Name: extraction of hemocytes from drosophila melanogaster larvae for microbial infection and analysis
Uploaded: 2018-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis at JoVE.com

Siamo grati al Dr. Robert Heinzen per fornire scorte di mCherry-esprimendo il burnetii della coxiella. Ringraziamo il Dr. Luis Teixeira per la fornitura di invertebrati marini iridescente virus 6 e il centro di Stock di Bloomington per fornire scorte volare. Questo progetto è stato finanziato in parte dalla concessione di NIH R00 AI106963 (al A.G.G) e Washington State University.

1. infezione ex vivo
<ol><li>Medium e attrezzature<ol>
<li>In condizioni di sterilità, preparare fresco Drosophila emociti isolamento medio (DHIM) contenente di 75% Schneider Drosophila medie con 25% siero bovino fetale (FBS) e filtro sterilizzarlo.</li>
		<li>Strato 2-3 pezzi di pellicola di paraffina di 10 x 10 cm sotto un microscopio stereoscopico.</li>
		<li>Preparare il capillare di vetro. Impostare la stufa capillare estrattore al 55% del massimo. Tirare il tubo capillare di una punta acuminata di circa 10 µm.</li>
		<li>Recupero di informazioni del capillare con olio minerale.</li>
		<li>Assemblare il tubo capillare riempito sul nanoinjector (Figura 1A) e aprire punta fuso tubo capillare rompendo fuori la punta con il forcipe (Figura 1B). Il diametro esterno della punta dovrebbe essere 100 µm per facile assorbimento degli emociti.</li>
		<li>Espellere tanto olio quanto possibile dalla punta tubo capillare, quindi riempire con DHIM. Per una visualizzazione semplice del bordo dell'emolinfa up-preso e l'olio, includono una bolla d'aria tra l'olio e DHIM (Figura 1B').</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrazione di emolinfa<ol>
<li>Scegli 3rd instar larve di Drosophila dall'interno muro di cibo fiale delicatamente usando il forcipe e inserirli in un colino di 100 µm (Figura 1C). 3rd instar larve si trovano 3-6 giorni successivi fertile uova da una femmina adulta. Nota: Questi esperimenti usato il genotipo, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w+ mC= UAS-2xEGFP} AH2, poiché emociti da questi animali esprimono la proteina fluorescente verde avanzata (EGFP) per aiutare nella identificazione delle cellule mediante microscopia.</li>
		<li>Versare 5 mL di acqua sterile sopra larve e scuotere il filtro per 5 s. posto il filtro sulla cancellazione di attività eliminare l'acqua in eccesso (Figura 1C').</li>
		<li>Trasferire le larve in una microcentrifuga da 1,5 mL. Anestetizzare li con CO2 gas per 5 s (Figura 1D).</li>
		<li>Posizionare le larve sulla pellicola di paraffina sotto lo stereomicroscopio, con il dorso rivolto verso l'alto (Figura 2A).</li>
		<li>Luogo il vetro capillare leggermente sul corpo posteriore larvale per tenerlo in posizione e disturbare la cuticola posteriore aperto utilizzando una pinzetta appuntita (Figura 2B).</li>
		<li>Consentire l'emolinfa di fluire sulla pellicola paraffina (Figura 2C).</li>
		<li>Rendere un pool di emolinfa compreso emociti da larve di 20-50 alla volta sul film di paraffina.</li>
		<li>Prendere l'emolinfa pool utilizzando il vetro capillare su nanoinjector (Figura 2D). Nota: Ci dovrebbe essere di circa 10-20 µ l di emolinfa.</li>
		<li>Espellere l'emolinfa in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 500 µ l di DHIM (Figura 2E).</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 1.2.4) - 1.2.9) per ogni batch di larve.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contare il numero di emociti.<ol>
<li>Pipettare 5 µ l di soluzione di blu di Trypan 0,4% in un tubo del microcentrifuge 0,6 mL a macchiare le cellule morte. Delicatamente mescolare il DHIM ed emociti nel tubo da 1,5 mL utilizzando una pipetta e trasferire 5 µ l di DHIM tra cui emociti al tubo del microcentrifuge 0,6 mL e mescolare delicatamente.</li>
		<li>Pipettare 10 µ l di cellule da miscela 1:1 di Trypan blu: emociti nell'emocitometro.</li>
		<li>Contare il numero di emociti dal vivo che non sono macchiati con Trypan blu in ogni campo 4 angolo dell'hemocytomter e calcolare la concentrazione di emociti per millilitro usando la formula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq1.jpg"> dove X è la concentrazione di emociti live per millilitro; a, b, c e d sono contato il numero di cellule vive (come determinato dall'esclusione del Trypan blu) in ogni 4 dei campi nell'emocitometro. Divisione per 2 il numero totale di cellule contate è dovuto alla diluizione di 1:1 delle cellule con Trypan blue. Le cellule colorate con Trypan blue sono considerate morte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ex vivo Infezioni<ol>
<li>Determinare il numero di pozzetti di essere seminato con celle basate su punti temporali e biologico replica necessario per ogni esperimento. 5.0 × 104 emociti sono desiderabili per la purificazione di RNA e proteine dopo l'infezione.</li>
		<li>Calcolare il volume di stock di agente patogeno essere diluiti con DHIM per infezione utilizzando la seguente formula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq2.jpg"> dove molteplicità di infezione (MOI) è il numero di virali o batteri desiderato per ogni cella. Nota: MOI utilizzato dipende dal singolo esperimento e analisi eseguite. Qui, 10 equivalenti di genoma (GE) / cellula di c. burnetii, 10 CFU/di Listeriao 1 TCID50valore di IIV6 è stato usato.</li>
		<li>Preparare 500 µ l di terreno di agente patogeno per ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti aggiungendo un volume adeguato di DHIM al volume virale o batterico in un tubo.</li>
		<li>Posto un 12 millimetri rotonda copertura in vetro (spessore n ° 1) in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.</li>
		<li>Dividere il DHIM compreso gli emociti nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di terreno di agente patogeno di emociti in un pozzo.</li>
		<li>Centrifugare la piastra a 1.000 x g per 5 min.</li>
		<li>Incubare la piastra per 1 h a 28 ° C. Ogni 15 min, inclinare delicatamente la piastra dalla parte posteriore a anteriore, quindi da sinistra a destra per 5 s a mano.</li>
		<li>Dopo 1 h di passaggio invasione/allegato 1.4.8), delicatamente Pipettare fuori il mezzo di agente patogeno e lavare gli emociti con DHIM fresco e riempirlo con 500 µ l di DHIM fresca.</li>
		<li>Incubare gli emociti infetti per il tempo desiderato. In questi esperimenti, da c. burnetii- o IIV6-infettati emociti vengono incubati per 24 h e Listeria-emociti infetti vengono incubate per 1, 2 o 4 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. infezione in vivo
<ol><li>Infezione<ol>
<li>Caldo il piatto di agar succo frutta Drosophila a temperatura ambiente per 15 min. piastre sono realizzati come precedentemente descritto20.<ol>
<li>Aggiungere 30 g di agar a 700 mL di acqua e autoclave per 40 min.</li>
			<li>Sciogliere 0,5 g di paraben metilico in 10 mL di etanolo assoluto.</li>
			<li>Aggiungere la soluzione di paraben metilico in 300 mL di succo di frutta concentrato.</li>
			<li>Mescolare il succo concentrato nella soluzione agar sterilizzato nell'autoclave e pipettare 5 mL in 10 × 35 mm piastre Petri rapidamente.</li>
			<li>Dopo le piastre sono raffreddati per 15 min, conservarli a 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare 3rd instar larve come segue 1.2.1) - 1.2.3).</li>
		<li>Posizionare la pasta di lievito su una piastra di agar. Fare un taglio sottile nella piastra di agar dove le larve possono migrare per evitare la disidratazione (Figura 3A). Montare un ago di tungsteno appuntito di 0,001 mm con che tiene il forcipe usando la pellicola di paraffina (Figura 3B, C).</li>
		<li>Pipettare 50 µ l di alto-titolo mCherry esprimenti -da c. burnetii (5.95 × 109 GE/mL) sulla paraffina della pellicola sotto il microscopio stereo e posizionare le larve nella piscina di batteri.</li>
		<li>Posizionare le larve nella piscina di batteri. Pungere le larve con un ago di tungsteno (Figura 3D). Trasferire le larve su una piastra di agar (Figura 3E).</li>
		<li>Trasferire il restante mezzo agente patogeno sulla piastra di agar e sigillare la piastra con la pellicola di paraffina.</li>
		<li>Mantenere le larve sulla piastra in aria umida fino a quando post-l'infezione tempo desiderato (Figura 3F). In questo esperimento, da c. burnetii-larve infette sono sul piatto per 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrazione di emolinfa e placcatura di emociti<ol>
<li>Preparare il mezzo e attrezzatura seguendo passo 1.1).</li>
		<li>Posto un 12 millimetri rotonda copertura in vetro (spessore n ° 1) in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Pipettare 500 µ l di DHIM nel pozzo.</li>
		<li>Estrarre l'emolinfa dalle larve infette come segue 1.2.4) - 1.2.8).</li>
		<li>Espellere l'emolinfa in seguito di ben punto 2.2.2).</li>
		<li>Ripetere 2.2.3) e 2.2.4) per più gruppi di larve.</li>
		<li>Centrifugare la piastra a 1.000 x g per 5 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. visualizzazione
<ol><li>Fissazione e colorazione<ol>
<li>Dopo aver consentito l'emociti di stabilirsi sul vetro di copertura rotondo nel pozzo, rimuovere delicatamente il mezzo da ogni pozzetto.</li>
		<li>Delicatamente aggiungere 200 µ l di paraformaldeide al 4% (PFA) in ciascun pozzetto di emociti depositati. Incubare gli emociti per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il 4% PFA e delicatamente aggiungere 200 µ l di PBS contenente 0,1% Triton X-100 e 1% albumina di siero bovino (BSA) in ciascun pozzetto. Incubare gli emociti per 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il PBS e delicatamente aggiungere 200 µ l di 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in ciascun pozzetto. Incubare gli emociti per 10 min al buio a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione DAPI e aggiungere delicatamente PBS in ciascun pozzetto. Incubare gli emociti per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Goccia 10 µ l del mezzo di montaggio antifade su un vetrino per microscopio.</li>
		<li>Dopo aver rimosso il PBS da ogni pozzetto, è necessario rimuovere il vetro di copertura dalla piastra 24 pozzetti utilizzando forcipe ammenda-aguzzo. Posizionare delicatamente il vetro di copertura sul supporto montaggio antifade su vetrino, con gli emociti rivolto verso il basso.</li>
		<li>Lasciar asciugare inserendolo nella notte scura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Formazione immagine confocal<ol>
<li>Configurare il microscopio confocale per formazione immagine di DAPI, EGFP e mCherry tre di colore. Utilizzare la seguente impostazione: eccitazione DAPI (ex) 405 nm, emissione (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.</li>
		<li>Posizionare il campione sul microscopio e messa a fuoco sul campione utilizzando un 63 X / 1.4 obiettivo apertura numerica (NA). Individuare gli emociti desiderati nel campo di vista per l'imaging.</li>
		<li>Regolare i guadagni di potenza e rilevatore laser per ottenere esposizione appropriata del campione. Verifica z-piani multipli per garantire che il livello di esposizione è appropriato per lo spessore dell'intero campione.</li>
		<li>Trovare la posizione superiore e inferiore sull'asse z di un intero emociti. Impostare queste posizioni come le posizioni di inizio e di fine per il sezionamento di z.</li>
		<li>Utilizzare solo scansione zoom all'immagine l'area che contiene l'emociti. Spesso vengono utilizzati fattori di zoom di 3x.</li>
		<li>Raccogliere la serie di immagini a risoluzione appropriata come 1024 x 1024 pixel nel piano x-y e 0,3 µm spaziatura nella dimensione z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ricostruzione del modello 3D Nota: Il software Open source esistente che esegue molte delle funzioni descritte di seguito per la ricostruzione del modello 3D.<ol>
<li>Importare il file di serie z-sezionato immagine nel software associato con il microscopio confocale per la ricostruzione del modello 3D.</li>
		<li>Selezionare una cella risultati co-localizzazione dei nuclei macchiato con DAPI e mCherry esprimendo da c. burnetii in un EGFP esprimendo emociti. Ritagliare l'immagine in serie per contenere solo la singola cella.</li>
		<li>Selezionare l'opzione Visualizzatore 3D che ricostruisce il modello 3D utilizzando pre-confezionati algoritmo del software. Scegliere il tipo di rappresentazione 3D tra Blend, superficie e opzioni miste desiderato. In questo metodo, emociti, nei nuclei e da c. burnetii sono illustrati utilizzando modelli di superficie.</li>
		<li>Osservare la cella ricostruita 3D da diverse angolazioni di visualizzazione tenendo premuto il pulsante del mouse e trascinando il cursore sullo schermo. Regolare l'orientamento della cella e la posizione della sorgente luminosa modellata per ottimizzare l'immagine. Esistono altre opzioni per opacità, minimo e massimo soglia, speculare, Ambient, Shineness e Gamma per ottimizzare l'immagine.</li>
		<li>Prendere le sezioni trasversali attraverso il modello utilizzando i comandi di clipping e sezionamento per visualizzare il contenuto interno degli emociti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. l'applicazione per l'analisi genica e/o proteine
<ol><li>Dopo l'infezione con IIV6 e Listeria, lisare cellule per successive qRT-PCR o analisi Western blot come precedentemente descritto21 e le istruzioni del produttore riportato di seguito. Nota: Consultare la Tabella dei materiali per i primers per qRT-PCR e gli anticorpi per la macchia occidentale.</li>
	<li>Analizzare i prodotti di PCR di elettroforesi del gel dell'agarosi, come descritto in precedenza22, per garantire la corretta lunghezza del prodotto amplificato.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+of+Drosophila.">The immune response of Drosophila.</a> Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).</li><li>Regan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormone+signaling+is+essential+to+regulate+innate+immune+cells+and+fight+bacterial+infection+in+Drosophila.">Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila.</a> PLoS Pathog. 9 (10), 1003720 (2013).</li><li>Yano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+control+of+listeria+through+intracellular+innate+immune+recognition+in+Drosophila.">Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila.</a> Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).</li><li>Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Bacterial+Factors+Control+Susceptibility+of+Drosophila+melanogaster+to+Coxiella+burnetii+Infection.">Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection.</a> Infect Immun. 85 (7), (2017).</li><li>Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+hemocyte+load+is+associated+with+increased+resistance+against+parasitoids+in+Drosophila+suzukii,+a+relative+of+D.+melanogaster.">High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster.</a> PLoS One. 7 (4), 34721 (2012).</li><li>Tsuzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+between+humoral+and+cellular+immune+responses+in+Drosophila.+is+guided+by+the+cytokine+GBP.">Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP.</a> Nat Commun. 5, 4628 (2014).</li><li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+Drosophila.+hemocyte+subsets+by+cell-type+specific+antigens.">Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens.</a> Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).</li><li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+Drosophila+immunity.">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. 68 (1), 116-128 (2014).</li><li>Arefin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+Hemocytes+Induces+a+Shift+in+Effector+Mechanisms+in+the+Drosophila.+Immune+System+and+Leads+to+a+Pro-Inflammatory+State.">Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State.</a> PLoS One. 10 (8), 0136593 (2015).</li><li>Rus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+Filamin-240+in+Drosophila+blood+cells.">Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells.</a> Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).</li><li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemese,+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein,+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila.">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li><li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).</li><li>Bretscher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nimrod+transmembrane+receptor+Eater+is+required+for+hemocyte+attachment+to+the+sessile+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster.</a> Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).</li><li>Zettervall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+directed+screen+for+genes+involved+in+Drosophila+blood+cell+activation.">A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).</li><li>Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicing+of+viral+replication+intermediates+during+silencing+of+latent+Drosophila+viruses.">Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).</li><li>Jovel, J., Schneemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Drosophila+cells+persistently+infected+with+Flock+House+virus.">Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus.</a> Virology. 419 (1), 43-53 (2011).</li><li>Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+extracting+hemocytes+from+wild+caterpillars.">A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars.</a> J Vis Exp. (69), e4173 (2012).</li><li>Sampson, C. J., Williams, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+ex+vivo+incubation+of+Drosophila+primary+post-embryonic+haemocytes+for+real-time+analyses.">Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses.</a> Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).</li><li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+bacterial+intestinal+infections+in+Drosophila+melanogaster.">A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster.</a> PLoS Pathog. 3 (11), 173 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+fruit+juice+egg+plates.">Drosophila fruit juice egg plates.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2007).</li><li>Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invertebrate+Iridescent+Virus+6,+a+DNA+Virus,+Stimulates+a+Mammalian+Innate+Immune+Response+through+RIG-I-Like+Receptors.">Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors.</a> PLoS One. 11 (11), 0166088 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva.">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li><li>Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+inverse+Poisson+distribution+to+calculate+multiplicity+of+infection+and+viral+replication+by+a+high-throughput+fluorescent+imaging+system.">Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system.</a> Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).</li><li>Rizki, T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellocyte+differentiation+in+Drosophila.+larvae+parasitized+by+Leptopilina.">Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina.</a> Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).</li><li>Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+wounding+is+a+minimal+and+sufficient+trigger+for+a+cellular+immune+response+in+Drosophila+melanogaster.">Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster.</a> Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).</li><li>Ozgen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+invertebrate+iridovirus.">Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus.</a> Virus Res. 189, 286-292 (2014).</li><li>Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+first+complete+DNA+sequence+of+an+invertebrate+iridovirus:+coding+strategy+of+the+genome+of+Chilo+iridescent+virus.">Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus.</a> Virology. 286 (1), 182-196 (2001).</li><li>Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Coxiella+burnetii+parasitophorous+vacuole.">The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole.</a> Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+prophenoloxidases+respond+inconsistently+to+Cu2++and+have+different+activity+in+vitro.">Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro.</a> Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).</li><li>De Gregorio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immune-responsive+Serpin+regulates+the+melanization+cascade+in+Drosophila.">An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila.</a> Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).</li><li>Kari, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+raspberry+Gene+Is+Involved+in+the+Regulation+of+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster.">The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).</li><li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Buettner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+analysis+of+cell-to-cell+heterogeneity+in+single-cell+RNA-sequencing+data+reveals+hidden+subpopulations+of+cells.">Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).</li><li>Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Binding+of+the+Conserved+Transcription+Factor+Grainy+Head+to+its+Target+Genes+Throughout+Drosophila+melanogaster+Development.">Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development.</a> Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).</li><li>Yang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomes+of+lineage-specific+Drosophila+neuroblasts+profiled+by+genetic+targeting+and+robotic+sorting.">Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting.</a> Development. 143 (3), 411-421 (2016).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Immune+Circuits+by+Linking+CRISPR-Pooled+Screens+with+Single-Cell+RNA-Seq.">Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq.</a> Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).</li><li>Karaiskos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+embryo+at+single-cell+transcriptome+resolution.">The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution.</a> Science. 358 (6360), 194-199 (2017).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Per comprendere meglio come cellule dell'ospite infettate, è importante chiarire la localizzazione dell'agente patogeno nelle cellule, soprattutto quando si sperimenta il patogeno non precedentemente testato e cella tipo combinazioni4. Mentre studiando la cascata di risposta cellulare dopo l'infezione può indicare invasione produttivo dell'agente patogeno, la combinazione dei dati di risposta cellulare e imaging è essenziale per dimostrare l'infezione e l'invasione dell'agente patogeno. Mentre i rapporti che mostrano immagini 2D dell'invasione di agente patogeno in cellule dell'ospite tende a indicare l'infezione produttiva, alcune domande possono rimanere per quanto riguarda la tempistica dell'invasione di agente patogeno iniziale nelle cellule ospiti. Così, ricostruito da z-sezione scansione di immagini 2D in 3D può rispondere a queste domande e indicare la posizione di agente patogeno nelle cellule ospiti (figure 4 e 5). Tuttavia, una limitazione dell'utilizzo di emociti primarie è la loro longevità nella coltura delle cellule. Un rapporto precedente afferma che emociti sopravvivenza in terreni di coltura delle cellule è solo 8 h18, e nel nostro protocollo di infezione, siamo stati in grado di effettuare dosaggi fino a 24 h, ma non più. Di conseguenza, non era possibile osservare elevati livelli di c. burnetii replica o la formazione del vacuolo parassitoforo che non iniziano a formarsi fino a 2 giorni post-infezione e non è osservabile grandi fino a 4-6 giorni dopo l'infezione30 .
Per molti esperimenti dove i saggi di endpoint utilizzano RNA o proteine per l'analisi, un numero elevato di celle è richiesti solitamente per produrre materiale sufficiente per l'interrogatorio. Ad esempio, qui, usiamo analisi dell'endpoint come Western blotting e qRT-PCR per sondare l'estensione dell'infezione del patogeno in primarie emociti derivato da 3rd instar larve di Drosophila . Così, il metodo qui presentato si concentra sulla dissezione larvale rapida e la raccolta di emolinfa contenente emociti sufficiente dal vivo per l'infezione ex vivo dell'agente patogeno. Questo metodo introduce l'uso di un nanoinjector a prendere l'emolinfa ed emociti rapidamente. Immissione gli emociti in DHIM contenente 25% FBS è importante per la sopravvivenza di emociti. Inoltre, per le infezioni ex vivo qui presentate, è necessari un gran numero di emociti. Per evitare di melanizzazione31,32,33, la dissezione e la collezione di emociti deve accadere rapidamente. Mentre esistono altri metodi per l'estrazione di emociti18,19,23, la durata di questi metodi per raccogliere un numero sufficientemente grande di emociti per ex vivo l'infezione era troppo lungo. La punta fine 100 µm è benefica per l'assorbimento di emolinfa senza occupare altri organi che possono portare all'occlusione dell'ago capillare. L'uso di un nanoinjector può essere automatizzato anche quando è collegato ad una fase di micromanipolatore e a pedale, permettendo all'utente di concentrarsi sulla rapida dissezione delle larve di Drosophila e diminuire il tempo che gli emociti sono senza circostante larvale terreni di coltura di tessuti o cellule. Tuttavia, l'uso di una pipetta è anche disponibile per prendere l'emolinfa per il trasferimento al DHIM. Inoltre, il nostro metodo utilizza gas di CO2 per anestetizzare le larve prima della dissezione; l'uso di un blocco freddo con film di copertura di paraffina è un altro metodo utilizzabile23. Infine, la dissezione delle larve in una goccia di DHIM durante il rilascio di emolinfa può ridurre il numero di emociti che vengono persi da attaccare alla pellicola di paraffina ma aumenterà il tempo necessario per l'assorbimento dall'ago capillare.
Una comune risposta immunitaria in drosofila alla ferita, che si verifica durante l'apertura e la dissezione della cuticola larvale, è melanizzazione31,32,33. Durante l'estrazione di emociti, sarebbe osserviamo melanizzazione di emociti nella DHIM già come 10 min dopo l'estrazione. Come melanizzazione è un processo rapido, queste cellule sarebbero esclusi dagli esperimenti di infezione del patogeno. Inoltre, l'anti-coagulante feniltiourea possa essere aggiunti a DHIM per inibire il sistema di attivazione di phenoloxidase e melanizzazione durante ferendo9. Tuttavia, come melanizzazione e apoptosi sono risposte immunitarie innate di Drosophila, i loro livelli possono essere quantificati dopo l'estrazione emociti e stimolazione utilizzando i metodi descritti qui.
Mentre recuperare grandi quantità di proteina o RNA materiale è un requisito per tecniche quali qRT-PCR e Western blot, nuove tecniche, come ad esempio RNAseq richiedono molto meno materiale, meno di 10 pg di alta qualità di RNA totale da una singola cella34. Esperimenti come questi sollevare questioni sperimentali interessanti, e poiché emociti di Drosophila sono una popolazione eterogenea che contiene cellule di cristallo, plasmatocytes e lamellocytes7, uno potrebbe cominciare ad interrogare la risposta di transcriptional di ogni cella tipo35. Per esempio, Kurucz et al., hanno sviluppato gli anticorpi che potrebbero essere utilizzati per isolare i sottoinsiemi di emociti di Drosophila che potrebbero essere utilizzati per trascrizionale o proteomica profilatura seguendo vari stimoli. Inoltre, il recente sviluppo della singola cella RNAseq tecnologia potrebbe definire trascrittomi di ogni tipo di cellula senza l'uso di anticorpi inizialmente separare ogni cella tipo36,37,38, 39. Inoltre, si potrebbe chiedere domande per quanto riguarda la regolazione genica nei sottoinsiemi di emociti che può aiutarci a capire come umano delle cellule del sangue lignaggi ha avuto origine e si è evoluto da antichi organismi attraverso la genomica comparativa gli sforzi. Affrontare problemi come questi richiede la combinazione di una vasta gamma di tecniche sperimentali, e la tecnica qui descritta può essere utile per tali sforzi quando l'isolamento di un gran numero di emociti dalle larve degli invertebrati è necessaria.
Qui, vi suggeriamo che la combinazione di 3D modelli con dati numerici, biochimici per la conferma dell'infezione. In futuro gli studi, possiamo usare i metodi descritti qui per osservare le risposte immunitarie e il meccanismo dell'invasione di agente patogeno nelle cellule ospiti macchiando co-proteine ospite per analisi di microscopia.

Drosophila melanogaster è un organismo modello consolidata per lo studio della immunità innata1. Durante la risposta immunitaria innata, emociti gioca un ruolo importante nella risposta alla sfida di agente patogeno. Emociti sono critici per incapsulare i parassiti, oltre ad avere una funzione importante nella lotta contro l'agente patogeno attraverso azione fagocitica durante infezione fungine, virali e batteriche2,3.
Al fine di meglio comprendere la risposta immunitaria innata dell'ospite all'infezione microbica patogena, è importante visualizzare come l'agente patogeno invade le cellule dell'ospite durante l'infezione. Questa visualizzazione contribuisce alla comprensione del meccanismo di invasione. Insieme ai dettagli della localizzazione intracellulare di agente patogeno e la risposta cellulare, questi dati possono fornire indizi circa la risposta dell'ospite all'infezione ed organelli cellulari con cui interagisce il microbo. Così, la ricostruzione del modello 3D dopo formazione immagine di microscopia può essere utile per determinare l'esatta posizione di agenti patogeni e cellule ospiti. In questo studio, abbiamo visualizzato l'invasione della Coxiella burnetii (c. burnetii), l'agente eziologico della febbre Q, una malattia zoonotica che rappresenta una grave minaccia per la salute umana e animale, in primarie emociti di Drosophila . Recentemente, è stato dimostrato che Drosophila sono sensibili al livello di biosicurezza 2 fase di Nine Mile II (NMII) clonare 4 ceppo di c. burnetii e che questo ceppo è in grado di replicare in drosofila4, che indica che Drosofila può essere utilizzato come organismo modello per studiare la patogenesi da c. burnetii .
Gli studi precedenti hanno usato emociti di esaminare la risposta immunitaria innata dell'ospite. Emociti sono stati utilizzati per osservazioni morfologiche5,6,7, analisi morfometrica2,8, fagocitosi analisi2,3, qRT-PCR2 , 9, immunoprecipitazione10,11, analisi immunofluorescente10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 e immunohistochemistry9,14. Anche se le cellule della drosofila S2 sono anche disponibile per vari esperimenti in vitro , immortalizzazione e potenziale pre-esistente infezione virale cambiare loro comportamento15,16. L'utilizzo di cellule primarie al contrario di una linea di cellule immortalizzate, quali cellule S2, consente lo studio della funzione immune innata in un sistema più rappresentativo dell'intero organismo. Inoltre, l'infezione di emociti in vivoprima dell'estrazione, permette alle cellule di interagire con altre proteine ospite ed il tessuto, un vantaggio sopra estrazione di emociti prima dell'infezione ex vivo . Un numero di metodi differenti è stato utilizzato per ottenere un numero sufficiente di emociti in un breve periodo di tempo per mantenere l'emociti vivo8,17,18,19.
In questo studio, presentiamo un metodo per estrarre emociti da Drosophila 3rd instar larve per infezione microbica patogena con da c. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) o invertebrato iridescente Virus 6 (IIV6). Descriviamo i metodi per le infezioni di emociti sia in vivo ed ex vivo . In vivo- ed ex vivo-emociti infetti sono stati visualizzati con microscopia confocale e utilizzati per creare modelli 3D di invasione da c. burnetii . Inoltre, utilizzando il protocollo di estrazione, ex vivo-emociti infetti sono stati utilizzati per l'espressione genica e proteica saggi. In particolare, per esaminare l'estensione dell'infezione con IIV6 e Listeria, RNA o la proteina totale è stata isolata dalle cellule per qRT-PCR o analisi Western blot. Presi insieme, il protocollo fornisce i metodi per raccogliere rapidamente un numero elevato di emociti da 3rd instar larve e prove che primari emociti, infetto in vivo o ex vivo, sono una piattaforma adatta per microbica agente patogeno infezione studi e analisi applicabili a valle quali microscopia, trascrittomica e proteomica.

<table><tbody><tr><td>Schneider&#039;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>21720024</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences&amp;nbsp; (HyClone)</td><td>SH30070.03HI</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Filter (0.22 &amp;micro;L)</td><td>RESTEK</td><td>26158</td><td>1.1.1)</td></tr><tr><td>Strainer (100 &amp;micro;m)</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td>1.2.1), 2)</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Amscope</td><td>SM-1BSZ-L6W</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-171-4</td><td>1.1), 1.2), 2)</td></tr><tr><td>Capillary puller</td><td>Narishige International USA, Inc.</td><td>PC-10</td><td>1.1.3)</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Snow River Products</td><td></td><td>1.1.4)</td></tr><tr><td>Nanoinjector</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td>1.1), 1.2), 2.2)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td>1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;delivery apparatus</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122BC</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15250061</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Coxiella burnetii&lt;/em&gt; - mCherry</td><td>Dr. Heinzen, R.</td><td></td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; fruit juice plates</td><td>Cold Spring Harbor Protocols</td><td></td><td>2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423-500</td><td>2.1.1.1)</td></tr><tr><td>Methyl paraben</td><td>Amresco</td><td>0572-500G</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2818-500</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Welch&#039;s 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL</td><td>Amazon</td><td>B0025UJVGM</td><td>2.1.1.3)</td></tr><tr><td>Petri dishes, 10 x 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>2.1.1.4)</td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td>1.4.4), 2.2.2)</td></tr><tr><td>Yeast, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>0210140001</td><td>2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)</td></tr><tr><td>Tungsten needle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Holding forceps</td><td>VWR</td><td>HS8313</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>FLO4042-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>3.1.4)</td></tr><tr><td>Antifade mounting medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Confocal microsope</td><td>Leica</td><td>TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>3.2)</td></tr><tr><td>3D imaging reconstruction software</td><td>Leica</td><td>LASX with 3D visualization module</td><td>3.3)</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-3</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6)</td><td>Dr. Teixeria, L.</td><td></td><td>4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>strain: 10403S</td><td>4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 &amp;micro;g/ml streptomycin at 30 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)</td><td>18068015</td><td>gDNA degradation</td></tr><tr><td>cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>cDNA synthesis</td></tr><tr><td>IIV6_193R_F</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3&#039;</td></tr><tr><td>IIV6_193R_R</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3&#039;</td></tr><tr><td>RpII_qRTPCR_fwd</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG</td></tr><tr><td>RpII_qRTPCR_rev</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG</td></tr><tr><td>SYBR Green qRT-PCR reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0251, K0252, K0253</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351107, 7500 Software v2.0</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Listeria monocytogenes antibody</td><td>abcam</td><td>ab35132</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anti-Actin antibody produced in rabbit</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A2066</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate</td><td>Promega</td><td>W4011</td><td>Western blot</td></tr></tbody></table>

extraction of hemocytes from drosophila melanogaster larvae for microbial infection and analysis

Durante l'infezione patogena di Drosophila melanogaster, emociti gioca un ruolo importante nella risposta immunitaria durante l'infezione. Così, l'obiettivo del presente protocollo è di sviluppare un metodo per visualizzare l'invasione di agente patogeno in un apposito comparto immune di mosche, vale a dire emociti. Utilizzando il metodo presentato qui, fino a 3 × 106 live emociti sono ottenibili da 200 drosofila 3rd instar larve in 30 min per infezione ex vivo . In alternativa, emociti possono essere infetti in vivo attraverso l'iniezione di 3rd instar larve seguita da estrazione di emociti post-all'infezione 24 h. Queste cellule primarie infette sono stati corretti, macchiato e imaging utilizzando la microscopia confocale. Quindi, rappresentazioni in 3D sono stati generati da immagini per mostrare definitivamente l'invasione dell'agente patogeno. Inoltre, può essere ottenuto RNA di alta qualità per qRT-PCR per la rilevazione delle seguenti mRNA patogeno infezione e sufficienti proteine possono essere estratte da queste cellule per l'analisi Western blot. Presi insieme, presentiamo un metodo per la riconciliazione definitiva dell'invasione di agente patogeno e conferma dell'infezione utilizzando tipi di agente patogeno batterico e virale e un metodo efficiente per l'estrazione di emociti per ottenere abbastanza emociti dal vivo dalla drosofila larve per esperimenti di infezione ex vivo ed in vivo .

Per raccogliere vivere emociti per infezione ex vivo , fino a 3 × 106 emociti sono stati estratti da 200 drosofila 3rd instar larve. Per sviluppare il nostro metodo, una serie di diverse tecniche sono stata tentata. Dissezione larvale individuale sarebbe prendere fino a 1,5 h, e una media di ~ 8000 cellule sono state ottenute utilizzando questo metodo18, la maggior parte dei quali non erano viva alla fine della raccolta. Successivamente, abbiamo cercato di estrarre l'emolinfa, che conteneva gli emociti, materiale e l'emolinfa da 20 larve in un momento usando un tubo capillare di vetro19, ma il capillare è diventato intasato con cuticola non era in grado di essere ripreso in modo efficiente al bicchiere capillare. Infine, abbiamo meccanicamente interrotta la cuticola delle larve di 20-50 per ogni batch con una pinzetta12e fatto un pool di emolinfa di facile assorbimento. Questo ha permesso la facile raccolta di una grande quantità di emociti da un gran numero di larve (tabella 1).
Per indicare che gli emociti estratti erano vivi e adatto per l'infezione, è stata eseguita un'analisi di esclusione del blu di Trypan per calcolare la percentuale di emociti live estratto utilizzando il metodo qui presentato (Figura 6A). Inoltre, abbiamo confrontato il nostro metodo per l'estrazione di emociti con un metodo precedentemente pubblicato dove l'obiettivo era quello di sviluppare un metodo di rottura meccanica per isolare e differenziare tra circolanti e residenti emociti da individuo Drosophila della larva23. Dopo il confronto tra i due metodi da 10 isolamenti sperimentali indipendenti, abbiamo osservato che l'attuabilità delle cellule era leggermente maggiore utilizzando il metodo qui presentato (Figura 6A); Tuttavia, il metodo da Petraki et al. ha prodotto vicino due volte altretanti emociti da ogni 10 larve dissecate (Figura 6B). Un motivo per l'aumento del numero di emociti dall' Petraki et al. Metodo è che questo metodo raccoglie residente emociti (sessili), come pure emociti circolanti. Per confermare che le cellule estratte con il metodo presentato qui erano infatti emociti, abbiamo utilizzato una linea di volo contenente transgeni per il promotore di hemolectin (Hml) guida GAL4 in emociti di circolazione che lega la sequenza di attivatore a Monte (UAS) per attivare migliorata della proteina fluorescente verde (EGFP) trascrizione ed espressione negli emociti. Emociti da hml-GAL4 > UAS-EGFP larve sono stati estratti sui vetrini coprioggetto chambered, fissati, permeabilized e macchiato con DAPI come precedentemente descritto21. La figura 7 Mostra che la maggior parte delle cellule di DAPI-positive sono anche EGFP-positivi. Quantificazione di co-espressione è stato effettuato da più immagini, da cui abbiamo calcolato che 86±9% delle cellule isolate erano emociti.
Il protocollo in 3D innovativi modelli di invasione di agente patogeno in Drosophila emociti estratte da 3rd instar larve dopo l'infezione ex vivo o da c. burnetii in vivo . Siamo stati in grado di infezione da c. burnetii di immagine, poiché i batteri esprimono mCherry. Dopo emociti infetti erano fissi e macchiati, essi erano imaged per DAPI, EGFP e mCherry usando la microscopia confocal. Tassi di infezione di emociti, come determinato dalla percentuale di cellule positive EGFP che inoltre hanno esibito mCherry segnale, per le infezioni sia ex vivo ed in vivo C. burnetii era quasi al 100%. Questo era previsto poiché un MOI di GE/cella 10 è stato usato per ex vivo l'infezione, che dovrebbe provocare l'infezione del 100% di cellule24. Per quanto riguarda le infezioni in vivo , poiché le larve sono collocate in una goccia di alto-titolo di mCherry esprimenti -da c. burnetii (5.95 × 109 GE/mL), il numero di batteri è approssimativamente 10,000-fold superiore al numero di emociti a larva. Di conseguenza, si prevede un tasso di infezione del 100% per le infezioni in vivo .
Successivamente, Z-sezioni sono stati raccolti attraverso gli emociti, per visualizzare l'intera cella in 3D e per confermare la presenza di c. burnetii all'interno della cella. La figura 4 Mostra trasparente sezioni trasversali di un emociti (in verde) con c. burnetii (in rosso) visto all'interno della cella. Le immagini sono state ricostruite anche in un modello 3D (Figura 5) che rappresentano le superfici del emociti e da c. burnetii, mostrando di nuovo da c. burnetii all'interno della le emociti. È interessante notare che, in vivo-emociti infetti hanno esibito le estensioni citoplasmiche maggiore e sono stati più piatta in natura, mentre ex vivo-emociti infetti erano più sferica (Figura 5). Questo potrebbe indicare una popolazione maggiore di lamellocytes nel vivo-popolazione e plasmatocytes in ex vivo popolazione7infetti. Mentre lamellocyte differenziazione viene generalmente indotta durante la Vespa parassita infezione25, ferimento delle larve di Drosophila è anche sufficiente per indurre la differenziazione di lamellocyte26. Infine, mentre non utilizzati negli esperimenti presentati qui, ci sono forme che esprimono GFP di Listeria27 e IIV628 che potrebbero essere utilizzati per generare modelli 3D di infezione di emociti. Invece, Listeria- e IIV6-infettati emociti sono stati usati per esperimenti Western blotting e qRT-PCR.
Utilizzando il metodo presentato qui, infezioni vengono eseguite sia ex vivo ed in vivo per l'imaging. Inoltre, analisi di mRNA e proteina patogeno seguito ex vivo infezioni. In particolare, emociti estratti sono stati infettati con IIV6 e sono stati applicati all'analisi di qRT-PCR. Ha mostrato i livelli elevati significativamente di IIV6-193R, un gene virale che codifica per un presunto inibitore dell'apoptosi29, tra cellule mock - e IIV6-infettate (Figura 8A). L'elettroforesi dei prodotti amplificati ha confermato la presenza di una banda per il prodotto del gene di IIV6-193R nel campione infetto, ma non il campione mock-infettati (Figura 8B). Amplificato bande per il controllo di RpII endogeno sono stati trovati in tutti i campioni, e l'infezione di IIV6 in cellule S2 sono state eseguite come controllo positivo. Poiché le infezioni IIV6 sono state eseguite a un valore di MOI di 1 TCID50, circa il 50% delle cellule dovevano essere infettato, basato sulla distribuzione di Poisson24.
Proteine totali da mock - o Listeria -infettati emociti è stato raccolto a 1, 2 e 4 h post-infezione e concentrazione nella proteina è stata determinata mediante analisi di bicinconinico acido (BCA). 100% delle cellule dovevano essere infetti ex vivo , poiché il MOI era 10 CFU/cella24. Macchiarsi occidentale conferma la presenza di Listeria-derivati prodotti proteici in emociti infetti, con gli alti livelli raggiunti da post-infezione 4h (Figura 9). Inoculo di Listeria è utilizzato come controllo positivo per l'individuazione di Listeria-bande specifiche. La presenza di actina è illustrata negli esempi emociti di confermare i livelli della proteina di caricamento. Presi insieme, questi risultati indicano che gli emociti estratti utilizzando il metodo presentato qui erano adatti per entrambi gli esperimenti di infezione virale e batterica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57077/57077fig1.jpg"> Figura 1 : Struttura di attrezzature e materiali utilizzati per l'estrazione di emociti. Attrezzature in primo luogo è stata preparata prima della dissezione. A) il vaso capillare di vetro tirato è stato inserito il nanoinjector dopo essere stato retro-riempito con olio minerale. B) la punta fusa del vaso capillare di vetro era rotto con il forcipe per creare un diametro esterno di 100 µm. B) DHIM è stato ripreso dal capillare per evitare la contaminazione delle cellule e bolle d'aria sono state introdotte per operare una netta distinzione tra olio e DHIM. C) le larve sono prelevate da cibo fiale e inserite in un colino di cella. C') le larve vengono lavate in acqua sterile e l'acqua viene rimossa con un panno da attività, D) le larve sono trasferite in un tubo del microcentrifuge e anestetizzate con CO2 gas. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57077/57077fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57077/57077fig2.jpg"> Figura 2 : Timeline e flusso grafico per l'estrazione di emociti. A) le larve sono sul loro lato dorsale prima di aprire la cuticola. B) la cuticola è interrotta con una pinzetta appuntita e l'ago capillare. C) l'emolinfa è bled sulla pellicola di paraffina. D) piscine di emolinfa da 20-50 larve sono presi con il capillare in vetro e nanoinjector. E) l'emolinfa ed emociti vengono trasferiti in un tubo del microcentrifuge contenente 500 µ l DHIM essere contato con un emocitometro. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57077/57077fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57077/57077fig3.jpg"> Figura 3: In vivo infezione. A) frutta Drosophila succo piastre di agar e pasta di lievito vengono utilizzati per l'incubazione di larve in vivo infettata. Tagli sono fatti nella piastra di agar per facilitare la longevità di larve (frecce grigie). B) un ago di tungsteno appuntito di 0,001 mm è attaccato al forcipe usando la pellicola di paraffina. C) la punta dell'ago di tungsteno appuntito di 0,001 mm. D) la larva è punto con ago di tungsteno nel pool del patogeno la pellicola di paraffina sotto il microscopio stereo. E) le larve ritte sono posti sulla piastra di agar. F) la piastra è sigillata con la pellicola di paraffina e mantenuta sui tovaglioli di carta umida nel contenitore fino al momento opportuno. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57077/57077fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57077/57077fig4.jpg"> Figura 4 : Le sezioni trasversali dell'invasione del patogeno negli emociti. Sezioni estratte dalla scansione confocale 3D di emociti agente patogeno-infettato. A, B) xy-sezioni Mostra da c. burnetii (nel colore rosso contrassegnato con punte di freccia bianche) all'interno dell'emociti. Le punte di freccia grigi mostrano i nuclei di emociti. A', una ", B') viste tra cui yz e xz sezione immagini mostrano l'invasione di c. burnetii in emociti da 2 punti di visualizzazione aggiuntive. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57077/57077fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57077/57077fig5.jpg"> Figura 5 : Modelli 3D di invasione del patogeno negli emociti. Modelli 3D ricostruiti dell'invasione da c. burnetii negli emociti vengono generati dopo l'infezione ex vivo ed in vivo . Modello può essere ruotato liberamente utilizzando il software; qui 6 punti di visione sono mostrati con l'emociti in verde, da c. burnetii in rosso (frecce bianche) e il nucleo in blu (punte di freccia grigia). Sono indicate anche le immagini di sezione trasversale mostrando all'interno delle cellule invase di agente patogeno. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57077/57077fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57077/57077fig6.jpg"> Figura 6 : La percentuale e la popolazione di emociti live. Emociti sono stati estratti da gruppi di larve instar 10 3rd utilizzando il metodo di Petraki et al e il metodo presentato qui. A) la percentuale degli emociti dal vivo è stata calcolata per ogni tecnica dall'analisi di esclusione del blu di Trypan. B) la popolazione totale di emociti è stata confrontata fra le due tecniche. I grafici a barre rappresentano la media ± deviazione standard da N = 10 replicati biologici con il metodo di estrazione e dosaggio di tipo. P-valori sono indicati dalla varianza assumendo T-test di uno studente a due code. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57077/57077fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57077/57077fig7.jpg"> Figura 7 : Immagini di emociti estratti utilizzando il driver hemolectin. Emociti sono stati estratti da 80 larve di w1118; P {w [+ mC] = Hml-GAL4.Δ} 2, P {w [+ mC] = UAS-2xEGFP} a H2. Il promotore per Hml unità GAL4 circolanti emociti, che lega UAS per attivare espressione e trascrizione di EGFP. Gli emociti erano fissi e macchiati con DAPI come descritto in precedenza20. Emociti sono montate su vetrini coprioggetti chambered e ripreso da contratto differenziale di interferenza (DIC) e microscopia a fluorescenza. Il canale blu indica il nucleo colorato con DAPI e il canale verde indica gli emociti che esprimono EGFP. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57077/57077fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57077/57077fig8.jpg"> Figura 8 : qRT-PCR ed elettroforesi su gel. L'espressione del gene IIV6-193R è stata osservata mediante qRT-PCR soltanto negli emociti IIV6-infettati. A) 193R espressione genica era normalizzata per il controllo interno, RpII e presentato come un rapporto. Il numero di cicli per l'emociti mock-infettati è stato fissato arbitrariamente un numero di ciclo massimo di 40 per l'analisi poiché 193R non è stata rilevata in questi campioni. Dati rappresentano la media ± deviazione standard da N = biologici 3 ripetizioni per ogni gruppo. Il P-value indica un due code test di Student T-supponendo che la varianza. B) i prodotti di qRT-PCR sono mostrati mediante elettroforesi su gel di agarosio. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57077/57077fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57077/57077fig9.jpg"> Figura 9 : Analisi Western Blot. L'espressione degli antigeni di Listeria e actina in mock - e Listeria-emociti infetti da 3rd instar Drosophila larve a 1, 2 e 4 ore post-infezione (p.i.) sono determinate mediante Western blotting. Concentrazioni di proteine totali sono state determinate mediante l'analisi di (BCA) acido bicinconinico per normalizzare la quantità totale di proteina caricata in ogni corsia del gel. Inoculo utilizzato per infettare gli emociti era utilizzato come un campione di controllo positivo. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57077/57077fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Metodo.</td>
			<td>Numero medio di larve per l'estrazione di emociti</td>
			<td>Numero medio di emociti totale</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">emolinfa estrazione capillare (questo metodo)</td>
			<td>192.44 (SD: 86.05)</td>
			<td>4,56 x 105 celle (SD: 5,83 x 105)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Gamma: 70-390, N = 25 prove)</td>
			<td>(Gamma: 1.20 x 105 - 2.95 x 106 cellule)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">individuali dissezione di larve</td>
			<td>26,67 (SD: 11,55)</td>
			<td>8,33 x 103 celle (SD: 6,66 x 103)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Range: 20-40, N = 10 prove)</td>
			<td>(Gamma: 4,00 x 103 - 1,60 x 104 celle)</td>
		</tr>
<tr>
<td>larvale capillare estrazione *</td>
			<td>N/A *</td>
			<td>N/A *</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* emociti erano in grado di essere estratta usando questo metodo a causa di intasamento dell'ago capillare</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: numero di dissecato larve ed estratte utilizzando diverse tecniche di emociti. I numeri medii di larve dissecate ed emociti estratti sono stati confrontati fra il metodo presentato qui e altri metodi. Il nostro metodo ha provocato la raccolta di un numero maggiore di larve ed emociti. Il metodo di estrazione capillare larvale è stato anche tentato, ma emociti erano in grado di essere estratti a causa di intasamento della punta del capillare.

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Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Questo metodo viene illustrato come visualizzare l'invasione del patogeno nelle cellule di insetto con modelli tridimensionali (3D). Emociti da larve di Drosophila sono stati infettati con agenti patogeni virali o batterici, ex vivo o in vivo. Emociti infetti erano quindi fissi e macchiati per l'imaging con un microscopio confocale e la successiva ricostruzione cellulare 3D.

Estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per infezione microbica e l'analisi

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

11.6K Views.  Washington State University. Questo metodo viene illustrato come visualizzare l'invasione del patogeno nelle cellule di insetto con modelli tridimensionali (3D). Emociti da larve di Drosophila sono stati infettati con agenti patogeni virali o batterici, ex vivo o in vivo. Emociti infetti erano quindi fissi e macchiati per l'imaging con un microscopio confocale e la successiva ricostruzione cellulare 3D.

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Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Saggio popolazioni cellulari del sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

I metodi per esaminare le ghiandole linfatiche e ematociti concentrati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of innate immunity are conserved between insects and mammals, and since Drosophila can readily be genetically and experimentally manipulated, they are powerful for studying immune system function and the physiological consequences of disease. The procedure demonstrated here allows infection of flies by introduction of bacteria directly into the body cavity, bypassing epithelial barriers and more passive forms of defense and allowing focus on systemic infection. The procedure includes protocols for the measuring rates of host mortality, systemic pathogen load, and degree of induction of the host immune system. This infection procedure is inexpensive, robust and quantitatively repeatable, and can be used in studies of functional genetics, evolutionary life history, and physiology.

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

Sistemica infezione batterica e immunitario Difesa fenotipi in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Immunologia e infezioni

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

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Biologia

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

Valutare la risposta immunitaria cellulare del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, utilizzando un test di fagocitosi In Vivo

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A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

Un protocollo semplice per Estrazione emociti da bruchi selvaggi

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Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly and raise ethical issues. Unconventional models are notoriously cheap, easy to handle and culture, and do not take much space. They are genetically amenable and possess complete genome sequences, and their use presents no ethical considerations. The fruit fly Drosophila melanogaster, for instance, has provided great insights into a variety of behavior, development, metabolism, and immunity research. More specifically, D. melanogaster adult flies and larvae possess several innate defense reactions that are shared with vertebrate animals. The mechanisms regulating immune responses have been mostly revealed through genetic and molecular studies in the D. melanogaster model. Here a novel larval injection technique is provided, which will further promote investigations of innate immune processes in D. melanogaster larvae and explore the pathogenesis of a wide range of microbial infections.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Drosophila melanogaster adult flies have been extensively utilized as model organisms to investigate the molecular mechanisms underlying host antimicrobial innate immune responses and microbial infection strategies. To promote the D. melanogaster larva stage as an additional or alternative model system, a larval injection technique is described.

Drosophila melanogaster Protocollo di iniezione della larva

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Valutare la capacità fagocitica specifica per età degli emociti di Drosophila melanogaster adulto utilizzando un in vivo Phagocitosis

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Cuticle Disruption: A Method to Collect Hemolymph from Drosophila Larvae

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila hemolymph serves as both blood and interstitial fluid, circulating throughout the body during the larva and adult stages. This video describes a protocol to collect larval hemolymph in order to quantify the circulating cells.

Rottura delle cuticole: un metodo per raccogliere l'emolinfa dalle larve di Drosophila

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Drosophila melanogaster (fruit fly)

Larva

Larval Lymph Gland Dissection: Isolating the Drosophila Hemocyte-Producing Organ

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes the Drosophila lymph gland&#8212;the primary site of hematopoiesis in the fly larva&#8212;and shows an example protocol to dissect and mount the organ for immunohistochemistry and fluorescent imaging.

Dissezione della ghiandola linfatica larvale: isolamento dell'organo produttore di emociti della Drosophila

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes ...

Estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per infezione microbica e l'analisi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Saggio popolazioni cellulari del sangue

I metodi per esaminare le ghiandole linfatiche e ematociti concentrati in

Sistemica infezione batterica e immunitario Difesa fenotipi in