Name: synthesis and evaluation of a ruthenium-based mitochondrial calcium uptake inhibitor
Uploaded: 2017-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
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Questa ricerca è stata sostenuta dalla Cornell University. Questo lavoro fatto uso del Cornell Center per servizi in comune ricerca materiali, che sono supportati tramite il programma NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. riconosce il sostegno di un NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE - 1650441) e Dr. Dave Holowka per assistenza con gli esperimenti di calcio. Opinioni, conclusioni e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori (s) e non riflettono necessariamente le opinioni di National Science Foundation.

Nota: acidi concentrati e basi sono utilizzati in questa sintesi. Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si esegue la reazione compreso l'uso di controlli tecnici (cappa) e dispositivi di protezione individuale (PPE) tra cui occhiali, guanti, camice da laboratorio, pieno lunghezza pantaloni e scarpe chiuse.
 1. preparazione di [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>sintesi di Cl [Ru (NH 3) 5 Cl] 2 12 <ol><li>dissolvere 1.00 g di RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru di peso, 4,1 mmol) in 5 mL di H 2 O. Cool la soluzione marrone scura a 0 ° C in un bagno di ghiaccio. Aggiungere mL 11 (0,23 mol) di soluzione di idrato di idrazina 80% in modo goccia a goccia. La reazione iniziale sarà vigorosa con il gas di evoluzione, risultante in una soluzione marrone. La soluzione risultante si mova augellin a temperatura ambiente per 16 h; la soluzione finale sarà rosso scuro 
		Attenzione: L'idrazina è acutamente tossici e cancerogeni. Inoltre, anidra forme di questo reagente sono esplosive. Come sempre, uso appropriati cappe PPE e fumi durante la manipolazione. Non concentrare queste soluzioni per secchezza.</li>
		<li>Per questa soluzione, aggiungere circa 5-10 mL di HCl concentrato per aggiustare il pH a 2. A questo punto, la soluzione sarà giallo-marrone a colori.</li>
		<li>Calore questa soluzione a 105 ° C continuando a mescolare per 1-2 h. Un solido giallo precipita dalla soluzione. Quando non più visibilmente precipitare forme, togliere dal fuoco.</li>
		<li>Permettere la miscela di reazione per raffreddare a temperatura ambiente e quindi posto in un bagno di ghiaccio 0 ° C per 10 min. raccogliere il solido giallo di filtrazione sotto vuoto e lavaggio con 5 mL di etanolo ed etere etilico.</li>
		<li>Sciogliere completamente il prodotto grezzo in 15-25 mL di acqua calda. Chill 10 mL di una soluzione di HCl concentrata in una beuta per filtrazione collocandolo in un bagno di ghiaccio. Filtrare la soluzione gialla nella soluzione di HCl refrigerata per indurre la precipitazione di un solido puro giallo pallido. Questo precipitato di filtrare e lavare con 5 mL ciascuno di 0,5 M HCl, etanolo ed etere.</li>
		<li>Caratterizzare il composto utilizzando la spettroscopia IR. Verificare purezza tramite l'identificazione delle frequenze d'allungamento a 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 e cm 801 -1. Una comune impurità minori a 2069 cm -1 è assegnata a [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.</li>
	</ol></li> <li>Sintesi di [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>sciogliere 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 in 50 mL di 1m NH 4 OH in un recipiente a pressione a fondo rotondo parete pesante 200 mL. Senza bloccare il recipiente con un tappo di cap e riscaldare la miscela di reazione a 75 ° C per 6 h. Togliere dal fuoco e mescolare a temperatura ambiente per 4 giorni per produrre una soluzione verde scura. 
		Attenzione! Riscaldamento un risultati di vaso sigillato in un accumulo di pressione. Assicurarsi di utilizzare appropriato cristalleria di pressione-cassetta di sicurezza. Per questa reazione, lo scopo di sigillare la nave è quello di minimizzare la perdita di gassosa NH 3. Pertanto, inserire il tappo senza stringere per consentire per il rilascio della pressione in eccesso.</li>
	</ol></li> <li>Purificazione mediante cromatografia a scambio cationico <ol><li>In un becher da 25 mL, sospendere la resina a scambio cationico 5g (ad es., Dowex 50WX2 200-400 mesh (forma H +) in 10 mL di 0.1 M HCl.</li>
		<li>Caricare questo impasto in una colonna di 10 mL (10 mm di diametro, altezza 15 cm) munito di un serbatoio solvente 50 mL. Lavare la resina con circa 20-30 mL di 0.1 M HCl, finché l'eluato è incolore.</li>
		Soluzione di reazione di <li>ritorno al verde isolata al punto 1.2.1. Per questa soluzione, aggiungere HCl concentrato per regolare il pH a 2, al punto che il colore della soluzione diventa marrone.</li>
		<li>Caricare questa soluzione acidificata alla colonna di resina di scambio cationico preparata al punto 1.3.2 pipettando delicatamente sopra la resina. Lasciate che l'eluato completamente scarico e continuare a caricare la soluzione. Ripetere questo processo fino a quando l'intera soluzione è stato aggiunto. Parte superiore della resina sarà marrone scuro/nero. La resina diminuisce di volume leggermente.</li>
		<li>Perle di vetro di uso per coprire la parte superiore della resina. Questi impedirà la resina di essere disturbati quando vengono aggiunte nuove soluzioni.</li>
		<li>Eluire la colonna con 20 mL di 1 M HCl.</li>
		<li>Eluire la colonna con una maggiore concentrazione di HCl di 1,5 M (&#8776; 50 mL). Una soluzione gialla inizierà a venire fuori la colonna. Aumentare la concentrazione di HCl 2 m e continuare ad eluizione finché l'eluato è incolore o giallo-verde molto pallido. Un volume totale di 150-200 mL sarà richiesto per questo processo.</li>
		<li>Aumentare la concentrazione di HCl a 2,5 M (20-50 mL). Raccogliere l'eluato come frazioni in provette. Aumentare a 3 M HCl. Il prodotto sarà eluire dalla colonna come soluzione di verde-marrone. Una frazione di rosso-marrone può anche cominciare a venire fuori la colonna. Come queste frazioni sono le impurità ossidato rutenio rosso, non fare piscina con le frazioni di verde-marrone.</li>
	</ol></li> <li>Caratterizzazione e la verifica della purezza di [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>tutte le frazioni da testare Passo 1.3.8. dalla spettroscopia UV-vis. Per eseguire questa operazione, aggiungere 100 µ l di una determinata frazione in 2 mL di 3 M NH3 e analizzare mediante spettroscopia UV-vis. Le frazioni contenenti il prodotto puro avrà una band di grande capacità di assorbimento a 360 nm e una meno intensa assorbanza a 600 nm. Assorbanza a 533 o 480 nm è indicativo di ossidato rutenio rosso e le impurità del rutenio rosso, rispettivamente.</li>
		<li>Piscina frazioni contenenti il prodotto puro ed evaporare la soluzione ad essiccazione per evaporazione rotante. Il prodotto sarà isolato come un solido verde-marrone. Rendimenti sono tipicamente dell'ordine di 5-15 mg (10-20% di rendimento). Monocristalli, adatti per diffrazione dei raggi x, possono essere ottenute dalla diffusione del vapore dell'etanolo in soluzioni acquose del composto.</li>
		<li>Per verificare la purezza, analizzare il composto dalla spettroscopia UV-vis in una soluzione di soluzione tampone fosfato pH 7.4 (PBS). Purezza può essere valutata prendendo il rapporto di intensità di 360 nm e 600 nm cime. Questo rapporto è 31 per un composto puro. Per i composti impuri, il rapporto sarà più piccolo.</li>
