Name: hydrodynamic renal pelvis injection for non-viral expression of proteins in the kidney
Uploaded: 2018-01-08T12:30:00.000+00:00
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Il Career Development Award dal Department of Veterans Affairs [BX002797] supportati L.E.W. e il National Institutes of Health [R01-DK095867] e American Heart Association [15GRNT25700209] supportati J.C. Il National Institutes of Health [DK093660], Department of Veterans Affairs [BX002190] e centro del Vanderbilt per la malattia renale supportati M.H.W. Questo materiale è il risultato di lavoro sostenuto con risorse e utilizzo di servizi VA Tennessee Valley Healthcare System.

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Gli autori non hanno nulla di divulgare e non dichiarare alcun conflitto di interessi.

In questo protocollo è descritto un metodo affidabile per la realizzazione di espressione genica riproducibile in particolare nel rene. Nelle mani di un chirurgo esperto moderatamente abbiamo trovato la percentuale dei topi transfettati con questa tecnica per essere nella gamma di 50-100%, a seconda dell'età del mouse e la sensibilità di lettura del transgene. Il livello di espressione di gene della luciferasi era sopra priorità bassa per parecchi mesi in topi che ricevono piggyBac trasposoni e completamente mantenuta per diverse settimane in topi immunocompromessi che ricevono la stessa trasposoni11. Mentre molte cellule hanno macchiato brillantemente per il transgene in aree vicino al sito di iniezione, l'efficienza di trasfezione complessiva era relativamente basso (Figura 3D). Il materiale più importante per ottenere il risultato desiderato è la siringa di iniezione stessa. Deve trattarsi di una siringa da insulina 29 x ½" con un ago attaccato e nessuna sicurezza per ostacolare l'iniezione. L'iniezione deve essere veloce, all'interno di tre s. La preparazione di DNA plasmidico dovrebbe essere pura, con bassissima endotossina e batteriche genomic DNA livelli19.
È concepibile che le iniezioni di altre sostanze, quali virus, RNA o proteine, possono essere fatto in un modo simile. Pelvi renale era superiore come una via di ingresso ad altri siti di iniezione testato, come la vena renale o iniezione diretta del parenchima renale. Tali iniezioni hanno portato a sanguinamento e inferiore di espressione genica11. Poiché la pelvi renale è una struttura elastica per tenere il riflusso di urina a volte necessaria, può essere meglio in grado di allungare e ospitare l'ago. Perdita di urina dal buco creato dalla siringa di insulina o di soluzione di DNA non è stato osservato, suggerendo che la pelvi renale è riparata rapidamente. L'esatto meccanismo mediante il quale il liquido iniettato transfects del rene non è stato studiato in profondità, come ha fatto per il fegato, per esempio. Studi di microscopia elettronica futuro possono delucidare ulteriormente questo meccanismo. La natura retrograda dell'iniezione ha la precedenza in quanto il metodo di iniezione della vena della coda idrodinamica inverte il flusso della vena epatica20 e altri metodi di successo di transfezione di rene hanno iniettato attraverso la vena renale12, 13 , 14 , 21. danno del rene è probabilmente necessaria per un'efficienza ottimale di transfezione quindi supponiamo che la transfezione si verifica tramite danni alla membrana cellulare causata tramite l'iniezione veloce, ad alto volume. I podociti, tubuli e condotti di raccolta hanno interfaccia diretta con lo spazio urinario come loro principale funzione è di filtrare e concentrare l'urina.
Sebbene riproducibile e rene-specifico, questo metodo è limitato dall'efficienza di trasfezione relativamente bassa osservata (Figura 3D). Iniezione idrodinamica pelvi renale non è un sostituto per la creazione di un animale transgenico guidando il transgene da un promotore di rene-specifico, in cui ogni cellula di un certo sottotipo nell'animale avrebbe espresso il gene di interesse. Piuttosto, questo metodo è più adatto agli approcci di trasferimento del gene per le malattie in cui un piccolo numero di cellule corrette avrebbe un effetto drammatico sul fenotipo, per la secrezione di ormoni o altre sostanze normalmente prodotte dal rene o per la creazione di un popolazione di cellule rare che esercitare qualche effetto positivo sul rene di riparare o rigenerarlo. In alternativa, potrebbe essere utilizzato anche in modo opposto a sviluppare un nuovo modello di lesione del rene con l'introduzione di un transgene con un'influenza negativa.

La tecnica di iniezione della vena della coda idrodinamica è diventato un modo comunemente usato per raggiungere elevati livelli di espressione genica nei mouse del fegato1,2. I reni sono anche trasfettati con questa tecnica ad un livello più basso, circa 100 volte meno3. L'iniezione idrodinamica pelvi renale descritto qui fornisce un modo semplice per controllare la specificità di espressione organo attraverso mezzi fisici utilizzando gli stessi principi idrodinamici che sono stati stabiliti in precedenza nel fegato4,5 , muscolo6e altri organi7,8. Questo metodo transfects cellule in animali vivi in vivo mediante pressione e velocità per forzare il fluido contenente DNA nelle cellule, allo stesso tempo inducendo danni all'organo che è rapidamente risolto9. Usando le tecniche chirurgiche consolidate per visualizzare il rene attraverso un' incisione di fianco10 insieme con una singola iniezione con una siringa di insulina, abbiamo trovato successo transfezione di vari tipi di cellule renali, principalmente interstiziale fibroblasti, tubuli e raccolta del condotto11. Dissezione di questi topi ha dimostrato che altri organi non transfected a livelli abbastanza in alto per visualizzare di luciferasi11di tecniche di imaging. Poiché la tecnica è non-virale, uso del DNA del plasmide per la transfezione permette facile e veloce preparazione dei reagenti necessari per l'iniezione.
Abbiamo usato iniezioni localizzate di idrodinamiche per esprimere l'antiossidante glutatione S-transferasi A4, il recettore del fattore di crescita 1 insulino-simile e l'eritropoietina dell'ormone nel rene, tutte dotate di effetti biologici previsti11, 12 , 13. valutazione dettagliata della via di somministrazione, volume di iniezione, dosaggio di DNA e la scelta del promotore è stata effettuata11. Inoltre, entrambi i piggyBac trasposone sistema trattamento e/o ciclofosfamide per sopprimere la reazione immunitaria per il transgene hanno dimostrato di migliorare i risultati a lungo termine espressione di gene11. Altri ricercatori hanno utilizzato un approccio della vena renale nel ratto con successo, raggiungere la transfezione alta efficienza per periodi di tempo superiori a un mese14. Tuttavia, correzione genetica dei fenotipi che imita la malattia umana vengono solitamente eseguiti in topi prima come un proof-of-concept poiché modelli genetici più mammiferi sono modelli murini. Abbiamo confrontato ad iniezione della vena renale alla pelvi renale iniezione e trovato che iniezione nella pelvi renale era superiore alla vena renale per l'espressione genica (circa dieci volte superiore) e sopravvivenza11. La pelvi renale è un percorso ideale di entrata nel rene, perché è abbastanza flessibile da tollerare fluttuazioni della produzione di urina e spesso è in grado di mantenere la sua integrità strutturale anche quando dilatato durante idronefrosi. Inoltre, iniezione nella pelvi renale consentito l'accesso al rene senza perforare la capsula del rene, permettendo il visibilmente trattenuto dal rene meglio di intraparenchymal iniezione del fluido iniettato. Altri organi del mouse non si dispone di un percorso di ingresso diverso da quello del sistema vascolare, ma lo spazio urinario del rene è un sito di iniezione ideale. Inoltre, iniezione nella vena renale ha provocato perdite di sangue nella cavità addominale. Il volume totale del rene dei reni di selvaggio-tipo di mouse è stato stimato dalla risonanza magnetica per essere circa 0,2 cm3, quindi il volume di un singolo rene è approssimativamente uguale alla quantità di liquido iniettato dal bacino renale idrodinamico iniezione (100 µ l)15. Qui, abbiamo messo a disposizione tutte le sfumature dettagliate del protocollo iniezione idrodinamica pelvi renale per raggiungere transfezione riproducibile del rene.

<table><tbody><tr><td>AnaSed Xylazine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-808-1947</td><td>Anesthetic - Not controlled substance</td></tr><tr><td>BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch</td><td>Cardinal Health</td><td>309306</td><td>Required syringes</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Pharmacist/Veterinarian</td><td></td><td>Analgesia - Controlled Substance</td></tr><tr><td>Dynarex Disposable Towel Drape</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19-310-671</td><td>Place over heat pad</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Use only endotoxin-free plasmid DNA</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control</td><td>Charles River</td><td>PC200</td><td>Positive control for endotoxin test</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial</td><td>Charles River</td><td>R13500</td><td>Endotoxin test</td></tr><tr><td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5882</td><td>Surgical tool</td></tr><tr><td>Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch - 9&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td>For autoclaving surgical tools</td></tr><tr><td>Gaymar Heat Pump</td><td>Paragon Medical</td><td>TP-700</td><td>Water-circulating heat pump</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>DS-401</td><td>To reuse surgical tools during surgery</td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5136</td><td>Surgical tool</td></tr><tr><td>Graefe Tissue Forceps</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5153</td><td>Surgical tool</td></tr><tr><td>Halsey Needle Holder, 5&quot; Length</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-7841</td><td>Surgical tool</td></tr><tr><td>Heat pads - 15&quot; x 21&quot; - need at least 3</td><td>Paragon Medical</td><td>TP22G</td><td>For use with Gaymar Heat Pump</td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurane, USP)</td><td>Abbott Animal Health</td><td>5260-04-05</td><td>For imaging and euthanasia</td></tr><tr><td>Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor</td><td>Smiths Medical</td><td>VCT3K2</td><td>For imaging and euthanasia</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Pharmacist/Veterinarian</td><td></td><td>Anesthetic - Controlled Substance</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Laboratory tissues</td></tr><tr><td>Living Image software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>For live animal imaging</td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122796</td><td>For live animal imaging</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000-US-CAN</td><td>Spectrophotometer for DNA measurement</td></tr><tr><td>Prevantics Swabs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-100-110</td><td>For skin surgery prep</td></tr><tr><td>Prolene 5-0 sutures Taper 30&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0256891</td><td>Non-absorbable sutures for skin</td></tr><tr><td>Puralube Brand Opthalmic Ointment</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-888-2572</td><td>To keep eyes moist during surgery</td></tr><tr><td>Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR-5240</td><td>Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA</td></tr><tr><td>Vicryl 5-0 Sutures J303H</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9816710</td><td>Absorbable sutures for muscle layer</td></tr><tr><td>Wahl Mini Arco Clipper</td><td>Med-Vet International</td><td>8787-1550</td><td>Shaver for skin prep</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>For live animal imaging</td></tr></tbody></table>

hydrodynamic renal pelvis injection for non-viral expression of proteins in the kidney

Iniezione idrodinamica crea un ambiente locale, ad alta pressione di transfect vari tessuti con il DNA del plasmide ed altre sostanze. Iniezione della vena della coda idrodinamica, ad esempio, è un metodo ben stabilito che il fegato può essere transfected. Questo manoscritto descrive un'applicazione di principi idrodinamici per iniezione del rene del mouse direttamente con il DNA del plasmide per l'espressione genica del rene-specifica. Topi sono anestetizzati e rene è esposto da un'incisione del fianco seguita da una rapida iniezione di una soluzione contenente DNA plasmidico direttamente nella pelvi renale. L'ago è mantenuto sul posto per dieci secondi e il sito di incisione viene suturato. Il giorno seguente, immagini animali dal vivo, Western blot, o immunohistochemistry può essere usato per analisi di espressione genica o altri dosaggi adatti per il transgene di scelta vengono utilizzati per il rilevamento della proteina di interesse. Metodi pubblicati per prolungare l'espressione genica comprendono trattamento di integrazione e ciclofosfamide transgene transposon-mediata per inibire la risposta immunitaria per il transgene.

La tecnica di iniezione e chirurgia sono semplici da eseguire una volta masterizzato, che non richiede grandi attrezzature o materiali costosi. Se nuovo in chirurgia renale incisione a fianco, una giornata di formazione su diversi topi prevista per l'eutanasia dovrebbe essere consentita in cui i topi non sono recuperata dopo chirurgia perché il primo tentativo di questo tipo di chirurgia può richiedere molto più tempo rispetto al normale. In alternativa, gli investigatori hanno familiari con tecniche simili possono risultare abbastanza semplice. Seguire attentamente l'immagine nella Figura 1 e le indicazioni illustrate in Figura 2. Per posizionare correttamente l'incisione, il chirurgo può utilizzare le dita per spingere sullo stomaco del mouse mentre depone sul suo lato. Il rene è visualizzato da un piccolo nodulo che sorge vicino alla spina dorsale con una leggera pressione addominale, e l'incisione deve essere fatta sopra questa zona (Figura 1 e Figura 2). È importante effettuare l'incisione attraverso gli strati di pelle e il muscolo la dimensione corretta (Figura 1). Se l'incisione è troppo grande, il rene scivolerà indietro nella cavità addominale facilmente, rendendo difficile la iniezione. Se l'incisione è troppo piccolo, sarà difficile spingere il rene fuori della cavità addominale e potrebbero verificarsi danni d'organo. Un altro punto importante è il posizionamento dell'ago nella pelvi renale. Il chirurgo dovrebbe spingere il rene con pinze chiuse, quindi inserire l'ago nella pelvi renale ad un angolo parallela alla superficie di lavoro tale che la maggior parte del volume iniezione va direttamente nel parenchima del rene (Figura 2). È importante che l'iniezione essere eseguita più rapidamente possibile per indurre la pressione idrodinamica necessaria per la transfezione di rene.
Topi di diversi ceppi, età, peso e sesso avrà differenze nella posizione del rene e della quantità di grasso che circonda il rene, quindi alcune modifiche potrebbero essere necessarie lavorare con i topi di interesse. Se possibile, il primo tentativo chirurgico da cui vengono recuperati i topi dovrebbe includere una lettura immediata di espressione genica del rene-specifica, ad esempio luciferasi imaging (Figura 3A). Se giovani topi sono utilizzati, il risultato previsto è che tutti i topi avrà una luminosità che è all'interno di un ordine di grandezza (Figura 3B). Occasionalmente, anche dopo una seconda iniezione di luciferina, è apparente di imaging che una o più mouse non è riuscito a diventare trasfettate ad un livello paragonabile agli altri o che alcuni topi iniettati sono addirittura completamente prive di espressione genica. Tali topi possono essere esclusi dallo studio dovuto transgene fallita consegna. Se molti dei topi mancanza di espressione genica, il chirurgo dovrebbe diminuire il tempo di iniezione della soluzione del DNA. Fallimento per indurre il danno necessario attraverso l'alta pressione dell'iniezione è la causa più probabile per la costante mancanza di espressione genica. Topi dovrebbero essere attentamente monitorata dopo chirurgia per potenziali problemi di salute (Vedi tabella 1 per potenziali problemi di salute con soluzioni di accompagnamento e consultare con equipe veterinaria dell'istituzione come necessario). Dopo un periodo di formazione iniziale, l'intervento stesso dovrebbe prendere meno di dieci minuti. Il periodo chirurgico dovrebbe avvenire più breve possibile agendo sul uno mouse alla volta per evitare l'essiccazione dei tessuti durante l'intervento chirurgico. La maggior parte dell'investimento di tempo in questa procedura è dovuto l'induzione di recupero dalla chetamina/xilazina anestetico. Due personale esperto lavorando come una squadra dovrebbero aspettarsi di eseguire fino a dieci interventi chirurgici al giorno, con quindici anni come un massimo ragionevole.
I ricercatori dovrebbero aspettarsi un basso numero di cellule a macchiare altamente positivo per il transgene entro i primi giorni dopo l'iniezione. Queste cellule positive saranno localizzate in zone circostanti aree dove il fluido iniezione infiltrato il rene (Figura 3-D). Alcune parti del rene sarà completamente negativi per cellule trasfettate. Tali aree negative sarà carente in eritrociti e hanno completamente normale istologia poiché l'iniezione non ha raggiunto queste aree. Protocolli e promotori di colorazione deve essere ottimizzato con cura per catturare l'espressione genica. Gli investigatori dovrebbero aspettarsi che la cella tipi trasfettati sarà variabile, i livelli di espressione genica all'interno la bassa percentuale di cellule trasfettate sono alti, e la localizzazione delle proteine all'interno delle cellule non può essere come previsto a causa di alti livelli di espressione (Figura 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56324/56324fig3.jpg"> Figura 3. Iniezione idrodinamica pelvi renale si traduce in espressione genica renali-specifica di luciferase e TdTomato. (A) FVB 7-8 settimana vecchio topo maschio sono stati dati idrodinamici pelvi renale iniezioni di 20 µ g di pTEeL, esprimendo un plasmide migliorato luciferasi di lucciola dal promotore EF-1 α. Topi, 2, 3 e 5 sono stati iniettati anche con 20 µ g del plasmide del reporter fluorescente. (B) dot plot della radianza ottenuta dai topi mostrati in (A). (C e D) Topi sono stati dati o buffer di idrodinamica consegna da solo (C) o microsfere fluorescenti (D) (puntini verdi luminosi) e pEF1α-TdTomato esprimendo il reporter fluorescente rosso TdTomato dal promotore EF-1 α. Tubuli prossimali sono stati macchiati dall'agglutinina di Lotus tetragonolobus (LTA; verde) e cellule trasfettate sono mostrate dopo colorazione con anticorpo anti-RFP per amplificare il segnale di TdTomato (rosso). I nuclei sono macchiati di DAPI (blu). Le immagini mostrate in (C) e (D) sono 13,2 mm x 17,5 mm. barre di errore rappresentano l'errore standard della media. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56324/56324fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Iniezione idrodinamica pelvi renale per Non virali espressione delle proteine nel rene

Questo protocollo descrive un metodo per iniettare DNA plasmidico in rene del mouse tramite la pelvi renale per produrre l'espressione del transgene in particolare nel rene.

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

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Video: Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biologia

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only one-fourth of these patients achieving transplantation, there is a dire need for alternatives for those with failing organs. In order to decrease the harmful consequences of dialysis along with the overall healthcare costs it incurs, active investigation is ongoing in search of alternative solutions to organ transplantation. Implantable tissue-engineered renal cellular constructs are one such feasible approach to replacing lost renal functionality. Here, described for the first time, is the microdissection of murine kidneys for isolation of living corticomedullary renal segments. These segments are capable of rapid incorporation within scaffold-free endothelial-fibroblast constructs which may enable rapid connection with host vasculature once implanted. Adult mouse kidneys were procured from living donors, followed by stereoscope microdissection to obtain renal segments 200 - 300 &#181;m in diameter. Multiple renal constructs were fabricated using primary renal segments harvested from only one kidney. This method demonstrates a procedure which could salvage functional renal tissue from organs that would otherwise be discarded.

Tissue-engineered renal constructs provide a solution for the organ shortage and deleterious effects of dialysis. Here, we describe a protocol to micro dissect murine kidneys for isolation of cortico-medullary segments. These segments are implanted into scaffold-free cellular constructs, forming renal organoids.

Microdissection di segmenti di tessuto renale primario e incorporazione con tecnologia romanzo costrutto senza impalcatura

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Bioingegneria

Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

The administration of drugs for recovery of kidney function requires control of the localization and distribution of the therapeutic compound. Here, we describe in detail a simple technique for intrarenal delivery of drugs in rats. This procedure may be easily performed with no mortality and high reproducibility.

Consegna intravascolare di Biologics al rene di ratto

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage ...

Medicina

Intrarenal Injection of Escherichia coli in a Rat Model of Pyelonephritis

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Intrarenal Injection of Escherichia coli in a Rat Model of Pyelonephritis

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Iniezione intrarenale di<emEscherichia coli</em&gt; In un modello di ratto di pielonefriti

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal ...

Direct Drug Delivery to Kidney via the Renal Artery

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research field. Accumulation of drugs in certain organs may give rise to adverse and unwanted effects, depending on the nature of injectate. To minimize spillover and/or accumulation in other tissues, the herein described method directs the formulation into the renal artery bloodstream by inserting a catheter in the infra renal aorta, just below where it branches into the renal artery, resulting in the kidney as first reached organ and distributing of formulation throughout the kidney.
This manuscript provides a detailed description of the method, as well as its challenges and difficulties. It guides the experimenter to become skillful with this type of microsurgery that requires accuracy under sterile conditions. Speed is crucial for minimizing the ischemia and practicing the procedure will increase the chance of successful injections without adverse effects. By modulating the time between injection and reperfusion as well as the injected volume, the risk of spillover to other organs is mitigated. 
Note that this technique is suitable for single dosing strategies.

This manuscript describes a method for targeted delivery to a single kidney via a catheter placed in the infrarenal abdominal aorta in the mouse.

Consegna diretta di farmaci ai reni attraverso l'arteria renale

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research ...

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by destabilizing and inhibiting their translation in various kidney diseases. Therefore, alternation of miRNA expression by exogenous artificially synthesized miRNA mimics is a potentially useful treatment option for inhibiting the development of many kidney diseases. However, because serum RNAase immediately degrades systematically administered exogenous miRNA mimics in vivo, delivery of miRNA to the kidney remains a challenge. Therefore, vectors that can protect exogenous miRNA mimics from degradation by RNAase and significantly deliver them to the kidney are necessary. Many studies have used viral vectors to deliver exogenous miRNA mimics or inhibitors to the kidney. However, viral vectors may cause an interferon response and/or genetic instability. Therefore, the development of viral vectors is also a hurdle for the clinical use of exogenous miRNA mimics or inhibitors. To overcome these concerns regarding viral vectors, we developed a nonviral vector method to deliver miRNA mimics to the kidney using tail vein injection of polyethylenimine nanoparticles (PEI-NPs), which led to significant overexpression of target miRNAs in several mouse models of kidney disease.

Here, we deliver exogenous artificially synthesized miRNA mimics to the kidney via tail vein injection of a nonviral vector and polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models. This led to significant overexpression of target miRNA in the kidney, resulting in inhibited progression of kidney disease in several mouse models.

Rilascio di miRNA esogeno sintetizzato artificialmente al rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Studiare l'espressione proteica durante lo sviluppo del cristallino di pollo

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of similarity with the human lens. RCAS(A) is a replication-competent chicken retrovirus that infects dividing cells, which serves as a powerful tool to study the in situ expression and function of wild-type and mutant proteins during lens development by microinjection into the empty lumen of lens vesicle at early developmental stages, restricting its action to surrounding proliferating lens cells. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus provides a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Specifically, targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters. In this article, we will briefly overview the steps needed for recombinant retrovirus RCAS(A) preparation, provide a detailed, comprehensive overview of the microinjection procedure, and provide sample results of the technique.

Autore in primo piano: Studio dello sviluppo e della funzione del cristallino attraverso la microiniezione di retrovirus RCAS(A) nel cristallino embrionale di pollo 

This protocol paper describes the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) retrovirus as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development.

Microiniezione di retrovirus RCAS(A) ricombinante nel cristallino embrionale di pollo

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...

Iniezione idrodinamica pelvi renale per Non virali espressione delle proteine nel rene

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

Microdissection di segmenti di tessuto renale primario e incorporazione con tecnologia romanzo costrutto senza impalcatura

Consegna intravascolare di Biologics al rene di ratto

Iniezione intrarenale di

Consegna diretta di farmaci ai reni attraverso l'arteria renale

Rilascio di miRNA esogeno sintetizzato artificialmente al rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

Microiniezione di retrovirus RCAS(A) ricombinante nel cristallino embrionale di pollo

Microiniezione di retrovirus RCAS(A) ricombinante nel cristallino embrionale di pollo