un lato, la diluizione limitata dei linfociti all'interno dell'organo potrebbe migliorare la loro efficienza antitumorale, ma esso può anche amplificare meccanica o tumore adattamento effetti deleteri, come la compressione tessutale, che si sta sviluppando lungo cervello crescita del tumore. Ciò implica che questa procedura richiede piccoli volumi di iniezioni di immunoterapia. Questo problema è ancora più critico in modelli sperimentali animali in cui cervello tumori non possono essere asportati chirurgicamente. Questo articolo viene descritto un approccio terapeutico per la preparazione e la consegna locale degli effettori cellulari di tumore-specifici del cervello, basato su stereotactic gruppo dei linfociti T umani allogenici.
Questo studio indica la preparazione e la consegna stereotassica dei linfociti T Vϒ9Vδ2 umani allogenici in topi immunodeficienti NSG portando xenotrapianti umani di GBM. La prima fase del presente protocollo descrive una procedura semplice per amplificare i linfociti T allogenici da PBMCs di donatori sani, utilizzando una stimolazione di PHA-alimentatori-IL2 non specifica standard che produce grandi quantità di linfociti T effettori puro, permettendo loro utilizzo terapeutico23,24. La seconda fase di questo articolo si concentra sulla preparazione di sospensioni del linfocita T a riposo il giorno dell'amministrazione stereotassica. Una particolare attenzione è stata posta su questo importante passo che richiede un'alta densità cellulare che non dovrebbe pregiudicare la redditività e la funzione dei linfociti T effettori selezionato. Infine, per quanto riguarda esperimenti in vivo , la preparazione dei linfociti T effettori e loro iniezione all'interno del nucleo del tumore è associata con la loro diffusione, non solo all'interno del tumore ma anche nei tessuti cerebrali circostanti, mettendo in evidenza loro particolare capacità di pattuglia e di monitorare le cellule del tumore invasivo. D'importanza, questi metodi di preparazione e iniezione mantengono la capacità di questi linfociti T di essere attivato all'interno del cervello su un riconoscimento specifico delle cellule del tumore di cervello. Complessivamente, queste caratteristiche accattivanti assicurano la capacità dei linfociti T a specificamente e in modo efficiente di destinazione ed eliminano le cellule di tumore del cervello profondo infiltrativo che sono un segno distintivo di GBM25. Di nota, una particolare cura deve essere presa durante l'iniezione e la rimozione della microsiringa per ridurre al minimo qualsiasi lesione di cervello o perdite delle cellule effettrici.
In conclusione, questo articolo viene descritto una procedura efficace per fornire grandi quantità di trapianto allogeneic linfociti umani di anti-tumorali, come riposo linfociti umani di Vϒ9Vδ2T, nelle immediate vicinanze dei tumori cerebrali. D'importanza, questa procedura terapeutica non è accompagnata da effetti negativi i linfociti T trasferiti (ad es., vitalità, reattività) o su tessuti cerebrali. Studi recenti, basati su modelli murini orthotopic del glioblastoma umano primario, hanno dimostrato che i linfociti Vϒ9Vδ2T target in modo efficiente cellule di GBM, compreso le cellule del tumore che hanno infiltrato profondamente il cervello parenchima9,11. Questi elementi si aprono opportunità per lo sviluppo del romanzo adottivo T linfociti trasferimento procedure che potrebbero essere applicati in prima istanza in topi portatori di tumori cerebrali orthotopic e, quindi, negli studi clinici in pazienti GBM.

GBM (che grado astrocitoma IV), è il più frequente e aggressivo cancro cerebrali primari negli adulti. Nonostante i trattamenti aggressivi che combinano la chirurgia e la radio-chemioterapia, GBM rimane associato con una prognosi estremamente infausta (sopravvivenza mediana di 14,6 mesi e un 2-anno-mortalità > 73%)1. Questo evidenzia che pochi progressi terapeutici efficienti siano stati convalidati sopra gli ultimi dieci anni2. Tra i candidati per la progettazione delle più efficaci strategie terapeutiche3,4,5, immunoterapie6 sono attualmente esplorati per tenere traccia ed eliminare altamente tumore invasivo e radio/chemio-resistenti cellule, ritenuto sospettate per il loro contributo chiave a tumore rapido e fatale ricaduta7. Vari potenziali bersagli immunologici sono stati individuati e proposti per immunoterapie, che coinvolgano naturale o modificate αβ o linfociti T ϒδ quali antigeni tumorali specifici GBM o indotta da stress molecole8,9, 10. La possibilità di amministrare gli GBM-reattiva effettori delle cellule immuni selezionati rappresenta un'opportunità unica per fornire elevate quantità di linfociti effettori direttamente nel sito di malignità residua. Per supportare questa strategia, abbiamo recentemente dimostrato che modelli basati su topi immunodeficienti xenotrapianti GBM umani primari di orthotopic fedelmente ricapitolano lo sviluppo dei tumori cerebrali in pazienti GBM9,11. Inoltre, questi modelli sono stati utilizzati per dimostrare l'efficacia antitumorale forte dei linfociti Vϒ9Vδ2T passivamente trasferiti umani allogenici.
Questo protocollo descrive la procedura sperimentale critica per raggiungere immunoterapie stereotactic dei tumori cerebrali, come GBM, basato sul trasferimento adottivo di linfociti T allogenici. Illustrato nell'articolo: (i) l'amplificazione dei linfociti terapeutici allogenici T effettori immuni, quali linfociti umani di Vϒ9Vδ2T; (ii) la preparazione di questi linfociti T effettori per iniezione; (iii) la procedura per l'amministrazione stereotactic all'interno del cervello, vicino al tumore. Questo articolo fornisce inoltre la comprensione del comportamento di questi effettori cellulari dopo iniezione stereotactic.
L'approccio terapeutico qui presentata si basa sull'iniezione di 20 x 106 cellule effettrici per dose per ogni mouse immunodeficienti di cervello del tumore-cuscinetto. Un passo di espansione iniziale in vitro è necessaria per produrre grandi quantità di cellule del sistema immunitario. Pertanto, espansioni delle cellule aspecifiche sono effettuati usando la fitoemagglutinina (PHA-L) e irradiato le cellule allogeniche alimentatore: cellule mononucleari sangue periferico (PBMCs) da donatori sani e delle cellule B-linfoblastoidi Epstein Barr Virus EBV-trasformati linee (BLCLs), derivati da PBMCs di infezione in vitro con EBV-contenente cultura surnatante dalla linea cellulare Marmoset B95-8, in presenza di 1 µ g/mL ciclosporina-A.
Le cellule immunitarie effettrici reattive GBM sono rispetto e selezionate da in vitro saggi9. Queste cellule effettrici sono attivate e amplificato mediante protocolli standard, secondo la loro natura (ad es., umano Vγ9Vδ2 T linfociti9 o umano anti-herpes virus αβ T linfociti12) con una purezza minima di > 80%, come ordinariamente controllato dall'analisi cytometric. La procedura di espansione delle cellule riportata di seguito si applica a varie sottopopolazioni di linfociti umani.

<table><tbody><tr><td>PBMCs</td><td></td><td></td><td>from 3 different healthy donors</td></tr><tr><td>BLCLs</td><td></td><td></td><td>from 3 different donors</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>proleukin</td><td></td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>Sigma</td><td>L4144</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Stoelting Co.</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Mouse adaptator for stereotaxic frame&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Stoelting Co.</td><td>51624</td><td></td></tr><tr><td>microsyringe pump injector&amp;nbsp;</td><td>WPI</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil Syringe</td><td>WPI</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>NSG mice</td><td>Charles River</td><td>NSGSSFE07S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Merial</td><td>Imalg&amp;egrave;ne 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td>Rompur 2%</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>WPI</td><td>201758</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>WPI</td><td>501215</td><td></td></tr><tr><td>OmniDrill 115/230V</td><td>WPI</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP397H</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine</td><td>Astrazeneca</td><td>3634461</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotactic adoptive transfer of cytotoxic immune cells in murine models of orthotopic human glioblastoma multiforme xenografts

Multiforme di glioblastoma (GBM), il cancro primario del cervello più frequenti e più aggressivo negli adulti, è generalmente associato con una prognosi difficile, e sono state proposte terapie efficienti scarse nell'ultimo decennio. Tra i candidati promettenti per la progettazione di nuove strategie terapeutiche, immunoterapie cellulari sono stati designati per eliminare altamente invasive e chemio-radioresistenti cellule del tumore, probabilmente coinvolti in una ricaduta rapida e mortale di questo cancro. Così, somministrazioni di trapianto allogeneic GBM-reattiva effettori delle cellule immuni quali linfociti T Vϒ9Vδ2 umani, in prossimità del tumore sarebbe rappresenta un'opportunità unica per fornire efficiente e altamente concentrato agenti terapeutici direttamente nella sito di tumori maligni del cervello. Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept preclinici per sia la fattibilità e l'efficacia antitumorale di questi cellulari immunoterapie che si basano sulle iniezioni di stereotactic dei linfociti umani allogenici all'interno letti tumore intrabrain.

Questo studio descrive la strategia del trasferimento adottivo di cellule effettrici immuni cellulari all'interno del cervello di topi portatori di tumore, basato su stereotactic iniezioni eseguite direttamente all'interno della base del tumore.
Per ridurre al minimo qualsiasi rischio di ferita di cervello connessa con un volume di grande iniezione, la sospensione di cellule effettrici deve essere concentrato (20 x 106 cellule in 15-20 µ l di PBS). Per verificare se questo passaggio di concentrazione delle cellule potrebbe influenzare la vitalità delle cellule effettrici, queste cellule sono state preparate secondo il protocollo descritto e caricate nella microsiringa. Le cellule effettrici sono stati raccolti immediatamente, o 10 minuti dopo averli caricati nella microsiringa. Le cellule sono state macchiate con ioduro di propidio (PI), un agente intercalante fluorescente di DNA che non è permeante di cellule vive e analizzati tramite flusso cytometry timepoints differenti (0, 24 e 72 ore). I risultati mostrano che la preparazione e il caricamento nella microsiringa non influenzano sensibilmente la vitalità delle cellule effettrici per almeno 24 ore (Figura 2A e 2B). A 72 ore, un leggero, ma non significativo, aumento di cellulepositive PI è stato osservato (14% rispetto all'11% per le celle senza carico). In modo simile, è stata analizzata la reattività antitumorale delle cellule effettrici che sono stati preparati e mantenuti su ghiaccio per 3 ore. Cellule effettrici cocultured con cellule di tumore cerebrale per 4 ore in presenza di un mAb anti-CD107a. Il upregulation dell'indicatore di attivazione CD107a, simile al valore ottenuto in condizioni di controllo, indica che la reattività di cellule effettrici non risente la preparazione e il caricamento nella microsiringa (Figura 2).
Per valutare se le cellule effettrici sopravvivono e muovono all'interno del parenchima del cervello seguendo il loro impianto intra-tumorali, 20 x 106 effettrici cellule sono state iniettate nel sito del tumore dei topi portatori di un tumore al cervello (GBM-111). Una settimana più successivamente, i cervelli sono stati raccolti, fisso, sezionato e tinto per la colorazione ematossilina eosina e safran (HES) e anti-umani CD3 mAb (IHC). Colorazione di HES identificato la struttura dei tumori cerebrali (Figura 3, Pannello di sinistra). La macchiatura di CD3 identificato e localizzato linfociti T effettori immuni (qui, le cellule umane Vϒ9Vδ2 T) (Figura 3, Pannello di destra). È interessante notare che, dei linfociti T effettori sono stati rilevati intorno al tumore (Figura 3, Pannello superiore destro), nel nucleo del tumore (Figura 3, centrale pannello di destra), ma anche nell'emisfero controlaterale (Figura 3, Pannello di destra inferiore). Inoltre, la funzione dei linfociti T umani isolati dal cervello del topo 48 ore dopo la loro iniezione (4 x 106 αβ T cellule), che rappresentano il 2% delle cellule cerebrali, è stata analizzata. I risultati indicano che i raccolti cervello-iniettato effettrici αβ allogeniche T espandere e proliferano su un'attivazione di cellule aspecifiche PHA-alimentatore eseguita in presenza di IL-2 (Figura 4).
Insieme, questi risultati mostrano che cellule T effettrici preparato e somministrato sotto queste procedure sopravvivono per ore nel cervello e possono pattuglia all'interno del tumore e i tessuti di cervello sano. Queste procedure sono state utilizzate per valutare l'efficacia antitumorale delle amministrazioni terapeutiche stereotactic delle cellule T Vϒ9Vδ2 umane allogeniche riposa per controllare lo sviluppo di umano GBM cervello tumori9,11. Queste prove di studi che le iniezioni di linfociti allogenici umana T effettrici nel letto del tumore significativamente migliorano la sopravvivenza dei topi portatori di tumori cerebrali. È interessante notare che, sopravvivendo topi non ha trasportato le cellule del tumore rilevabile, indicando così un rifiuto completa del tumore.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig1.jpg"> Figura 1 : Foto dei principali punti di riferimento anatomici sul cranio del mouse. Questo include sagittale (linea rossa) e suture coronali (linea blu) e loro intersezione (Bregma) utilizzate per orientare il sito di iniezione. La barra della scala è indicata. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57870/57870fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig2.jpg"> Figura 2 : Preparato di sopravvivenza e l'attivazione di linfociti T effettori. Cellule effettrici (riposo qui, cellule Vϒ9Vδ2 T periferico umane) sono stati amplificati e preparati secondo la procedura descritta. Colorazione dei linfociti con ioduro di propidio (PI), un DNA intercalanti composto fluorescente che non permeante a vivere le cellule e l'attivazione funzionale sono stati effettuati. (A), questo pannello mostra un terreno rappresentativo di avanti (FSC-H) contro laterale (SSC-H) dispersione gating di linfociti effettori (Pannello sinistro). L'istogramma mostra la colorazione PI dei linfociti con cancello di controllo (Pannello di destra). È indicata la percentuale di linfocitipositivi PI. (B), questo pannello mostra la percentuale di linfociti morti (PIpositivo) raccolta immediatamente (linea azzurra) o dopo 10 min (linea blu scuro) nella microsiringa, misurato timepoints indicato. Come controllo, scaricate cellule preparate sono state usate (grigio linea). (n = 3; media ± DS; ns = non significativo.) (C) CD107a superficie mobilitazione è stata misurata da citometria a flusso su entrambi cellule controllopositivo Vδ2 (impreparate) o preparati linfociti mantenuti sul ghiaccio (preparati + 3 h) dopo un coculture con le cellule del tumore di cervello umano primario obiettivo. La percentuale dei linfociti è indicata in ogni quadrante cytometric. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57870/57870fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig3.jpg"> Figura 3 : Rilevazione e la localizzazione dei linfociti T effettori all'interno del cervello dei topi del tumore-cuscinetto. Una settimana dopo il glioblastoma del cervello impianto del tumore, le cellule immunitarie effettrici (riposo qui, cellule Vϒ9Vδ2 T periferico umane) sono state iniettate nei cervelli dei topi. Una settimana dopo il trattamento di immunoterapia, i cervelli sono stati raccolti, corretti e sezionati. Sezioni del cervello sono state colorate per analisi immunohistochemistry (ematossilina eosina e safran [HES] colorazione) (Pannello sinistro) o colorati con anticorpo anti-umano CD3 (Pannello di destra). I risultati mostrati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. La barra della scala è indicata.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig4.jpg"> Figura 4 : Attivazione dei linfociti T effettori raccolti dal cervello di topi trattati. Linfociti T umani che riposo (, 4 x 106 umano αβ T linfociti) sono stati iniettati nei cervelli dei topi NSG. Dopo 48 ore, i cervelli sono stati raccolti e dissociati. La percentuale di linfociti T umani della cervello-infiltrazione è stata misurata da citometria a flusso utilizzando anticorpi anti-umani CD3 (Pannello inferiore). Le cellule raccolte sono state seminate (10 cellule/pozzetto) in piastre da 96 pozzetti con fondo U e stimolata (cellule di PHA-alimentatore e il-2) per 20 giorni (16 cicli di raddoppio). Nota, il giorno 10, 13,3 x 106 di linfociti T umani sono stati ottenuti (Pannello di destra).

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Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico

Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept per sia la fattibilità e l'efficacia antitumorale di immunoterapie cellulari intrabrain-consegnato.

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K Views.  CRCINA. Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept per sia la fattibilità e l'efficacia antitumorale di immunoterapie cellulari intrabrain-consegnato.

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A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

Un semplice metodo vite Guida per intracranica Studi dello xenotrapianto in topi

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Ricerca

Medicina

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

La radioterapia combinata in un modello di tumore ortotopico cervello di topo

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotassica impianto intracranico e<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent di xenotrapianti di tumori in un sistema modello del mouse di Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary orthotopic xenografts recapitulate the histopathological and molecular features of malignant glioma subtypes in preclinical animal models. To model WHO grades III and IV malignant gliomas in transplantation assays, human tumor cells are xenografted into an orthotopic site, the brain, of immunocompromised mice. In contrast to secondary xenografts that utilize cultured tumor cells, human glioma cells are dissociated from resected specimens and transplanted without prior passage in tissue culture to generate primary xenografts. The procedure in this report details tumor sample preparation, intracranial transplantation into immunocompromised mice, monitoring for tumor engraftment and tumor harvesting for subsequent passage into recipient animals or analysis. Tumor cell preparation requires 2 hr and surgical procedure requires 20 min/animal.

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary orthotopic xenografts recapitulate the histopathological and molecular features of malignant glioma subtypes in preclinical animal models.

Gli xenoinnesti glioma ortotopici primari ricapitolano la crescita infiltrativa e la mutazione isocitrato deidrogenasi I

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

Generazione di cellule CAR T per adottiva terapia nel contesto di Glioblastoma standard di cura

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Immunologia e infezioni

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain tumors. Unlike xenograft tumors, in GEMs, tumors arise in the native microenvironment in an immunocompetent mouse. However, the use of GBM GEMs in preclinical treatment studies is challenging due to long tumor latencies, heterogeneity in neoplasm frequency, and the timing of advanced grade tumor development. Mice induced via intracranial orthotopic injection are more tractable for preclinical studies, and retain features of the GEM tumors. We generated an orthotopic brain tumor model derived from a GEM model with Rb, Kras, and p53 aberrations (TRP), which develops GBM tumors&#160;displaying linear foci of necrosis by neoplastic cells, and dense vascularization analogous to human GBM. Cells derived from GEM GBM tumors are injected intracranially into wild-type, strain-matched recipient mice and reproduce grade IV tumors, therefore bypassing the long tumor latency period in GEM mice and allowing for the creation of large and reproducible cohorts for preclinical studies. The highly proliferative, invasive, and vascular features of the TRP GEM model for GBM are recapitulated in the orthotopic tumors, and histopathology markers reflect human GBM subgroups. Tumor growth is monitored by serial MRI scans. Due to the invasive nature of the intracranial tumors in immunocompetent models, carefully following the injection procedure outlined here is essential to prevent extracranial tumor growth.

Here, we describe a preclinical orthotopic mouse model for GBM, established by intracranial injection of cells derived from genetically engineered mouse model tumors. This model displays the disease hallmarks of human GBM. For translational studies, the mouse brain tumor is tracked by in vivo MRI and histopathology.

Modelli ortotopici traslazionali di glioblastoma multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

Ricerca sul cancro

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Creazione anatomicamente accurati e riproducibili intracranica xenotrapianti di tumori cerebrali umani

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

An Immunocompetent Murine Model for Laser Interstitial Thermal Therapy of Glioblastoma

Glioblastoma (GB), the most aggressive form of primary brain cancer, accounts for approximately half of all high-grade primary brain tumors in adults and has no cure. Laser interstitial thermal therapy (LITT) is a Food and Drug Administration (FDA)-approved treatment for GB and is used in patients who may not be candidates for conventional surgical resection. While the clinical efficacy of LITT has been established, research beyond clinical case studies and case series is limited and hindered by the lack of an established animal model. This protocol uses C57BL/6 mice and syngeneic CT2A glioma cancer cell line to closely recapitulate human GB&#160;while also using a 1064 nm Neodymium-doped Yttrium Aluminum Garnet (Nd:YAG) laser, such as is used in one of the two FDA-approved LITT systems, providing excellent pre-clinical relevance. The successful establishment of this LITT murine model will provide a valuable platform for investigating the unique features of LITT ablation and its effects on the tumor microenvironment, potentially leading to improved therapeutic strategies.

Glioblastoma is a devastating form of primary brain cancer, and laser interstitial thermal therapy is emerging as a promising alternative to conventional surgical resection for inoperable glioblastoma. This protocol describes an optimized pre-clinical mouse model that can be used to study treatment effects or adjuvant and combinatorial treatments.

Un modello murino immunocompetente per la terapia termica interstiziale laser del glioblastoma

Glioblastoma (GB), the most aggressive form of primary brain cancer, accounts for approximately half of all high-grade primary brain tumors in adults and ...

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of neuro-oncology. One of the most widely used techniques is the orthotopic intracranial injection, a method that allows investigating of tumor growth, invasion, and dissemination within a controlled setting. This technique involves transplanting tumor cells from a specific patient region into the corresponding anatomical site in an animal. By doing so, these orthotopic brain tumor models offer a unique advantage, as they more accurately replicate cancer's biological behavior and its interactions with the brain environment seen in human patients. This makes them especially valuable for preclinical therapeutic testing, where a close resemblance to the clinical scenario is essential for evaluating potential treatments. This protocol shares experiences in developing patient-derived xenograft (PDX) models for pediatric brain tumors, including diffuse midline glioma (DMG), glioblastoma (GBM), medulloblastoma, and ependymoma. This method delineates the procedure for conducting intracranial stereotaxic injections in mice, ensuring the correct targeting of the injection site within the brain. Additionally, we describe the post-procedural monitoring system employed to detect signs of successful tumor engraftment. Following tumor injection, a rigorous monitoring system is implemented to observe the animals for any signs of neurological impairment, behavioral changes, and/or weight loss, which are common indicators of tumor progression. This system allows for timely intervention and provides critical data regarding the tumor's growth dynamics. By refining these models and protocols, we aim to enhance the reliability and translational potential of preclinical studies, contributing to the development of more effective treatments for pediatric CNS tumors.

The development of orthotopic pediatric brain tumor models requires meticulous precision, using a stereotaxic device to implant cancer cells precisely. The methodology presented here outlines the steps involved in preparing brain tumor cells, performing intracranial injections, and implementing a post-operative monitoring system to assess brain tumor engraftment.

Istituzione di modelli ortotopici di xenotrapianto derivati da pazienti per tumori cerebrali utilizzando un dispositivo stereotassico

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of ...

Image-Guided Resection of Glioblastoma and Intracranial Implantation of Therapeutic Stem Cell-seeded Scaffolds

Glioblastoma (GBM), the most common and aggressive primary brain cancer, carries a life expectancy of 12-15 months. The short life expectancy is due in part to the inability of the current treatment, consisting of surgical resection followed by radiation and chemotherapy, to eliminate invasive tumor foci. Treatment of these foci may be improved with tumoricidal human mesenchymal stem cells (MSCs). MSCs exhibit potent tumor tropism and can be engineered to express therapeutic proteins that kill tumor cells. Advancements in preclinical models indicate that surgical resection induces premature MSC loss and reduces therapeutic efficacy. Efficacy of MSC treatment can be improved by seeding MSCs on a biodegradable poly(lactic acid) (PLA) scaffold. MSC delivery into the surgical resection cavity on a PLA scaffold restores cell retention, persistence, and tumor killing. To study the effects of MSC-seeded PLA implantation on GBM, an accurate preclinical model is needed. Here we provide a preclinical surgical protocol for image-guided tumor resection of GBM in immune-deficient mice followed by MSC-seeded scaffold implantation. MSCs are engineered with lentiviral constructs to constitutively express and secrete therapeutic TNF&#945;-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) as well as green fluorescent protein (GFP) to allow fluorescent tracking. Similarly, the U87 tumor cells are engineered to express mCherry and firefly luciferase, providing dual fluorescent/luminescent tracking. While currently used for investigating stem cell mediated delivery of therapeutics, this protocol could be modified to investigate the impact of surgical resection on other GBM interventions.

Tumor-seeking therapeutic mesenchymal stem cells (MSCs) show promise as a treatment for invasive glioblastoma. Optimal transplantation involves delivery of MSCs into the tumor resection cavity on scaffolds. Here, preclinical techniques to study MSC treatment of glioblastoma are provided including: image-guided tumor resection; implantation of MSC-seeded scaffolds; and postoperative therapy tracking.

Immagine-Guida di resezione del Glioblastoma e l'impianto intracranico di terapeutica delle cellule staminali-seminato ponteggi

Glioblastoma (GBM), the most common and aggressive primary brain cancer, carries a life expectancy of 12-15 months. The short life expectancy is due in ...