		<li>Analizzare il campione nella a stato solido di spettroscopia IR. Bande di diagnostiche sono al 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 e 815 cm -1. Bande di impurità comuni sono visti al 1762 cm -1 e 1400 cm -1, caratteristico di NH 4 cl. rutenio rosso può essere identificato da bande a 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 e 800 cm -1.</li>
	</ol></li> <li>Valutazione di inibizione di assorbimento del calcio mitocondriale dalla spettroscopia di fluorescenza attenzione! Le procedure seguenti utilizzano cellule di mammiferi. Lavoro deve essere svolto in cappe a flusso laminare appropriati che sono certificate per sicurezza biologica di livello 2 (BSL2) ricerca. 
	&#8203; Nota: [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 verrà essere denominato come [Ru] in questa sezione <ol><li>Make tamponata contenenti glucosio soluzione salina (BGSS) il supporto di analisi. BGSS è una soluzione composta da 110 mM KCl, 1mm KH 2 PO 4, 1mm MgCl 2, 20mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), succinato del sodio di 5 mM, 30 µM glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N &#39;, N &#39;-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA). Combinare tutto tranne l'EGTA, regolare il pH a 7,4. Aggiungere EGTA e regolare il pH a 7,4. Per 50 mL di media saggio aggiungere 0,5 mL di glucosio 1 mg/mL.</li>
		<li>Cellule HeLa di cultura in 500 cm 2 piastre Petri Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) in un incubatore con 5% CO 2 al 37 cellule di C. amplificare HeLa ° che crescono in un 100mm di Petri da semina li in una capsula di Petri 2 500 cm. Il volume totale media nel grande piatto è 115 mL. Ogni piatto grande resa di circa 18 milioni di cellule, abbastanza per due esperimenti di spettroscopia di fluorescenza.
		<ol><li>Crescere le cellule fino a quando raggiungono il 90-95% confluenza. Rimuovere i supporti e lavare le cellule con 15 mL di PBS pH 7.4. Aggiungere 15 mL di 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS e incubare per 10 minuti staccare le cellule. Trasferire le cellule a 14 mL fondo falcon tubi tondi</li></ol></li> <li>contare le celle utilizzando trypan blu e un emocitometro con un microscopio invertito e calcolare il numero totale delle cellule ed il volume dei mezzi necessari per raggiungere 7,5 milioni di cellule per 1,8 mL di volume del mezzo. Centrifugare le cellule per 10 min a 5310 × g. decantare il supernatante e aggiungere il volume calcolato di BGSS. Risospendere delicatamente le cellule.
		<ol><li>Per questo test, preparare soluzioni di riserva di digitonina 40mm in dimetilsolfossido (DMSO), 1 mM calcio verde-5N in H 2 O e 10 mM CaCl 2 in soluzioni di riserva di H 2 O. [Ru], preparati in acqua pura, può variare da 1-3 mM. 
			&#8203; Nota: calcio verde-5N è sensibile alla luce. Conservare al buio e ridurre al minimo l'esposizione alla luce.</li>
		</ol></li> <li>Setup il fluorimetro per eccitare a 506 nm e leggere l'emissione a 532 nm con il cuvetta-titolare controllato a 37 ° C. Prepare una cuvetta acrilico con ancoretta o ruota, 1,8 mL di sospensione cellulare da 1.5.2 sopra, 1,8 µ l di soluzione di digitonina, 3.6 & #181; L calcio verde-5N (soluzione) e 9 µ l [Ru] (per la soluzione 1 mM, concentrazione finale di 5 µM). Incubare le cellule per 15 min nel fluorimetro.
		<ol><li>Leggere i dati come rapporto di eccitazione/emissione invece l'assorbimento crudo. Questa pratica riduce al minimo gli errori associati con le fluttuazioni dell'intensità della sorgente luminosa.</li>
			<li>Svolgere analisi del prima campione in assenza di [Ru] per misurare l'effetto dell'aggiunta di CaCl 2 sulla risposta delle cellule.</li>
			<li>Analisi Begin il fluorimetro con le impostazioni descritte 1.5.4. Attendere circa 2 minuti per stabilire una base di emissione stabile e quindi aggiungere 1,8 µ l di CaCl 2 (concentrazione finale di 10 µM). L'intensità di emissione aumenterà immediatamente dopo l'aggiunta di CaCl 2 e quindi decadrà nel corso dei minuti come gli ioni di calcio entra i mitocondri. Attendere che il decadimento ha terminato (&#8776; 5 min). Aggiungere i boli supplementare del calcio per determinare la risposta di assorbimento del calcio mitocondriale delle cellule non trattate con [Ru].</li>
		</ol></li> <li>In un'altra provetta contenente 5 µM [Ru], ripetere l'esperimento, come descritto in precedenza in 1.5.4.3. In presenza dell'inibitore, intensità di emissione farà aumentare, ma non decadere. Questa osservazione indica bloccato l'assorbimento del calcio mitocondriale.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enjoy+the+trip:+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth.">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li><li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+calcium+connection.">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li><li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+homeostasis+as+potential+target+for+mitochondrial+medicine.">Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine.</a> Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).</li><li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szab&#242;, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li><li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).</li><li>Kamer, K. J., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).</li><li>Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport+by+an+oxo-bridged+dinuclear+ruthenium+ammine+complex.">Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex.</a> Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).</li><li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+component+of+"ruthenium+red"+responsible+for+inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport.+Spectra,+electrochemistry,+and+aquation+kinetics.+Crystal+structure+of+&#181;-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of &#181;-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li><li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-bridged+Dinuclear+Ruthenium+Amine+Complex+Specifically+Inhibits+Ca2++Uptake+into+Mitochondria+in+Vitro+and+in+Situ+in+Single+Cardiac+Myocytes.">Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes.</a> J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li><li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li><li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360,+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake.">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li><li>Allen, A. D., Senoff, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+infrared+spectra+of+some+ammine+complexes+of+ruthenium(II)+and+ruthenium(III).">Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III).</a> Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li><li>Deak, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+mitochondrial+Ca&#8314;+uptake.">Assessment of mitochondrial Ca&#8314; uptake.</a> Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Il calcio mitocondriale assorbimento inibitore [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 può essere sintetizzato da [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un ruthenium(III) ben noto a partire del materiale, come descritto in questa procedura. La sintesi di [Ru (NH3)5Cl] Cl2 è realizzata prontamente con poca difficoltà. Dopo agitazione RuCl3 per 16 h in idrazina idrato, il pH della solu...

Calcio mitocondriale è un regolatore chiave per un certo numero di processi che sono fondamentali per la funzione normale delle cellule, tra cui l'apoptosi e la produzione di energia. 1 , 2 , 3 il calcio mitocondriale uniporter (MCU), una proteina del trasportatore dello ione che si trova sulla membrana mitocondriale interna, regola l'afflusso degli ioni di calcio nei mitocondri. 4 , 5 , 6 inibitori chimici della MCU sono strumenti preziosi per proseguire gli sforzi per studiare la funzione e i ruoli cellulari di questa proteina di trasporto e di calcio mitocondriale. Il composto [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, è uno degli inibitori selettivi noti soli per la MCU con un valore did K riferito di 24 µM.7 ,8,9,10 , questo complesso è una comune impurità trovata in formulazioni commerciali del rutenio rosso (RuRed), un triruthenium di-µ-oxo "a ponte" hexacation della formula [(NH3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, che è stato utilizzato anche come un inibitore di assorbimento del calcio. Anche se Ru360 è disponibile in commercio, è molto costoso. Inoltre, la sintesi e l'isolamento di Ru360 è sfidato da purificazione difficili procedure e metodi di caratterizzazione ambigua.
Recentemente abbiamo segnalato procedure alternative per accedere un Ru360 analogici, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 questo composto inibisce la MCU con alta affinità, simile a Ru360. In questo protocollo, descriveremo la nostra sintesi più efficace di questo composto, che comincia da [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purificazione del prodotto utilizzando la resina a scambio cationico fortemente acido è dettagliato, insieme a trabocchetti comuni per questa procedura. Inoltre presentiamo metodi di caratterizzazione e valutazione della purezza del composto e delineare un approccio semplice per testare la sua efficacia nel bloccare l'assorbimento di calcio mitocondriale.

<table><tbody><tr><td>Ruthenium Trichloride hydrate</td><td>Pressure Chemical</td><td>3750</td><td></td></tr><tr><td>Concentrated hydrochloric acid</td><td>J.T. Baker</td><td>9535</td><td></td></tr><tr><td>Concentrated ammonium hydroxide</td><td>Mallinckrodt Chemical Works</td><td>A669C-2 1</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50 WX2 200-400 Mesh</td><td>Alfa Aesar</td><td>13945</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Green 5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Aldrich</td><td>260746</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Aldrich</td><td>471267</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>USB</td><td>20598</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fluka</td><td>54466</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Succinate</td><td>Alfa Aesar</td><td>33386</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Aldrich</td><td>G5000</td><td></td></tr><tr><td>200 Round bottom flask</td><td>ChemGlass</td><td>CG-1506-14</td><td></td></tr><tr><td>Glass stopper</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3000-05</td><td></td></tr><tr><td>10 mm x 15 cm glass column with reservoirs</td><td>Custom - similar to Chemglass columns</td><td>Similar to CG-1203-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom Falcon tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11B&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>500 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; petri dishes</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic Cuvettes</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>58017-875</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrometer</td><td>Agilent Model Cary 8454&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorimeter</td><td>SLM Model 8100C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR spectrometer</td><td>Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ALC Model PM140R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted light microscope</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>89404-462</td><td></td></tr></tbody></table>

synthesis and evaluation of a ruthenium-based mitochondrial calcium uptake inhibitor

Dettagliamo la sintesi e la purificazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]+ 5. La sintesi ottimizzata di questo composto ha inizio dalla [Ru (NH3)5Cl] Cl2 in 1m NH4OH in un contenitore chiuso, ottenendo una soluzione verde. Purificazione viene eseguita mediante cromatografia a scambio cationico. Questo composto è caratterizzato e verificato per essere puro mediante spettroscopia UV-vis e IR. Le proprietà inibitorie di assorbimento di calcio mitocondriale sono valutate in cellule HeLa permeabilized dalla spettroscopia di fluorescenza.

Questo metodo descrive una sintesi di calcio mitocondriale assorbimento inibitore [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 a partire da [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un materiale di partenza ben noto ruthenium(III). [Ru (NH3)5Cl] CL2 è caratterizzato dalla spettroscopia IR, con modi vibrazionali a 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1<...

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Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Sintesi e valutazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale a base di rutenio

Un protocollo per la sintesi, purificazione e caratterizzazione di un inibitore dell'assorbimento del calcio mitocondriale basato sul rutenio è presentato. Una procedura per valutare la sua efficacia in cellule di mammifero permeabilized è dimostrata.

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

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7.8K Views.  Cornell University. Un protocollo per la sintesi, purificazione e caratterizzazione di un inibitore dell'assorbimento del calcio mitocondriale basato sul rutenio è presentato. Una procedura per valutare la sua efficacia in cellule di mammifero permeabilized è dimostrata.

Video: Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the hydroxylmethylene phosphine precursor with ammonia in methanol under a nitrogen atmosphere. The N-triphosPh ligand precipitates from the solution after approximately 1 hr of reflux and can be isolated analytically pure via simple cannula filtration procedure under nitrogen. Reaction of the N-triphosPh ligand with [Ru3(CO)12] under reflux affords a deep red solution that show evolution of CO gas on ligand complexation. Orange crystals of the complex [Ru(CO)2{N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (2) were isolated on cooling to RT. The 31P{1H} NMR spectrum showed a characteristic single peak at lower frequency compared to the free ligand. Reaction of a toluene solution of complex 2 with oxygen resulted in the instantaneous precipitation of the carbonate complex [Ru(CO3)(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (3) as an air stable orange solid. Subsequent hydrogenation of 3 under 15 bar of hydrogen in a high-pressure reactor gave the dihydride complex [RuH2(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (4), which was fully characterized by X-ray crystallography and NMR spectroscopy. Complexes 3 and 4 are potentially useful catalyst precursors for a range of hydrogenation reactions, including biomass-derived products such as levulinic acid (LA). Complex 4 was found to cleanly react with LA in the presence of the proton source additive NH4PF6 to give [Ru(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P{CH3CO(CH2)2CO2H}-&#954;2O](PF6) (6).

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Ruthenium phosphine complexes are widely used for homogeneous catalytic reactions such as hydrogenations. The synthesis of a series of novel tridentate ruthenium complexes bearing the N-triphos ligand N(CH2PPh2)3 is reported. Additionally, the stoichiometric reaction of a dihydride Ru&#8211;N-triphos complex with levulinic acid is described.

La sintesi, caratterizzazione e reattività di una serie di rutenio<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; Complessi

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the ...

Ricerca

Chimica

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ability to accurately measure the influx and efflux of Ca2+ from mitochondria is important for determining the role of mitochondrial Ca2+ handling in these processes. In this report, we present two methods for the measurement of mitochondrial Ca2+ handling in both isolated mitochondria and cultured cells. We first detail a plate reader-based platform for measuring mitochondrial Ca2+ uptake using the Ca2+ sensitive dye calcium green-5N. The plate reader-based format circumvents the need for specialized equipment, and the calcium green-5N dye is ideally suited for measuring Ca2+ from isolated tissue mitochondria. For our application, we describe the measurement of mitochondrial Ca2+ uptake in mitochondria isolated from mouse heart tissue; however, this procedure can be applied to measure mitochondrial Ca2+ uptake in mitochondria isolated from other tissues such as liver, skeletal muscle, and brain. Secondly, we describe a confocal microscopy-based assay for measurement of mitochondrial Ca2+ in permeabilized cells using the Ca2+ sensitive dye Rhod-2/AM and imaging using 2-dimensional laser-scanning microscopy. This permeabilization protocol eliminates cytosolic dye contamination, allowing for specific recording of changes in mitochondrial Ca2+. Moreover, laser-scanning microscopy allows for high frame rates to capture rapid changes in mitochondrial Ca2+ in response to various drugs or reagents applied in the external solution. This protocol can be applied to measure mitochondrial Ca2+ uptake in many cell types including primary cells such as cardiac myocytes and neurons, and immortalized cell lines.

Here, we present two protocols for the measurement of mitochondrial Ca2+ influx in isolated mitochondria and cultured cells. For isolated mitochondria, we detail a plate reader-based Ca2+ import assay using the Ca2+ sensitive dye calcium green-5N. For cultured cells, we describe a confocal microscopy method using the Ca2+ dye Rhod-2/AM.

Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Biochimica

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimatica Assay misurare Trascrizione inibizione da gallio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Bioingegneria

Dose Uptake of Platinum- and Ruthenium-based Compound Exposure in Zebrafish by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry with Broader Applications

Metals and metal-based compounds comprise multifarious pharmaco-active and toxicological xenobiotics. From heavy metal toxicity to chemotherapeutics, the toxicokinetics of these compounds have both historical and modern-day relevance. Zebrafish have become an attractive model organism in elucidating pharmaco- and toxicokinetics in environmental exposure and clinical translation studies. Although zebrafish studies have the benefit of being higher-throughput than rodent models, there are several significant constraints to the model.
One such limitation is inherent in the waterborne dosing regimen. Water concentrations from these studies cannot be extrapolated to provide reliable internal dosages. Direct measurements of the metal-based compounds allow for a better correlation with compound-related molecular and biological responses. To overcome this limitation for metals and metal-based compounds, a technique was developed to digest zebrafish larval tissue after exposure and quantify metal concentrations within tissue samples by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS).
ICPMS methods were used to determine the metal concentrations of platinum (Pt) from cisplatin and ruthenium (Ru) from several novel Ru-based chemotherapeutics in zebrafish tissue. Additionally, this protocol distinguished concentrations of Pt that were sequestered in the chorion of the larval compared with the zebrafish tissue. These results indicate that this method can be applied to quantitate the metal dose present in larval tissues. Further, this method may be adjusted to identify specific metals or metal-based compounds in a broad range of exposure and dosing studies.

The increased rate of pharmaco- and toxicokinetic analyses of metals and metal-based compounds in zebrafish can be advantageous for environmental and clinical translation studies. The limitation of unknown waterborne exposure uptake was overcome by conducting trace metal analysis on digested zebrafish tissue using inductively coupled plasma mass spectrometry.

Assorbimento della dose dell'esposizione a composti a base di platino e rutenio in Zebrafish mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente con applicazioni più ampie

Metals and metal-based compounds comprise multifarious pharmaco-active and toxicological xenobiotics. From heavy metal toxicity to chemotherapeutics, the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modifica della funzione mitocondriale per applicazioni terapeutiche e bioinsetticide

Unveiling Xenobiotic Transport and Effects in Isolated Mitochondria: Insights from Respirometric and Enzymatic Assays

Mitochondria are often referred to as the cell's powerhouse due to their crucial role in energy production through the electron transport chain (ETC). However, their significance extends far beyond energy production. Dysregulation of mitochondrial bioenergetics can trigger intracellular cascades that impact health and cellular function. Given their physiological importance, there is growing interest in exploring the pharmacological potential of mitochondrial function for developing new therapies and bioproducts. Modulating mitochondrial bioenergetics could provide innovative approaches to address challenges such as neurodegenerative disorders, metabolic diseases, and cancer, as well as to develop bioproducts for controlling pests and vector-borne diseases.
This work presents a method for assessing the effects of xenobiotics on the electron transport chain (ETC) using various substrates, including glutamate and NADH for complex I, succinate for complex II, and cytochrome c (both oxidized and reduced) for complexes III and IV. This methodology allows the activation or inhibition of electron transport through mitochondrial complexes to be evaluated using a respirometer and spectrophotometer. The mitochondria can be sourced from isolated mitochondria, fragmented cells, or homogenized tissue from various species.
In the laboratory, mitochondrial function has been analyzed in Aedes aegypti and Wistar rats, but this method is also applicable to other species, such as Rhipicephalus microplus and Rhodnius prolixus. This approach provides the basis for theorizing about the existence of uncoupler proteins and species-specific oxidizable substrate preferences influenced by their unique energetic demands. Recent findings offer valuable insights into innovative bioinsecticide design strategies that target mitochondrial function, holding significant potential for effectively controlling vector-borne diseases and pest infestations.

<meta charset="utf8"></head><body>Svelare il trasporto e gli effetti degli xenobiotici nei mitocondri isolati: approfondimenti da saggi respirometrici ed enzimatici

This study introduces a methodology for studying xenobiotic effects on mitochondrial function via respirometric and enzymatic assays. It examines electron transport chain modulation in various species, offering insights for targeted biopesticide development against insect vector-borne diseases.

Svelare il trasporto e gli effetti degli xenobiotici nei mitocondri isolati: approfondimenti da saggi respirometrici ed enzimatici

Mitochondria are often referred to as the cell's powerhouse due to their crucial role in energy production through the electron transport chain (ETC). ...

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in cytosolic Ca2+ buffering, and the ATP production in mitochondrial can be mediated by intramitochondrial free Ca2+ concentration. Ca2+ retention capacity can be regarded as the capability of mitochondria to retain calcium in the mitochondrial matrix. Accumulated intracellular Ca2+ leads to the permeability of the inner mitochondrial membrane, termed the opening of mitochondrial permeability transition pore (mPTP), which leads to the leakage of molecules with a molecular weight less than 1.5 kDa. Ca2+-triggered mitochondria swelling is used to indicate the mPTP opening. Here, we describe two assays to examine the Ca2+ retention capacity and Ca2+-triggered mitochondrial swelling in isolated mitochondria. After certain amounts of Ca2+ are added, all steps can be completed in one day and recorded by a microplate reader. Thus, these two simple and effective assays can be adopted to assess the Ca2+-related mitochondrial functions.

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

This protocol aims to describe a method to examine the Ca2+ retention capacity and Ca2+- triggered mitochondrial swelling of isolated mitochondria of SH-SY5Y cells step-by-step.

Mitocondriale di Ca2 + ritenzione capacità Assay e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale Assay

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Neuroscienze

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Biologia

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Sintesi e valutazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale a base di rutenio

Riepilogo

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Capitoli in questo video

La sintesi, caratterizzazione e reattività di una serie di rutenio

Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

Un

Assorbimento della dose dell'esposizione a composti a base di platino e rutenio in Zebrafish mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente con applicazioni più ampie

Svelare il trasporto e gli effetti degli xenobiotici nei mitocondri isolati: approfondimenti da saggi respirometrici ed enzimatici

Svelare il trasporto e gli effetti degli xenobiotici nei mitocondri isolati: approfondimenti da saggi respirometrici ed enzimatici

Svelare il trasporto e gli effetti degli xenobiotici nei mitocondri isolati: approfondimenti da saggi respirometrici ed enzimatici

Mitocondriale di Ca^{2 +} ritenzione capacità Assay e Ca^{2 +}-innescato gonfiamento mitocondriale Assay

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente