Name: microfluidic dry-spinning and characterization of regenerated silk fibroin fibers
Uploaded: 2017-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers at JoVE.com

Questo lavoro è sponsorizzato dalla National Natural Science Foundation of China (21674018), il National Research di chiave e programma di sviluppo della Cina (2016YFA0201702 /2016YFA0201700) e il "programma di Shuguang" supportato da Shanghai Education Development Fondazione e Shanghai Municipal Education Commission (15SG30), DHU distinto giovane professore programma (A201302), i fondi di ricerca fondamentale per le Università centrale e il progetto 111 (n. 111 / 2 / 04).

Attenzione: si prega di consultare tutte le schede di sicurezza rilevanti prima dell'uso. Molte delle sostanze chimiche utilizzate nella preparazione del modanatura sono acutamente tossici. Si prega di utilizzare dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, camice da laboratorio, pieno lunghezza pantaloni e scarpe chiuse).
 1. filatura di microfluidica di RSF soluzione acquosa <ol><li>Preparazione di RSF acquosa filatura dope 4 , 15 , 16 <ol><li>Sgommatura di baco da seta bozzolo <ol><li>Degum Bombyx mori avvolge due volte in soluzioni acquose del 3 CO 2 Na (0,5% in peso in acqua) a 100 ° C per 30 minuti ciascuno e poi lavare la seta con acqua deionizzata per rimuovere il sericina.</li>
		</ol></li> <li>Dissolvenza del bozzolo del baco da seta degummed <ol><li>asciugare le sete degummed bozzolo in aria; poi si dissolvono le sete degummed bozzolo in soluzione acquosa di LiBr 9,0 M con un rapporto di 01:10 (p/v) a 40 ° C per 2 h. Ad esempio, aggiungere 10 mL LiBr / 1 grammo di seta ( Figura 1a).</li>
		</ol></li> <li>Centrifugazione e filtrazione <ol><li>diluire la soluzione RSF 1,5 volte di acqua deionizzata. Centrifuga e filtro per rimuovere le impurità. Centrifugare la soluzione RSF in flaconi da 250 mL a 4 ° C per 10 min 1,234.8 x g. filtrare la soluzione RSF utilizzando un filtro di 20 µm e una pompa a vuoto. Letto matrimoniale in carta da filtro è preferibile considerare l'effetto di sperimentazione.</li>
		</ol></li> <li>Dialyzing <ol><li>Dializzare la soluzione RSF in acqua deionizzata a 5 ° C per 3 giorni, utilizzando una membrana semipermeabile di cellulosa (MWCO: 14.000 ± 2.000). Il volume totale della soluzione RSF è circa 1 L, caricata in 4 sacchetti di dialisi. Mettere questi sacchetti di dialisi nel secchio, che è riempito con osmosi inversa (RO) di 10 L di acqua deionizzata. 
			Nota: Il valore pH dell'acqua deionizzata dovrebbe essere superiore a 6, per evitare la gelificazione durante il processo di concentrazione. Il pH dell'acqua deionizzata non richiedono regolazione per questo protocollo.</li>
		</ol></li> <li>Concentrazione <ol><li>condensare la soluzione acquosa di RSF 20 wt % di flusso d'aria forzato in soluzione acquosa di 5 ° C. aggiungere 3 M CaCl 2 nella soluzione a concentrazione di Ca 2 + finale; 1,0 mmol/g RSF poi concentrare mediante aria forzata flusso di 38-47 wt %.</li>
			<li>Pesare una goccia della soluzione RSF su un vetrino e poi asciugare per 2 ore in un forno a 105 ° C. 
			Nota: Il peso per cento dei rimanenti solido rispetto al peso della goccia prima di essiccamento è la concentrazione totale di proteine e CaCl 2. La concentrazione di RSF è derivata dopo deduzione della massa di CaCl 2. Almeno quattro ripetute misurazioni sono state effettuate. Nostri studi precedenti hanno mostrato che la concentrazione di Ca 2 + notevolmente influenzato le proprietà reologiche e rotatività delle soluzioni acquose RSF. Nel frattempo, l'aggiunta di Ca 2 + richiesto la limitata formazione di β-foglio e l'aggregazione di RSF 17. In uno stimolante di filatura nativo, CaCl 2 è considerato un ruolo importante durante l'immagazzinaggio di droga per evitare la gelificazione prima della filatura di filatura. 18</li></ol></li></ol></li> <li>preparazione di chip microfluidico 8 , 19 <ol><li>preparando photomask <ol><li>Design micro-canale in un Programma CAD. Stampare il file CAD per produrre una trasparenza ad alta definizione 19.</li>
		</ol></li> <li>Preparando la muffa <ol><li>pulire il vetrino <ol><li>In una cappa chimica, bollire il vetrino nella soluzione mista di acido solforico concentrato e 30 vol % perossido di idrogeno soluzione (10:1) per 20 minuti su una piastra calda. 
				Attenzione: i vapori di acido solforico e perossido di idrogeno sono estremamente tossici.</li>
			</ol></li> <li>Il vetrino di lavaggio <ol><li>lavare il vetrino utilizzando acqua deionizzata e asciugare con azoto ad alta purezza.</li>
			</ol></li> <li>Film di vernice <ol><li>cappotto il photoresist SU-8 su vetrino da un dispositivo di rivestimento su misura con un gap di 100 µm tra la superficie inferiore della barra di rivestimento e la superficie superiore del vetro.</li>
			</ol></li> <li>Rivestimento per rotazione <ol><li>diffondere il photoresist su vetrino per formare una pellicola uniforme utilizzando una macchina a rotazione a 40,3 x g per 30 s. Lo spessore del film uniforme è circa 85 µm.</li>
			</ol></li> <li>Solidificazione <ol><li>solidificare il photoresist in un forno con una programma di controllo di temperatura. Elevare la temperatura da temperatura ambiente a 65 ° C a 2 ° C/min e reggono a 65 ° C per 2 min continua al calore da 65 ° C a 95° C e premuto a 95 ° C per 15 min. Turn off al forno e fresco naturalmente per camera temperatura nel forno.</li>
			</ol></li> <li>Ultravioletto luce esposizione <ol><li>esporre il lato del vetro scivolare con il photoresist a luce ultravioletta per 12 s utilizzando la trasparenza come un photomask di fotolitografia 19. 
				Nota: Il numero d'onda della luce ultravioletta è 365 nm e l'energia di esposizione è 273.6 mJ/cm 2. 
				Attenzione: Prendere misure di sicurezza adeguate mentre si lavora con luce UV e il forno.</li>
			</ol></li> <li>Solidificare il photoresist come descritto nel passaggio 1.2.2.5.</li>
			<li>In via di sviluppo <ol><li>pulire il photoresist con ultrasuoni nella soluzione di sviluppatore per 30 s. lavare il vetrino da isopropanolo e sviluppatore, alternando tra i due, finché non ci sarà nessuna precipitazione sul vetrino.</li>
			</ol></li> <li>Solidificare il photoresist in un forno con una programma di controllo di temperatura. Elevare la temperatura da temperatura ambiente a 170 ° C a 2 ° C/min e premuto a 170 ° C per 30 min. Turn off al forno e fresco naturalmente a temperatura ambiente in forno.</li>
		</ol></li> <li>Litografia soft <ol><li>versare 8.8 pre-polimero di g liquido polidimetilsilossano (PDMS) sopra la muffa e la cura a 65 ° C per 30 minuti, e 15 min a 80 pre-polimero di ° C. liquido PDMS è costituito da PDMS e agente indurente (in genere a 10:1 (w/w)).</li>
		</ol></li> <li>Boxe <ol><li>fare un buco attraverso la replica PDMS all'inizio del canale di drill. Il diametro della punta è di 1,2 mm.</li>
		</ol></li> <li>Tenuta <ol><li>sigillare la replica PDMS con il canale da uno strato PDMS piatto senza motivo di un trattamento al plasma di ossigeno sulle superfici dei due strati PDMS. 
			Nota: Il processo di preparazione complessiva del chip richiede circa 72 h.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Fabbricazione di RSF fibra <ol><li>iniezione di filatura dope <ol><li>iniettare il RSF filatura dope in microchannel a 2 µ l/min di una pompa a siringa.</li>
		</ol></li> <li>Regolamento ambiente <ol><li>regolare l'umidità relativa di 40 ± 5% RH o 50 ± 5% RH utilizzando un umidificatore. A 40 RH di ± 5%, come filato fibra solidificato più velocemente di 50 ± 5% RH.</li>
		</ol></li> <li>Fibra di produzione di RSF <ol><li>toccare la goccia RSF un Pinpoint allo sbocco del canale microfluidica, disegnare fibra di RSF nell'aria e quindi la bobina esso su un rullo attraverso un'intercapedine d'aria di 10 cm ad una velocità di 3 cm/s ( Figura 1b ).</li>
		</ol></li> <li>Memorizzare le fibre RSF in un essiccatore sigillato per 24 h.</li>
		<li>Post-trattamento della fibra <ol><li>disegnare le fibre come filato 4 volte a 0,9 mm s -1 in 80 vol % etanolol di soluzione di una macchina su misura e quindi mantenere la fibra disegnata fisso e immergere le fibre nella soluzione per 1 h. A causa di questo trattamento, la lunghezza della fibra è stata cambiata da originariamente 15 mm a 60 mm.</li>
		</ol></li> <li>Preparazione del campione per la caratterizzazione <ol><li>fissare le fibre post-trattate su un telaio di carta con una lunghezza di 10mm calibro. Almeno 20 fibre sono necessità di misurazione, compreso nella prova di trazione, SEM, FTIR e WAXS. I diametri della gamma fibre post-disegnato da 5 a 10 µm. Figura 1 Mostra lo schema della fibra produzione e caratterizzazione di WAXD. Le proprietà meccaniche delle fibre RSF sono state esaminate secondo un sistema di prova materiale (25 ± 2) ° C e (45 ± 5) % di umidità relativa. L'estensione votare e calibro lunghezza rispettivamente 2 mm/min e 1cm,.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Radiazione di sincrotrone caratterizzazione di cristallina struttura di RSF fibra <ol><li>radiazione di sincrotrone caratterizzazione 4 , 13 , 17 <ol><li>regolazione della beamline <ol><li>regolare la lunghezza d'onda dei raggi x e dimensione dello spot di 0,07746 nm e 3 x 2 µm 2, rispettivamente. 
			Nota: Il protocollo viene eseguito utilizzando la beamline di BL15U1 presso la Shanghai Synchrotron Radiation Facility.</li>
		</ol></li> <li>Posizione dello spot raggi x <ol><li>trovare la posizione dello spot dei raggi x. 
			Nota: La posizione dello spot dei raggi x è regolata dal tecnico di laboratorio presso l'impianto di radiazione di sincrotrone.</li>
		</ol></li> <li>Test del campione standard: biossido di cerio (CeO 2) <ol><li>un CeO 2 polvere standard del campione di prova. Il CeO 2 polvere è stata caratterizzata per calcolare il centro del cerchio e la distanza tra il campione e il rilevatore.</li>
		</ol></li> <li>Preparazione del campione <ol><li>difficoltà i filamenti RSF in parallelo con l'altro su carta cornice con un calibro di 10 mm di lunghezza. Incollare la cornice di carta sul palco test. 
			Nota: Mantenere la fibra orizzontale.</li>
		</ol></li> <li>SR-WAXD test <ol><li>aprire l'otturatore <ol><li>chiudere lo sportello della stazione beamline dopo aver verificato che non ci siano persone in camera. Aprire l'otturatore della sorgente del fascio di raggi x.</li>
			</ol></li> <li>Messa a fuoco <ol><li>spostare la fibra leggermente fino a quando si è a fuoco. Regolare la posizione della fibra lungo x, y, z senso da remoto tramite un software ( Figura 1C).</li>
			</ol></li> <li>Esposizione di esempio <ol><li>spostare la fibra su e giù in remoto tramite un software, fino a quando non è sul posto dei raggi x. Premere il pulsante start sul software per esporre la fibra per la beamline di raggi x per 20 s ( Figura 1C).</li>
			</ol></li> <li>Sfondo diffrazione <ol><li>la diffrazione dello sfondo aria con il tempo di esposizione di 20 s. mossa la fibra lontano dal luogo di raggi x da remoto tramite un software di prova. Premere il &#34; inizio &#34; pulsante sul software per esporre la beamline di raggi x di &#34; medio di aria &#34; per 20 s.</li>
			</ol></li></ol></li></ol></li> <li>Elaborazione dati SR-WAXD 13 <ol><li>calibrazione Software <ol><li>elaborare i dati WAXD con FIT2D (V12.077). Calibrare il centro del cerchio e la distanza del campione-a-rivelatore utilizzando i dati di diffrazione della polvere CeO 2.</li>
		</ol></li> <li>2-D di diffrazione <ol><li>sottrarre lo sfondo di aria dal pattern di diffrazione della fibra utilizzando FIT2D (V12.077).</li>
		</ol></li> <li>Dimensione cristallinità e cristallite <ol><li>integrare l'intensità di diffrazione in funzione di 2 θ di angolo di scattering. Eseguire deconvoluzione dell'integrazione di intensità di picco automatizzata separazione software (versione 4.12) 12. Il grado di cristallinità, x c, è stato stimato dalla relazione: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56271/56271eq1.jpg" /> , dove ho c è la somma delle intensità integrata le vette cristalline e I un è l'intensità integrata dei amorfo halo 4 , 11. L'integrazione dei modelli di WAXD ha mostrato la larghezza del picco del [200], [020], [002] riflessioni. La FWHM di questi picchi sono stati utilizzati per determinare le dimensioni dei cristalliti lungo la a, b e c assi utilizzando Scherrer &#39; s formula 4.</li>
		</ol></li> <li>Determinazione degli orientamenti dei cristalliti <ol><li>calcolare gli orientamenti del cristallite e amorfo secondo azimuthal integrazioni di (020) e (210) picchi 11. L'orientamento cristallina può essere calcolato quantitativamente secondo Herman &#39; orientamento s. Qui, entrambi (020) e (210) cime erano dotati di due funzioni gaussiane. Il più stretto è per orientamento cristallina e l'altro più ampio è per il materiale amorfo orientato 13. Qui, gli orientamenti di cristalliti di fibre RSF sono stati confrontati utilizzando l'intera larghezza a metà altezza (FWHM) dei picchi di integrazioni azimutale (002).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Asakura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+the+structure+and+function+of+the+spinning+apparatus+in+the+silkworm+Bombyx+mori.">Some observations on the structure and function of the spinning apparatus in the silkworm Bombyx mori.</a> Biomacromolecules. 8 (1), 175-181 (2007).</li><li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+crystalline+spinning+of+spider+silk.">Liquid crystalline spinning of spider silk.</a> Nature. 410 (6828), 541-548 (2001).</li><li>Zhou, G. Q., Shao, Z. Z., Knight, D. P., Yan, J. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Durante la dialisi della soluzione RSF, il valore del pH è fondamentale per il processo di concentrazione seguente. Se il valore del pH dell'acqua deionizzata è minore di 6, è possibile che la soluzione RSF sarà più facile per gel durante il processo di concentrazione. Per evitare la gelificazione, CaCl2 viene aggiunto alla soluzione di RSF. La concentrazione di CaCl2 è 1 mmol / peso di RSF.
Il nostro lavoro precedente dimostrato la possibilità di microfluidica filatura a secco di una soluzione acquosa di RSF8. La geometria del canale microfluidico era una funzione esponenziale di monostadio semplificata. Per spider e del baco da seta, filatura dopes erano sorteggio giù attraverso un condotto di filatura di due fasi di regressione esponenziale prima fibra formazione1,20. Qui, la geometria del canale microfluidico è stata progettata da che imita la seconda funzione di decadimento esponenziale ordine del baco da seta filatura del condotto1. La larghezza del canale microﬂuidic diminuisce da una larghezza iniziale di 2.065 µm alla larghezza terminale di 265 µm, e la lunghezza del canale allungamento è 21,5 mm. Nel precedente articolo, il diametro della fibra RSF disegnato era 2 µm. Così, un fascio di fili RSF ha dovuto essere usato per la prova meccanica e la struttura caratterizzazione8.
L'esperimento dimostra che RSF concentrazione e umidità influenzano il diametro e la microstruttura delle fibre RSF nel processo di filatura a secco. La fibra RSF filata a 40% RH Mostra un diametro più grande e più strutture cristalline della fibra filata a 50% RH di. Tuttavia, la fibra filata a 50% RH ha un maggiore orientamento cristallino quello che filate ad 40% RH. I risultati potrebbero essere correlati a tassi di evaporazione di acqua a diversa umidità. Un più alto tasso di evaporazione di acqua a 40% RH migliora le interazioni intramolecolari e facilita la transizione di fase veloce di seta fibroin dal sol-gel di fibra di seta tinta. Un minor tasso di evaporazione di acqua a 50% RH conduce ad un più elevato contenuto di acqua residua nella fibra solidificata. Come un piccolo lubrificante molecolare, l'acqua facilita l'orientamento di seta fibroin e rende la fibra parzialmente solidificata di essere allungato per fibre più fini. Questo processo ci aiuta a capire come acqua influenza la formazione di fibre di seta durante il processo di filatura nativo.
Le proprietà meccaniche delle fibre post-trattati di RSF sono migliori di quelli di sete degummed4. Dopo il post-trattamento, crystallinities delle fibre sono stati aumentati drasticamente. La FWHM della fibra post-trattato RSF è inferiore a quella della fibra come filata. Indica che il post-trattamento migliora l'orientamento dei cristalliti lungo l'asse della fibra. Tuttavia, la complessità del processo di post-trattamento limita la produzione di massa delle RSF fibre ad alta resistenza.
Rispetto ad una filiera convenzionale, il canale di microfluidica è adatto per imitare la geometria di una ghiandola di seta naturale. Nel frattempo, la filatura di microfluidica fu usata per produrre la seta del ragno ricombinante con eccellenti qualità meccaniche9. Sezioni di taglio ed elongazionale sono state integrate nel chip microfluidici filatura per indurre il montaggio e l'orientamento delle molecole proteiche e fibrille. Di conseguenza, la filatura di microfluidica è promettente in produzione di sete animale ad alte prestazioni, come pure altre fibre sintetiche dalla soluzione. Tuttavia, il metodo di filatura di microfluidica possa produrre solo singoli filamenti e non può permettersi di elevata produzione di fibre artificiali.

Ragno e bachi da seta possono produrre eccezionale fibra di seta dalla soluzione proteica acquosa a temperatura ambiente e pressione. Tosatura ed estensionale flusso può indurre la formazione di cristalli liquidi texture nella ghiandola di seta1. Negli ultimi anni, c'è stato un grande interesse che imita il processo di filatura del ragno per produrre fibre artificiali ad alta resistenza. Tuttavia, grandi quantità di proteine della seta di ragno non può essere prodotto in modo efficiente ed economicamente da allevamento ragni a causa di cannibalismo. Notevoli quantità di seta del baco da seta possono essere ottenuti facilmente dall'agricoltura. In caso contrario, il baco da seta e ragno hanno una composizione simile di processo e dell'amminoacido di filatura. Di conseguenza, seta fibroin baco da seta è selezionato come un sostituto per filare la seta artificiale animale da molti ricercatori.
Ragno e baco da seta è possibile estrudere soluzione proteica attraverso loro condotto di filatura in fibra in aria. Le forze elevate sollecitazioni generate lungo il condotto di filatura più probabile allungare le molecole di seta fibroin per un più esteso di conformazione2. Seta artificiale fibre sono state filate utilizzando convenzionale filatura umido e a secco-filatura processi3,4, che non tengono in conto le forze fluide generate nel dotto di filatura.
In primo luogo, microfluidica approcci sono stati utilizzati per indagare l'assemblaggio di proteine della seta5,6. Quindi, fabbricazione di microfluidica di RSF è stata studiata tramite modellazione la cesoiatura ed estensionale forze7,8. Modulo di Young e diametro delle fibre RSF può essere sintonizzati di microfluidica filatura bagnata, ma la resistenza alla trazione di drawn fibra era inferiore a 100 MPa7. Infine, fibre ad alta resistenza RSF con successo sono stati preparati utilizzando il metodo di filatura a secco di microfluidica, ma il diametro della fibra è solo 2 µm8. Recentemente, filatura bagnata microfluidica è stata utilizzata con successo nella produzione di fibra di seta di ragno ricombinante ad alta resistenza. Il disegno di post-filatura in aria migliorato i difetti di superficie e interni di fibra artificiale9.
In questo studio, sono stato introdotto il microfluidici migliorato processo per fibra di RSF di filatura. Esso mira a imitare il processo di filatura della seta del baco da seta, tra cui la droga di filatura, tosatura delle forze e il processo di filatura a secco. Questo metodo di filatura non solo può produrre fibra di seta artificiale ad alta resistenza, ma anche possibile regolare il diametro della fibra. In primo luogo, il RSF dope di filatura è stato tosato e allungata in un canale di biomimic con un decadimento esponenziale di secondo ordine. In secondo luogo, le influenze di umidità relativa (RH) sulla morfologia delle fibre e le proprietà sono state studiate nel processo di filatura a secco microfluidici10. Rispetto per la filiera di filatura convenzionale, il nostro sistema di microfluidica è altamente biomimetici e può essere utilizzato per produrre fibre ad alta resistenza da soluzioni a temperatura ambiente da asciutto o bagnato metodo di filatura.
Dovuto l'alta risoluzione, ad alta luminosità, ad alta energia di microfocus la radiazione di sincrotrone a raggi x, può essere utilizzato per caratterizzare la microstruttura di una singola fibra con un diametro di parecchi micrometri4,11 , 12 , 13 , 14. qui, SR-WAXD tecnica è stata usata per calcolare la cristallinità, dimensione del cristallite e cristallina orientamento delle fibre RSF.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;B. mori&lt;/em&gt; Cocoons</td><td>Farmer in Tongxiang, Zhejiang Province, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium carbonate, anhydrous, 99.8%</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Lithium bromide, 99.1%</td><td>Shanghai China Lithium Industrial Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous, 96.0%</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous, 99.7%</td><td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co.,Ltd., China</td><td>10009218</td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>MicroChem Corp., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Developing solution</td><td>MicroChem Corp., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Concentrated sulfuric acid</td><td>Pinghu Chemical Reagent Factory, China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>30 vol% hydrogen peroxide</td><td>Shanghai Jinlu Chemical reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Shanghai Zhengxing Chemical Reagent Factory, China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Oxygen plasma treatment</td><td>DT-01, Suzhou Omega Machinery Electronic Technology Co., Ltd., China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>&amp;nbsp;KD Scientific, USA</td><td></td><td>KDS 200P</td></tr><tr><td>Humidifier</td><td>SEN electric</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Driller</td><td>Hangzhou Bo Yang Machinery Co., Ltd., China</td><td></td><td>bench drilling machine Z406c</td></tr><tr><td>Material testing system</td><td>Instron, USA</td><td></td><td>Model: 5565</td></tr><tr><td>PeakFit</td><td>Systat Software, Inc., USA</td><td></td><td>Version 4.12</td></tr></tbody></table>

microfluidic dry-spinning and characterization of regenerated silk fibroin fibers

Il protocollo viene illustrato un metodo per che imita il processo di filatura del baco da seta. Nel processo di filatura nativo, il dotto di filatura contraenti consente le proteine della seta essere compatto e ordinato dalle forze di taglio e di allungamento. Qui, un canale di microfluidica biomimetici è stato progettato per imitare la geometria specifica del dotto di filatura del baco da seta. Filatura rigenerato seta fibroin (RSF) drogato con alta concentrazione, si è sporto attraverso il microchannel a fibre a secco-spin a temperatura e pressione ambiente. Nel processo di post-trattamento, le fibre come filata erano disegnate e memorizzate in soluzione acquosa di etanolo. Radiazione di sincrotrone grandangolare diffrazione di raggi x (SR-WAXD) tecnologia utilizzata per studiare la microstruttura delle singole fibre RSF, che erano fissati ad un supporto del campione con l'asse di fibra RSF normale microbeam dei raggi x. La cristallinità, dimensione del cristallite e cristallina orientamento della fibra sono stati calcolati dai dati WAXD. Gli archi di diffrazione vicino all'equatore del modello bidimensionale WAXD indicano che la fibra post-trattata di RSF ha un grado elevato di orientamento.

Fibre ad alta resistenza RSF sono state prodotte con successo utilizzando il metodo di filatura di microfluidica. Le curve stress-strain e immagini al SEM delle fibre RSF allungate C44R40 sono mostrati nella Figura 2. Almeno 10 fibre sono stati misurati nella prova di trazione. Curve stress-strain sono stati scelti in base al valore medio di rottura stress e tensione delle fibre. I dati WAXD delle fibre sono mostrati nella Figura 3. La cristallinità e l'orientamento cristallino sono stati calcolati secondo i dati WAXD. Per l'indicazione del campione, usiamo C e R a presentare la concentrazione di RSF nella roba di filatura e l'umidità relativa, rispettivamente. Ad esempio, le fibre filata da 44 wt % RSF filatura dope a 40 ± 5% RH è stata designata come C44R40, che era stato post-elaborato con un rapporto di tiraggio di 4. Altre fibre sono stati rinominati come C44R50, C47R40 e C47R50 secondo la stessa descrizione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56271/56271fig1.jpg"> 
Figura 1: Schematica della caratterizzazione di produzione e la struttura del fibra. (un) soluzione di preparazione di RSF, (b) microfluidica processo delle fibre RSF, (c) radiazione di sincrotrone messa a punto sperimentale di singola fibra RSF di filatura. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56271/56271fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56271/56271fig2.jpg"> 
Figura 2: Curve sforzo-deformazione delle fibre post-trattati di RSF. Inserire immagine di SEM di spettacoli di C44R40. Barra della scala = 10 µm. Questa figura è stata modificata da10. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56271/56271fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56271/56271fig3.jpg"> 
Figura 3: dati SR-WAXD di fibre post-trattati di RSF. (A), due modelli di WAXD dimensionale di RSF post-trattati singola fibre: (un) C44R40, (b) C44R50, (c) C47R40, (d), C47R50, e (B) degummed mori b. seta; Dati dimensionali di WAXD (C), uno dei post-trattati fibre di RSF e degummed mori b. seta, che è stato effettuato a picco deconvoluzione in (D). Questa figura è stata modificata da riferimento10. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56271/56271fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

A secco microfluidic-spinning e caratterizzazione delle fibre rigenerate seta Fibroin

Un protocollo per la filatura di microfluidica e caratterizzazione di microstruttura di monofilamento rigenerata seta fibroin è presentato.

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

microfluidic-dry-spinning-characterization-regenerated-silk-fibroin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.7K Views.  Donghua University. Un protocollo per la filatura di microfluidica e caratterizzazione di microstruttura di monofilamento rigenerata seta fibroin è presentato.

Video: Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment 1,2 . These materials are desirable because they possess highly controllable dimensional and material characteristics, are biocompatible and promote cell adhesion, can be modified through topographic patterning or by chemically altering the surface, and can be used as a depot for biologically active molecules for drug delivery related applications 3-8 . In addition, silk films are relatively straightforward to custom design, can be designed to dissolve within minutes or degrade over years in vitro or in vivo, and are produce with the added benefit of being transparent in nature and therefore highly suitable for imaging applications 9-13. The culture system methodology presented here represents a scalable approach for rapid assessments of cell-silk film surface interactions. Of particular interest is the use of surface patterned silk films to study differences in cell proliferation and responses of cells for alignment 12,14 . The seeded cultures were cultured on both micro-patterned and flat silk film substrates, and then assessed through time-lapse phase-contrast imaging, scanning electron microscopy, and biochemical assessment of metabolic activity and nucleic acid content. In summary, the silk film in vitro culture system offers a customizable experimental setup suitable to the study of cell-surface interactions on a biomaterial substrate, which can then be optimized and then translated to in vivo models. Observations using the culture system presented here are currently being used to aid in applications ranging from basic cell interactions to medical device design, and thus are relevant to a broad range of biomedical fields.

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are a novel class of biomaterials readily customizable for an array of biomedical applications. The presented silk film culture system is highly adaptable to a variety of in vitro analyses. This system represents a biomaterial design platform offering in vitro optimization before direct translation to in vivo models.

Seta Film per la cultura del sistema In vitro Analisi e Progettazione Biomaterial

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Ricerca

Bioingegneria

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.

Despite the outstanding mechanical and biochemical properties of spider silks, this material cannot be harvested in large quantities by conventional means. Here we describe an efficient strategy to spin artificial spider silk fibers, which is an important process for investigators studying spider silk production and their use as next-generation biomaterials.

Sintetico di produzione Spider Silk su scala di laboratorio

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Air Filter Devices Including Nonwoven Meshes of Electrospun Recombinant Spider Silk Proteins

Based on the natural sequence of Araneus diadematus Fibroin 4 (ADF4), the recombinant spider silk protein eADF4(C16) has been engineered. This highly repetitive protein has a molecular weight of 48kDa and is soluble in different solvents (hexafluoroisopropanol (HFIP), formic acid and aqueous buffers). eADF4(C16) provides a high potential for various technical applications when processed into morphologies such as films, capsules, particles, hydrogels, coatings, fibers and nonwoven meshes. Due to their chemical stability and controlled morphology, the latter can be used to improve filter materials. In this protocol, we present a procedure to enhance the efficiency of different air filter devices, by deposition of nonwoven meshes of electrospun recombinant spider silk proteins. Electrospinning of eADF4(C16) dissolved in HFIP results in smooth fibers. Variation of the protein concentration (5-25% w/v) results in different fiber diameters (80-1,100 nm) and thus pore sizes of the nonwoven mesh.
Post-treatment of eADF4(C16) electrospun from HFIP is necessary since the protein displays a predominantly &alpha;-helical secondary structure in freshly spun fibers, and therefore the fibers are water soluble. Subsequent treatment with ethanol vapor induces formation of water resistant, stable &beta;-sheet structures, preserving the morphology of the silk fibers and meshes. Secondary structure analysis was performed using Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and subsequent Fourier self-deconvolution (FSD).
The primary goal was to improve the filter efficiency of existing filter substrates by adding silk nonwoven layers on top. To evaluate the influence of electrospinning duration and thus nonwoven layer thickness on the filter efficiency, we performed air permeability tests in combination with particle deposition measurements. The experiments were carried out according to standard protocols.

Spider silk fibers display extraordinary mechanical properties. Engineered Araneus diadematus Fibroin 4 (eADF4) can be processed into nonwoven meshes using electrospinning. Here, the eADF4 nonwoven meshes are used to improve the performance of air filtering devices.

Filtro aria dispositivi tra cui maglie non tessuti di elettrofilate ricombinanti Spider Proteine ​​della Seta

Based on the natural sequence of Araneus diadematus Fibroin 4 (ADF4), the recombinant spider silk protein eADF4(C16) has been engineered. This highly ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

Progettazione di materiali in lega di proteine ​​della seta-seta per le applicazioni biomediche

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

Reactive Inkjet Printing and Propulsion Analysis of Silk-based Self-propelled Micro-stirrers

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The resulting devices are an example of self-propelled objects capable of generating motion without external actuation and have potential applications in medicine and environmental sciences for a variety of purposes ranging from micro-stirring, targeted therapeutic delivery, to water remediation (e.g., cleaning oil spills). This method employs reactive inkjet printing to generate well-defined small-scale solid silk structures by converting water soluble regenerated silk fibroin (silk I) to insoluble silk fibroin (silk II). These structures are also selectively doped in specific regions with the enzyme catalase in order to produce motion via bubble generation and detachment. The number of layers printed determines the three-dimensional (3D) structure of the device, and so here the effect of this parameter on the propulsive trajectories is reported. The results demonstrate the ability to tune the motion by varying the dimensions of the printed structures.

This protocol demonstrates the ability to utilize reactive inkjet printing to print self-motile biocompatible and environmentally friendly micro-stirrers for use in biomedical and environmental applications.

Stampa a getto d'inchiostro reattiva e analisi di propulsione di micro-agitatori semoventi a base di seta

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The ...

Chimica

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order to reproduce the remarkable mechanical properties of spider silks, they must be produced in heterologous hosts as spiders are both territorial and cannibalistic. The synthetic analogs of spider silk also tend to be insoluble in aqueous solutions. Thus, a large percentage of research in recombinant spider silks rely upon organic solvents that are detrimental to large scale production of materials. Our group&#8217;s method forces the solvation of these recombinant spider silks into water. Remarkably, when these proteins are prepared using this method of heat and pressure, a wide range of material forms can be prepared from the same solution of recombinant spider silk proteins (rSSp) including: films, fibers, sponge, hydrogel, lyogel, and adhesives. This article demonstrates the production of the solvated rSSp and material forms in a manner that is more easily understood than from written materials and methods alone.

Here, we present a protocol to produce water soluble recombinant spider silk protein solutions and the material forms that can be formed from those solutions.

Formazione del materiale di sete di ragno ricombinante attraverso la Solvazione acquosa utilizzando calore e pressione

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

Procedure for Fabricating Biofunctional Nanofibers

Electrospinning is an effective processing method for preparing nanofibers decorated with functional groups. Nanofibers decorated with functional groups may be utilized to study material-biomarker interactions i.e. act as biosensors with potential as single molecule detectors. We have developed an effective approach for preparing functional polymers where the functionality has the capacity of specifically binding with a model protein. In our model system, the functional group is 2,4-dinitrophenyl (DNP) and the protein is anti-DNP IgE (Immunoglobulin E). The functional polymer, &alpha;,&omega;-bi[2,4-dinitrophenyl caproic][poly(ethylene oxide)-b-poly(2-methoxystyrene)-b-poly(ethylene oxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP), is prepared by anionic living polymerization. The difunctional initiator utilized in the polymerization was prepared by electron transfer reaction of &alpha;-methylstyrene and potassium (mirror) metal. The 2-methoxystyrene monomer was added first to the initiator, followed by the addition of the second monomer, ethylene oxide, and finally the living polymer was terminated by methanol. The &alpha;,&omega;-dihydroxyl polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] was reacted with N-2,4-DNP-&isin;-amino caproic acid, by DCC coupling, resulting in the formation of &alpha;,&omega;-bi[2,4-dinitrophenylcaproic][poly(ethyleneoxide)-b-poly(2-methoxystyrene)-b-poly(ethylene oxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). The polymers were characterized by FT-IR, 1H NMR and Gel Permeation Chromatography (GPC). The molecular weight distributions of the polymers were narrow (1.1-1.2) and polymers with molecular weights greater than 50,000 was used in this study. The polymers were yellow powders and soluble in tetrahydrofuran. A water soluble CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/ DMEG (dimethoxyethylene glycol) complex binds and achieves steady state binding with solution IgE within a few seconds. Higher molecular weight (water insoluble i.e. around 50,000) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP polymers, containing 1% single wall carbon nanotubes (SWCNT) were processed into electroactive nanofibers (100 nm to 500 nm in diameter) on silicon substrate. Fluorescence spectroscopy shows that anti-DNP IgE interacts with the nanofibers by binding with the DNP functional groups decorating the fibers. These observations suggest that appropriately functionalized nanofibers hold promise for developing biomarker detection device.

An efficient approach for preparing nanofibers decorated with functional groups capable of specifically interacting with proteins is described. The approach first requires the preparation of a polymer functionalized with the appropriate functional group. The functional polymer is fabricated into nanofibers by electrospinning. The effectiveness of the binding of the nanofibers with a protein is studied by confocal microscopy.

Procedimento per la realizzazione di nanofibre Biofunzionali

Electrospinning is an effective processing method for preparing nanofibers decorated with functional groups. Nanofibers decorated with functional groups ...

Biologia

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical methods for manipulating and monitoring the activity of neurons in vivo. These types of experiments rely on two main components: 1) implantable devices that provide optical access to the brain, and 2) light-sensitive proteins that change neuronal excitability or provide a readout of neuronal activity. There are a number of ways to express light-sensitive proteins, but stereotaxic injection of viral vectors is currently the most flexible approach because expression can be controlled with genetic, anatomical, and temporal precision. Despite the great utility of viral vectors, delivering the virus to the site of optical implants poses numerous challenges. Stereotaxic virus injections are demanding surgeries that increase surgical time, increase the cost of studies, and pose a risk to the animal's health. The surrounding tissue can be physically damaged by the injection syringe, and by immunogenic inflammation caused by the abrupt delivery of a bolus of high-titer virus. Aligning injections with optical implants is especially difficult when targeting small regions deep in the brain. To overcome these challenges, we describe a method for coating multiple types of optical implants with films composed of silk fibroin and Adeno-associated viral (AAV) vectors. Fibroin, a polymer derived from the cocoon of Bombyx mori, can encapsulate and protect biomolecules and can be processed into forms ranging from soluble films to ceramics. When implanted into the brain, silk/AAV coatings release virus at the interface between optical elements and the surrounding brain, driving expression precisely where it is needed. This method is easily implemented and promises to greatly facilitate in vivo studies of neural circuit function.

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Here, we present a method for delivering viral expression vectors into the brain using silk fibroin films. This method allows targeted delivery of expression vectors using silk/AAV coated optical fibers, tapered optical fibers, and cranial windows.

In Vivo Mirati espressione delle proteine di optogenetica utilizzando seta/AAV film

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Neuroscienze

<meta charset="utf8"></head><body>Formazione e fissaggio di membrane FN-Silk agli inserti di coltura cellulare

Nanofibrillar Basement Membrane Mimic Made of Recombinant Functionalized Spider Silk in Custom-Made Tissue Culture Inserts

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using tissue culture inserts with a plastic membrane, which generates an apical and a basal side. Besides providing support for the cells, these membranes come far from emulating their native counterpart, the basement membrane, which is a nanofibrillar, protein-based matrix. In this work, we show a simple way to considerably improve the biological relevance of the tissue culture inserts by replacing the plastic membrane with one made from a pure recombinant functionalized spider silk protein. The silk membrane forms through self-assembly and will spontaneously adhere to a membrane-free tissue culture insert, where it can provide support for cells. Custom-designed tissue culture inserts can be printed using a standard 3D printer, following the instructions provided in the protocol, or commercial ones can be purchased and used instead. This protocol shows how the culture system with silk membranes in inserts is set up and, subsequently, how the same cell culturing techniques that are used with traditional, commercially available inserts can be implemented.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Miglioramento dei modelli di coltura cellulare in vitro con membrane di seta di ragno funzionalizzate ricombinanti

Tissue culture inserts with plastic membranes are the golden standard in cell culture labs as permeable supports to establish cell layers and models of barrier tissues. Herein, we present a simple method to replace the plastic membrane with a more biologically relevant membrane made from a recombinant functionalized spider silk protein.

Mimic della membrana basale nanofibrillare in seta di ragno funzionalizzata ricombinante in inserti di coltura tissutale su misura

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using ...

A secco microfluidic-spinning e caratterizzazione delle fibre rigenerate seta Fibroin

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Seta Film per la cultura del sistema In vitro Analisi e Progettazione Biomaterial

Sintetico di produzione Spider Silk su scala di laboratorio

Filtro aria dispositivi tra cui maglie non tessuti di elettrofilate ricombinanti Spider Proteine della Seta

Progettazione di materiali in lega di proteine della seta-seta per le applicazioni biomediche

Stampa a getto d'inchiostro reattiva e analisi di propulsione di micro-agitatori semoventi a base di seta

Formazione del materiale di sete di ragno ricombinante attraverso la Solvazione acquosa utilizzando calore e pressione

Procedimento per la realizzazione di nanofibre Biofunzionali

In Vivo Mirati espressione delle proteine di optogenetica utilizzando seta/AAV film

Mimic della membrana basale nanofibrillare in seta di ragno funzionalizzata ricombinante in inserti di coltura tissutale su misura

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