L'autore ringrazia profondamente Dr. Asako Sugimoto (Università di Tohoku) per la sua discussione utile. wyIs251 era un dono generoso da Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 è stato fornito dalla CGC, che è finanziato dall'ufficio di NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). Questo lavoro è stato supportato da grant JSPS KAKENHI #17 H 05010 e #16 H 06536 e Fondazione di Daiichi Sankyo, Brain Science Foundation e Naito Foundation.

1. preparazione del campione <ol><li>genera un transgenico c. elegans ceppo di interesse utilizzando metodologie transgeniche 18. In alternativa, ottenere ceppi appropriati da Caenorhabditis Genetics Center (CGC). Per visualizzare il trasporto assonale dei precursori delle vescicole sinaptiche, utilizzare la linea transgenica wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Per osservare IFT, ottenere la linea transgenica mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Questi ceppi sono utilizzati in questo protocollo. 
	Nota: Una matrice extracromosomico, integrazione genomica o anche GFP knock-in works. Per ridurre i segnali di fondo, utilizzare promotori di cellula-specifico, piuttosto che pan-neuronale promotori. 
	Nota: Manutenzione di worms è descritto in altri protocolli 20. Ceppi sono stati mantenuti su prati dell'alimentatore Escherischia coli OP50 sulla crescita del nematode piastre di terreno (NGM) (agarosio 1,7% (p/v), 50 mM NaCl, 0,25% (p/v) di peptone, 1 mM CaCl 2, 5mg/mL colesterolo, 25mm KH 2 PO 4, 1mm MgSO 4 su piatti di plastica di diametro 60 mm) a 20 ° C.</li>
	<li>Crescere i vermi a 20 ° C sulle piastre di NGM a qualsiasi fase del ciclo di vita dei vermi. 
	Nota: Si può osservare sia trasporto assonale e IFT in qualsiasi fase. L4 tardivo a giovane adulto è un buon controllo positivo perché più pubblicazioni hanno utilizzato queste fasi e visualizzato in quel momento 22 eventi traffico 14 , 21 , , 23.</li>
</ol> 2. Preparazione del 10% dell'agarosi Nota: molti fornitori offrono prodotti simili, quali polveri di agar agar e agarosio. Utilizzare agarosio per elettroforesi (resistenza del gel &#62; 1200 g/cm 2). Polveri di agar a buon mercato non funzionano perché il gel risultante non è abbastanza forte per immobilizzare worm.
<ol><li>Mix 0,4 g agarosio in 4 mL di acqua distillata acqua (DW) in un tubo di vetro (1,5 x 10,5 cm). Mettere un coperchio sul tubo di vetro per evitare l'evaporazione.</li>
	<li>Mettere il tubo di vetro su un blocco di calore di 95 ° C per 90 min. Inoltre, preparare un altro tubo di vetro (1,5 x 10,5 cm) riempito con DW e tenerlo a 95 ° C. mettere una pipetta Pasteur a 95 ° C DW ( Figura 1 A). Un sacco di piccole bolle sarà visibili nel tubo di agarosio e la soluzione deve essere torbida. Lasciare fino a quando la soluzione diventa chiara. Quindi, mescolare pipettando su e giù fino a quando la soluzione di agarosio diventa omogenea. 
	Nota: Forno a microonde non può essere utilizzato per preparare la soluzione di agarosio 10% quando effettuata in DW e dell'agarosi. Piccole bolle causate dalle microonde evitare la fusione dell'agarosi. Tuttavia, gel di agarosio solidificato 10% facilmente possono essere fusi nuovamente utilizzando un forno a microonde. Tubi di vetro contenenti gel di agarosio al 10% possono essere preparati in anticipo e conservati a 4 ° C per almeno 6 mesi. Se in questo modo, sciogliere il brodo utilizzando un forno a microonde quando necessario e iniziare dal passaggio 3 in questo protocollo. 
	Nota: Agarosio perde gradualmente la capacità di solidificare se incubate a 95 ° C per un tempo lungo o dopo ripetute solidificazione e fusione. Se questo accade, preparare nuove 10% agarosio.</li>
</ol> 3. Preparazione di agarosio Pad <ol><li>usando la pipetta di Pasteur riscaldata preparata al punto 2.2, inserire 2 gocce di agarosio al 10% in una diapositiva di 76 x 22 mm.</li>
	<li>Rapidamente coprire con una seconda diapositiva 2 76 x 22 mm prima della caduta dell'agarosi si solidifica come mostrato in Figura 1 B e spingere verso il basso della seconda diapositiva per appiattire la soluzione di agarosio. Lo spessore deve essere di 0,5-1 mm.</li>
	<li>Rapidamente svuotare la pipetta di Pasteur di pipettaggio 95 ° C DW su e giù fino a quando la soluzione di agarosio è lavata fuori. In caso contrario, la pipetta sarà ostruirsi di gel di agarosio. Lasciare la pipetta a 95 ° C DW.</li>
	<li>Attesa per 1 min. Il pad di agarosio forma e diventa torbida. Quindi, far scorrere le diapositive apart a mano ( Figura 1 C).</li>
</ol> 4. Montaggio di vermi Nota: anche piccole quantità di movimento verme prevenire buona osservazione. Levamisole è stato tradizionalmente usato per impedire il movimento della vite senza fine sull'agarosio pad 24 , 25. Tuttavia, Levamisole inibisce i recettori neuronali in c. elegans e pertanto può influenzare eventi di traffici in neuroni 15. Utilizzando microsfere di polistirolo descritto qui una buona alternativa 17.
<ol><li>Sotto un microscopio stereo equipaggiato con una transilluminazione specchio scorrevole, trasferire ~ 30 vermi transgenici che esprimono gli indicatori appropriati per un nuovo NGM piastra senza batteri utilizzando un filo di platino pick. 
	Nota: Un filo di platino pick è costituito da filo di platino e pipetta Pasteur (5 pollici), e la punta del filo platino è stata appiattita. La preparazione dei picconi filo di platino e la manipolazione di vermi con questi sono descritti in Wormbook (http://www.wormbook.org).</li>
	<li>Lasciare la piastra per 1 min. batteri vengono rimossi automaticamente dalle superfici di vermi come i vermi muoversi su gel di agarosio NGM senza batteri.</li>
	<li>Put a 0,5-1,0 µ l goccia del 2,6% 100 microsfere di polistirolo del diametro nm in acqua sul blocchetto di agar ( Figura 1 D). Consente di trasferire le microsfere 10-20 vermi dalla piastra di NGM esente da batteri. Goccia e la diffusione di worm usando il legare di platino pick per evitare la sovrapposizione di verme corpi ( Figura 1 E).</li>
	<li>Applicare un vetrino coprioggetti 2 di 22 x 40 mm ( Figura 1, F). Spingere delicatamente per rimuovere le bolle d'aria, ma evitare di schiacciare le viti senza fine. Il campione è pronto per l'imaging. 
	Nota: Poiché non è amministrata anestesia, vermi vengono risolti solo dalla forza di attrito generata da agar pad, microsfere di polistirolo e coprioggetto 17. La presenza di batteri di alimentatore e/o troppo soluzione renderà la forza di attrito più debole. 
	Nota: Diverse dimensioni del lavoro di vetrini coprioggetti (ad es., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2). Tuttavia, le lamelle più grandi possono impedire immersione acqua o olio dalla lente dell'obiettivo che perde in campioni durante l'osservazione.</li>
</ol> 5. Osservazione Nota: appropriati parametri di imaging (potenza laser, guadagno, binning, ecc.) saranno diverso per ogni sistema di microscopio e la fotocamera. Qui, viene utilizzato un microscopio widefield equipaggiato con uno scanner confocale del disco rotante e una macchina fotografica digitale del CCD.
<ol><li>Impostare il controllo della temperatura della fase a 20 ° C, o regolare la temperatura a 20 ° C.</li>
	<li>Mettere il vetrino sul tavolino del microscopio. Utilizzare x 100 (apertura numerica = 1.3 o superiore) dell'obiettivo.</li>
	<li>Cercare le aree indicate in Figura 2 A (per wyIs251 e trasporto assonale) o Figura 2 B (per mnIs17 e IFT) come controlli positivi . Altre zone possono essere analizzati come ben 22.</li>
	<li>Set di parametri (CCD guadagno = 200, Binning = 1 o 2, potenza laser a 488 nm = 1.0-1.3 mW). Eseguire la registrazione continua a 4 fotogrammi/s per fino a 1 min Salva file come formato mutli-TIFF. 
	Nota: Se GFP segnali scomparire ed è difficile continuare a osservare GFP::RAB-3 o OSM-6::GFP per 30 s, la potenza del laser è troppo forte. In tal caso, ridurre la potenza del laser. Al contrario, se non è registrato nessun movimento vescicolare, la potenza del laser è troppo debole. In tal caso, aumentare la potenza del laser.</li>
	<li>Osservare un worm diverso e ripetere 5.3 e 5.4. Le osservazioni possono durare fino a 20 min, ma ogni verme deve essere registrati una sola volta per evitare gli effetti di pdanni di Hoto. 
	Nota: I vermi sono stati osservati per almeno 20 min senza difetti significativi 7 , 27 , 28. Osservazione più lunga può essere possibile, ma porto &#39; t stato ancora testato. Un chiaro segno della morte neuronale è il cambiamento della morfologia neuronale come gonfiore del neurite. Segnali deboli di GFP possono essere visto negli assoni e dendriti sia wyIs251 e mnIs17, morfologia del neurite può essere facilmente controllato da solo guardando gli assoni o dendriti. Morfologia neuronale è illustrato nella Figura 2.</li>
	<li>Generare filmati.
	<ol><li>Apri il file Multi-TIFF file utilizzando software di Fiji. Vai a File &#62; Open quindi selezionare il file Multi-TIFF salvato al passaggio 5.4. 
		Nota: Fiji può essere scaricato presso jttps://fiji.sc. Immagine J e plugin può anche essere utilizzato per generare chimografi. Se in questo modo, seguire le istruzioni pertinenti per il plugin scelto.</li> <li>scegliere la &#34; selezione rettangolare &#34; ( Figura 3 A, freccia) e seleziona l'area di interesse disegnando un rettangolo con un mouse del computer (rettangolo giallo in Figura 3 A). Vai a immagine &#62; stack &#62; strumenti &#62; fare Substacks e selezionare i numeri di fetta che sono inclusi nel film. Viene generato un substack.</li>
		<li>Attivare la finestra di substack cliccando e passare all'immagine &#62; regolare &#62; luminosità/contrasto. Una finestra per regolare la luminosità e il contrasto si presenta. Nella finestra, fare scorrere la parte superiore bar (minimo) a destra così che il segnale di fondo sparisce e il secondo bar top (massimo) a sinistra così che le particelle e le vescicole commovente possono essere visto abbastanza bene sullo sfondo.</li>
		<li>Vai a immagine &#62; stack &#62; tempo Stamper. Come il film è registrato a 4 fotogrammi/s al punto 5.4, l'intervallo di tempo è 0,25 s. Quindi, digitare &#34; 0.25 &#34; nell'intervallo di.</li>
		<li>Generare un file di filmato selezionando Salva come &#62; AVI dal menu File (film 1 e 2). 
		Nota: Utilizzando il plugin appropriato, è possibile salvare il file come altri formati come &#34; mpeg4 &#34; o &#34; mov &#34; file.</li>
	</ol></li> <li>Generare chimografi.
	<ol><li>Aprire i file del filmato originale utilizzando software di FIji nuovamente e ripetere i passaggi 5.6.2 e 5.6.3 per regolare la luminosità e il contrasto.</li>
		<li>Clic &#34; segmentato linea &#34; ( Figura 3 B, freccia). Usando un mouse, disegnare una linea segmentata lungo le ciglia o assone (linea gialla, in Figura 3 B).</li>
		<li>Andare a analizzare &#62; Multi Kymograph &#62; Multi Kymograph ( Figura 3 C). Linea larghezza finestra ( Figura 3 D). Tipo &#34; 3 &#34; nella finestra di Linewidth e fare clic su OK ( Figura 3 D).</li>
		<li>Kymograph finestra viene creata. Salvare l'immagine in formato TIFF o JPEG.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD+repeat-containing+protein+IFTA-1+is+required+for+retrograde+intraflagellar+transport.">The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport.</a> Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).</li><li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+IFT+kinesins+extends+the+sensory+repertoire+of+ciliated+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia.">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li><li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes.">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659 (2016).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li></ol>

L'autore non ha nulla di divulgare.

Limitazione per quanto riguarda i metodi esistenti Il metodo qui descritto è ottimizzato per osservare eventi veloci come trasporto assonale e IFT. Così, l'immobilizzazione è più una priorità di incubazione più lungo. Mentre siamo stati in grado di osservare eventi di traffici per almeno 20 min senza perturbazione significativa, questo metodo potrebbe non essere sempre adatto per osservare eventi lenti che richiedono osservazioni più lungo, ad esempio allungamento dell'assone e migrazione cellu...

Live cell imaging è uno strumento essenziale per l'analisi di trasporto intracellulare. Nella biologia delle cellule neuronali, sono essenziali per comprendere la funzione e la morfogenesi neuronale1analisi del trasporto assonale con formazione immagine di cellule vive. Difetti nel trasporto assonale sono alla base di disordini neurodegenerative diversi2. Dineina e chinesina superfamiglia proteine svolgere trasporto assonale anterograda e retrogradely, rispettivamente1,2.
Le ciglia sono un altro compartimento cellulare in cui la rete dei microtubuli e traffico macchine sono altamente sviluppato3. Macchinario di sintesi proteica non è localizzata nelle ciglia, il che significa che ciliare proteine devono essere trasportati dal citoplasma verso le punte di ciglia. Cilia-specifiche chinesina e dineina, chiamato chinesina-2 e citoplasmatici dineina-2, rispettivamente, i componenti di ciglia4, in un fenomeno chiamato trasporto intraflagellare (IFT)5di trasporto. Il danno dell'IFT causa uno spettro di malattie chiamate ciliopatie6. Così, per capire i meccanismi di base della formazione ciliare e la patogenesi sono necessaria analisi del meccanismo IFT da formazione immagine di cellule vive.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e IFT7,8,9. Per osservare IFT, Chlamydomonas è stato ampiamente utilizzato come organismo modello5,6. Essendo un organismo unicellulare Chlamydomonas , il rapporto dell'IFT con invecchiamento, funzione di un neurone e comportamento sarebbe difficile da analizzare. Inoltre, tecniche di genetiche essenziale come CRISPR/Cas9 non siano state applicate a Chlamydomonas. Negli più alti organismi di modello, come topi e Drosophila, interruzione del trasporto assonale e IFT spesso provoca fenotipi letali perché trasporto assonale e IFT sono essenziali per la morfogenesi e l'omeostasi del animali 10, 11. Nel caso di topi, trasfezione e coltura delle cellule è generalmente necessario osservare trasporto assonale e IFT, che richiede molte competenze e tempo estesa12,13. Inoltre, un sacco di contesto fisiologico importante può essere perso in linee cellulari e cellule coltivate. Poiché il sistema nervoso non è essenziale per la sopravvivenza dei vermi, c. elegans mutanti in cui trasporto assonale o IFT sono interrotti non sono spesso letali7,9,14. Trasporto assonale e IFT può essere osservato direttamente in vivo senza dissezione perché c. elegans è trasparente ed è quindi facile osservare GFP-etichettato marcatori.
Esistono diversi protocolli per immobilizzare c. elegans, come l'utilizzo di un dispositivo di microfluidica15, pastiglie di agarosio con anestesia16o microsfere17. L'inclusione dell'anestesia può inibire gli eventi traffici in neuroni15. Un chiaro svantaggio del metodo microfluidici-periferica è che preparando un dispositivo microfluidico non è sempre facile. Invece, l'immobilizzazione di agarosio pastiglie e microsfere è un modo conveniente e facile per eseguire imaging lasso di tempo in c. elegans. Qui, descrivo questo protocollo di base per immobilizzare c. elegans e visualizzare trasporto assonale e IFT in vivo in elegans del c. Rispetto agli altri metodi, il metodo qui descritto non richiede attrezzature speciali ed è molto più economico e più facile da eseguire.

<table><tbody><tr><td>Slideglass (76&amp;nbsp; x 26 mm)</td><td>Matsunami</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass (22&amp;nbsp; x 40 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C024401</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wako</td><td>318-01195</td><td></td></tr><tr><td>Polystylene microbeads 0.1 micron</td><td>Polysciences</td><td>#00876</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>TAITEC</td><td>0063288-000</td><td>CTU-mini</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>widefield microscope</td></tr><tr><td>Spinning disk Scanner</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>spinning disc confocal scanner&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital CCD camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C10600-10B</td><td>ORCA-R2 degital CCD camera</td></tr><tr><td>Objective lens (x100, NA1.4)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100XO</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette (5 inch)</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td><td>IWAKI</td><td>9820TST15-105NP</td><td></td></tr><tr><td>TV9211: &lt;em&gt;wyIs251&lt;/em&gt;</td><td>Laboratory of Kang Shen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OTL11: &lt;em&gt;mnIs17&lt;/em&gt;</td><td>Ref. 27, 29</td><td>N/A</td><td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>435064-9000-000</td><td>STEMI 508&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mirror transillumination unit</td><td>Carl Zeiss</td><td>435425-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>platinum wire (0.2 mm)</td><td>Nilaco Corporation</td><td>m78483501</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plastic dish</td><td>Falcon</td><td>#351007</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>nematode growth medium (NGM)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

Trasporto assonale e trasporto intraflagellare (IFT) sono essenziali per la funzione e la morfogenesi dell'assone e le ciglia. Dineina e chinesina superfamiglia delle proteine sono motori molecolari che regolano anterograda e retrograda trasporto, rispettivamente. Questi motori utilizzano microtubule network come rotaie. Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo potente modello per studiare il trasporto assonale e IFT in vivo. Qui, descrivo un protocollo per osservare il trasporto assonale e IFT nella vita di c. elegans. Merce trasportata può essere visualizzato mediante codifica proteine cargo utilizzando proteine fluorescenti come proteina fluorescente verde (GFP). C. elegans è trasparente e proteine GFP-etichettato cargo possono essere espresso in cellule specifiche sotto promotori di cellula-specifico. Viti senza fine viventi possono essere risolto microsfere su gel di agarosio 10% senza uccidere o anestetizzare i vermi. In queste condizioni, movimento di carico può essere osservato direttamente negli assoni e ciglia di vivere c. elegans senza dissezione. Questo metodo può essere applicato per l'osservazione di qualsiasi molecola di carico in tutte le cellule modificando proteine bersaglio e/o le cellule in che si sono espressi. Le proteine più elementari quali motori molecolari e proteine adattatrici che sono coinvolti nel trasporto assonale e IFT sono conservate in c. elegans. Rispetto ad altri organismi di modello, mutanti possono essere ottenute e mantenute più facilmente in c. elegans. Combinando questo metodo con vari mutanti di c. elegans può chiarire i meccanismi molecolari del trasporto assonale e IFT.

Trasporto assonale nel neurone DA9 Utilizzando la riga di wyIs251 , l'anterograda e il trasporto assonale retrogrado di GFP::RAB-3 possa essere registrata simultaneamente nel neurone motore DA9. La velocità media di anterograda e retrograda trasporto nell'assone dorsale prossimale del neurone DA9 è circa 1,8 e 2,6 μm/s, rispettivamente22. Il numero delle vescicole commovente è circa 0,03 e 0,018 a μm di assone a s. Così, per un'os...

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Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e intracellulare. Qui, descrivo un protocollo per la registrazione in vivo e l'analisi del trasporto assonale e intraflagellare c.elegans.

Immobilizzazione del Caenorhabditis elegans per analizzare il trasporto intracellulare nei neuroni

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

8.0K Views.  Tohoku University. Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e intracellulare. Qui, descrivo un protocollo per la registrazione in vivo e l'analisi del trasporto assonale e intraflagellare c.elegans.

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Semplici dispositivi microfluidici per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Ricerca

Bioingegneria

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Biochimica

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neuroscienze

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

<meta charset="utf8"></head><body>Metodi di imaging e smistamento cellulare su animali vivi per lo studio della neurodegenerazione in un modello di necrosi eccitotossica di C. elegans

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Metodi di imaging e smistamento cellulare su animali vivi per lo studio della neurodegenerazione in un modello di necrosi eccitotossica di C. elegans

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Immobilizzazione del Caenorhabditis elegans per analizzare il trasporto intracellulare nei neuroni

Riepilogo

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Metodi di imaging e smistamento cellulare su animali vivi per lo studio della neurodegenerazione in un modello di necrosi eccitotossica di C. elegans

Metodi di imaging e smistamento cellulare su animali vivi per lo studio della neurodegenerazione in un modello di necrosi eccitotossica di C. elegans

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo