Name: easy manipulation of architectures in protein-based hydrogels for cell culture applications
Uploaded: 2017-08-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications at JoVE.com

Gli autori vorrei ringraziare Stiftung di Baden-Württemberg per il loro sostegno finanziario nel quadro "Sintesi di materiali bioinalati" (biostuoie-14).

1. idrogel preparazione
<ol>
	<li>Mescolare 200 mg di BSA con 1 mL di deionizzata di H2O di creare 20% (p/v) BSA stock (stock soluzione A).</li>
	<li>Mix 165 µ l di soluzione di THPC (134 mg/mL) con 4,835 mL di acqua deionizzata per creare THPC soluzione (soluzione B).</li>
	<li>Pesare 1 mg di KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) peptide (o un equivalente peptide di cella-adesivo) e diluirlo in 100 µ l di sterile di H2O per ottenere una soluzione di 10 mg/mL (soluzione C). Nota: Questo passaggio è facoltativo e deve solo essere incluso se l'idrogel è destinato per applicazione di cultura cellulare.</li>
	<li>Rimuovere il fondo di una piastra a 96 pozzetti e sostituirlo con involucro di plastica rimovibile. Nota: Per le piastre usate qui, il fondo può essere facilmente rimosso applicando pressione sul fondo di ciascun pozzetto; il fondo in plastica sottile cadrà semplicemente.</li>
	<li>Mix 100 µ l di soluzione madre di BSA (A) e 100 µ l di THPC stock soluzione (B) (opzionale: 4 µ l di soluzione madre C per idrogeli funzionalizzati, cella-adesivo) nella piastra 96 pozzetti per ottenere 200 µ l di idrogel. Miscelare i componenti pipettando su e giù, almeno 5 volte a garantire un uniforme idrogel dopo la polimerizzazione.</li>
	<li>Posizionare la piastra a 96 pozzetti a temperatura ambiente (TA) per circa 10 minuti fino a quando tutti gli idrogeli correttamente sono polimerizzati.</li>
	<li>Togliere lentamente ed attentamente l'involucro di plastica dalla parte inferiore della piastra.</li>
	<li>Premere nel caso degli idrogeli fuori la piastra a 96 pozzetti utilizzando un piccolo timbro e trasferirli in provette da 1,5 mL con PBS sterile, pH 7,4. Nota: Nel caso degli idrogeli hanno una forma cilindrica, con un diametro di circa 4 mm e un'altezza di 8 mm.</li>
	<li>Conservare nel caso degli idrogeli in tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C per fino a parecchi mesi.</li>
</ol>
2. nel caso degli idrogeli di liofilizzazione
<ol>
	<li>Riempire le provette da 1,5 mL con 500 µ l di sterile deionizzata H2O e rimuovere il tappo. Trasferire nel caso degli idrogeli le provette di reazione da 1,5 mL con una spatola.</li>
	<li>Avvolgere le provette da 1,5 mL strettamente con paraffina pellicola-presso almeno tre strati per ogni flaconcino. Utilizzare un ago per forare piccoli fori nella pellicola per consentire il rilascio di gas dal tubo.</li>
	<li>Passare a una delle seguenti operazioni:
	<ol>
		<li>Trasferire il flaconcino di soluzione di azoto liquido per 5 min garantire che l'acqua e idrogel congelare completamente. Immediatamente dopo la rimozione dell'azoto liquido, è possibile trasferire le fiale per il congelamento essiccatore per impedire al materiale di scongelamento. Nota: Questa procedura comporta nei pori circa 10-15 µm nel raggio.</li>
		<li>Conservare i flaconcini a-20 ° C durante la notte per congelare lentamente nel caso degli idrogeli. Immediatamente dopo la rimozione da-20 ° C, è possibile trasferire le fiale per il congelamento essiccatore per impedire al materiale di scongelamento. Nota: Questa procedura comporta nei pori circa 50-60 µm nel raggio.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dopo 24 h (e la completa evaporazione dell'acqua nei pressi dell'idrogel), scongelare il materiale rimuovendolo dal freeze dryer. Nota: Le dimensioni dei pori possono essere analizzate con laser confocale microscopia (passaggio 5, "Idrogel Visualization").</li>
</ol>
3. particelle lisciviazione
<ol>
	<li>Preparare l'idrogel come descritto ai punti 1.1-1.5.</li>
	<li>Subito dopo la miscelazione dei componenti, aggiungere NaCl fino a saturazione si verifica (36 mg/mL). Aggiungere il sale fino a quando un cristallo di sale può essere visto nella soluzione come un precipitato bianco.</li>
	<li>Trasferire la piastra a 96 pozzetti a uno shaker e agitare fino a quando la polimerizzazione avviene (circa 10 min). Rimuovere gli idrogeli dalla piastra, come descritto nei passaggi 1.7-1.8.</li>
	<li>Incubare l'idrogel per almeno 24 h a RT in acqua sterile su un agitatore (20 giri) per eluire tutto sale dal modello idrogel. Memorizzare nel caso degli idrogeli a 4 ° C in PBS per fino a parecchi mesi.</li>
</ol>
4. canale formazione
<ol>
	<li>Preparare gli idrogel come descritto nel passaggio 1. Rimuovere un idrogel da soluzione utilizzando una pinza, rimuovere l'acqua in eccesso con carta assorbente e posizionarlo sulla cima di un blocco di ghiaccio secco.</li>
	<li>Congelare l'idrogel per 30 s e rimuoverlo con cautela dal blocco. Non danneggiare l'idrogel; con attenzione è possibile utilizzare una spatola per togliere il blocco. Trasferire l'idrogel in una provetta da 1,5 mL e asciugare per una notte a 37 ° C.</li>
</ol>
5. idrogel Visualization
<ol>
	<li>Preparare una soluzione stock di Rodamina B diluendo 1 mg di Rodamina B in 10 mL di PBS. Preparare una diluizione seriale diluendo la soluzione di riserva di rodamina in PBS, fino a raggiunta una concentrazione di 0,001 mg/mL (fattore di diluizione: 100)</li>
	<li>Rimuovere l'idrogel dalla soluzione di archiviazione (ad esempio, dal passaggio 2.4.) e trasferirlo in una provetta da 1,5 mL con 1 mL di soluzione di Rodamina B 0,01 mg/mL. Macchia l'idrogel pernottamento in soluzione di Rodamina B a TA.</li>
	<li>Il giorno successivo, trasferire l'idrogel che deve essere visualizzato a 10 mL di PBS (pH 7,4) e lavare per almeno 3 ore.</li>
	<li>Trasferire l'idrogel in una µ-diapositiva 8 bene e coprire con PBS.</li>
	<li>Tagliare piccole sezioni fuori l'idrogel (circa 0,5 mm di altezza) con una lama.</li>
	<li>Utilizzando un laser confocale a scansione microscopio, visualizzare l'idrogel ad una lunghezza d'onda di 514 nm (obiettivo: CE Plan-Neofluar 40 x / 1.30 olio DIC M27, modalità di scansione piano: 514 nm e zoom: 1 X).</li>
</ol>
6. cella cultura fattibilità
<ol>
	<li>Sterile-filtro tutti magazzino soluzioni (A, B e C) con un filtro da 0,45 µm.</li>
	<li>Preparare l'idrogel come descritto ai punti 1.1-1.4, inclusi il peptide di cella-adesivo prima della polimerizzazione di idrogel.</li>
	<li>Dopo la miscelazione dei componenti, pipettare immediatamente la miscela in una diapositiva-µ 8 bene fino a quando il fondo è completamente coperto. Nota: Questo passaggio deve essere eseguito rapidamente e direttamente dopo la miscelazione dei componenti, come la polimerizzazione avviene all'interno di minuti nella diapositiva.</li>
	<li>Cellule di adesione di cultura e passaggio per ottenere una sospensione di singola cellula utilizzando tecniche di coltura cellulare standard. Trasferire le cellule in pre-riscaldato, sterile medium di coltura cellulare DMEM completate con siero bovino fetale (FBS, 10% (p/v)), penicillina-streptomicina (1% (p/v)) e la soluzione di aminoacido non essenziale (MEM, 1% (p/v)).</li>
	<li>Contare le celle con un Neubauer contando camera e accuratamente pipetta 200 µ l del numero desiderato di cellule (2 x 105 cellule/cm2) sulla superficie di idrogel.</li>
	<li>Coprire la µ-diapositiva 8 bene con il coperchio e trasferirlo in un incubatore (37 ° C, 5% CO2). Incubare per almeno 4 ore a 37 ° C.</li>
	<li>Dopo almeno 4 h di attaccamento cellulare, lavare le cellule due volte con 200 µ l della coltura delle cellule sterile PBS.</li>
	<li>Fissare le cellule con 200 µ l di formaldeide di 3,7% (v/v) per 10 min a RT e lavare due volte con PBS (~ 200 µ l). Nota: Indossare adeguati dispositivi di protezione personali maneggiare formaldeide.</li>
	<li>Permeabilize le cellule con 200 µ l di 0.1% Triton X per 5 min, lavare due volte con PBS.</li>
	<li>Macchia le celle con falloidina-rodamina mescolando 5 µ l di soluzione metanolica stock con 195 µ l di PBS e aggiungendo alle celle RT. macchia le celle per 20 min al buio. Lavare due volte con PBS.</li>
	<li>Studiare le proprietà di adesione delle cellule usando un microscopio confocale a 514 nm (obiettivo: CE Plan-Neofluar 40 x / 1.30 olio DIC M27, modalità di scansione piano: 514 nm e zoom: 1 X). Analizzare le immagini usando il software adatto (Vedi la Tabella materiali).</li>
</ol>
7. idrogel proprietà
<ol>
	<li>Rapporto di gonfiore.
	<ol>
		<li>Asciugare completamente l'idrogel a 37 ° C per almeno un giorno.</li>
		<li>Pesare ogni idrogel e annotare il peso esatto.</li>
		<li>Riempire una provetta di reazione di 2 mL con 1,5 mL di PBS.</li>
		<li>Trasferire l'idrogel in questo tubo di reazione di 2 mL e immergere completamente in PBS.</li>
		<li>Lasciare l'idrogel per almeno due giorni in PBS a RT per raggiungere un equilibrio con il PBS.</li>
		<li>Dopo tre giorni, è necessario rimuovere l'idrogel dalla soluzione e asciugarlo con un fazzoletto di carta per rimuovere l'acqua in eccesso dalla superficie idrogel.</li>
		<li>Pesare l'idrogel.</li>
		<li>Calcolare il rapporto gonfiore utilizzando la seguente formula: 
		<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55813/55813eq1.jpg"> dove Wd è il peso del gel essiccato (passo 7.1.2.) e Ws è il peso del gel bagnato (punto 7.1.7). Moltiplica con 100 per ottenere la percentuale di rapporto gonfiore.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>stabilità di temperatura e di pH.
	<ol>
		<li>Trasferire 5 mL di PBS in una provetta di reazione di 15 mL.</li>
		<li>Regolare la soluzione a pH appropriato (ad es., pH 2, 7 o 10) con NaOH e HCl. Bring la soluzione alla temperatura appropriata (ad es., RT, 37 ° C o 80 ° C).</li>
		<li>Trasferire l'idrogel che deve essere studiato per la sua stabilità nella soluzione appropriata. Se necessario, regolare il pH. Nota: Tutti gli idrogeli dovrebbero essere completamente gonfio a questo punto (Vedi il rapporto di gonfiore) per impedire l'errata interpretazione del peso dovuto il gonfiamento del materiale.</li>
		<li>Dopo determinati intervalli di tempo, rimuovere l'idrogel dalla soluzione (ad esempio, ogni ora fino a 2 giorni), asciugarlo con un panno di carta altamente assorbente per rimuovere l'acqua in eccesso e pesarlo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Degradazione enzimatica.
	<ol>
		<li>Preparare una soluzione di enzima stock di 300 U tripsina e pepsina, secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Trasferire l'idrogel (ad es., dal punto 1.8) la soluzione appropriata. Nota: Tutti gli idrogeli dovrebbero essere completamente gonfio a questo punto per evitare l'errata interpretazione del peso.</li>
		<li>Dopo determinati intervalli di tempo, rimuovere l'idrogel dalla soluzione (ad esempio, ogni ora), asciugarlo con un panno di carta altamente assorbente per rimuovere l'acqua in eccesso e pesarlo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics.">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).</li><li>Liu, Y., Chan-Park, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microspheres+leaching+for+scaffold+porosity+control.">Microspheres leaching for scaffold porosity control.</a> J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).</li><li>Whang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Bone+Regeneration+with+Bioabsorbable+Scaffolds+with+Novel+Microarchitecture.">Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture.</a> Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).</li><li>Ziv, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable+silk-alginate+hydrogel+scaffold+for+stem+cell+culture+and+transplantation.">A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation.</a> Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).</li><li>Butruk-Raszeja, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Athrombogenic+hydrogel+coatings+for+medical+devices--Examination+of+biological+properties.">Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices--Examination of biological properties.</a> Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).</li><li>L&#252;, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoresponsive+injectable+hydrogel+for+three-dimensional+cell+culture:+chondroitin+sulfate+bioconjugated+with+poly(N-isopropylacrylamide)+synthesized+by+RAFT+polymerization.">Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization.</a> Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).</li><li>Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+perspectives+in+cell+adhesion:+RGD+and+integrins.">New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins.</a> Science. 238 (4826), 491-497 (1987).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th...

Idrogeli sono materiali che formano reti 3D insolubile in grado di legare grandi quantità di acqua. Tali materiali in grado di fornire ottime condizioni ambientali per le cellule viventi. Attualmente, vi è crescente interesse nella generazione di strutture tridimensionali idrogel e nello sviluppo di processi per adattare i loro proprietà chimiche e fisiche. Una volta che questo è realizzato, un modello per la crescita delle cellule e la manipolazione del comportamento cellulare può essere generato1,2,3,4. Queste strutture 3D non solo creano un ambiente più naturale e realistico che approcci convenzionali bidimensionali, ma loro anche rivelare nuove possibilità per la crescita delle cellule staminali o tumore modelli5. Diversi materiali possiedono una gamma di caratteristiche che dipendono principalmente la dimensione dei pori del gel6. I pori giocano un ruolo cruciale nelle applicazioni della coltura delle cellule, l'ingegneria dei tessuti e la crescita delle cellule staminali diretta. Ad esempio, ossigeno e sostanze nutritive si diffondono attraverso la matrice, e gli importi adeguati devono essere in grado di raggiungere le cellule7. D'altra parte, metaboliti nocivi devono essere rimossi nel minor tempo possibile, e spazio sufficiente per la crescita delle cellule deve essere disponibile7. Di conseguenza, le proprietà del materiale e così la dimensione dei pori, gravemente influenzano le applicazioni potenziali benefici e possibili della matrice. Processi di crescita delle cellule differenti dipendendo le proprietà del materiale, possono verificarsi nella coltura cellulare 3D, compresa la formazione di strutture di un neurone; la crescita e la differenziazione delle cellule della pelle o dell'osso; e la crescita diretta delle linee speciali sulle cellule staminali, come gli epatociti o fibroblasti2,3,8,9,10,11. Un altro punto cruciale che influenzano l'eventuale applicazione di un materiale è la sua stabilità verso stimoli esterni12. Ad esempio, l'idrogel deve mantenere la sua integrità meccanica in terreni di coltura delle cellule o il corpo umano.
Negli ultimi anni, ricerca sul cellulare 3D cultura idrogeli intensificati, e molti studi sono stati effettuati per risolvere le architetture 3D dei sistemi13. Idrogeli composti di componenti chimicamente sintetizzati sono più comunemente studiati perché possono essere facilmente sintetizzati e modificati chimicamente ed esibiscono alta stabilità (Vedi Zhu et al., 2011 per una recensione)5. Tuttavia, le proteine hanno molte proprietà benefiche: come cosiddetto "polimeri di precisione", sono biocompatibili; hanno una lunghezza definita; sono relativamente facili da modificare; e hanno un gran numero di destinazione siti14,15. A questo proposito, le strutture altamente specifiche, innovative possono essere generate per applicazione in molti campi. In questo studio, un idrogel a base di proteine16 è stato utilizzato per dimostrare la capacità dei metodi consolidati per influenzare l'architettura 3D del materiale. Inoltre, la capacità di e l'applicabilità al poro generazione inoltre è stata studiata.
Diverse tecniche sono disponibili per modificare le strutture 3D, inclusi sia metodi semplici e sofisticate, altamente specializzate tecniche provenienti da diversi campi della scienza dei materiali. Una tecnica diffusa è l'uso di elettrofilatura per generare strutture ben definite17. Carica le fibre vengono estratti da una soluzione da un campo elettrico e quindi solidificano sopra l'esposizione all'ossigeno. In questo modo, possono essere prodotte fibre nella gamma di diversi nanometri fino a parecchi micron. Ulteriori tecniche per ottimizzare le dimensioni, la struttura e la distribuzione dei pori all'interno della matrice sono litografia soft, fotolitografia, focalizzazione idrodinamica, electro-spruzzatura e bio-stampa18,19,20. Un notevole svantaggio di queste tecniche è la loro dipendenza specifiche, costose apparecchiature e prodotti chimici speciali o materiali. Inoltre, l'esperienza con queste tecniche spesso non è direttamente trasferibile ai materiali a base di proteine, e molte delle sostanze chimiche e metodi non sono cellulare compatibile.
D'altra parte, molte tecniche non fare affidamento su attrezzature speciali, che li rende più facile e più conveniente di applicare e di riprodurre. Un metodo diffuso per la manipolazione di struttura è colata solvente21,22,23. Le particelle vengono aggiunti prima della reazione di polimerizzazione e sono distribuite in modo omogeneo per saturare la soluzione. Dopo la polimerizzazione, un cambiamento delle circostanze, ad esempio una diluizione o un cambiamento di pH, conduce alla solvatazione delle particelle, mentre i pori rimangono all'interno del materiale. I prodotti chimici usati in queste tecniche, come sale, zucchero, paraffina, gelatina e gesso, sono a buon mercato e facilmente reperibili. Nella liofilizzazione, idrogeli gonfiati sono congelati. La successiva sublimazione delle fasi liquidi sotto vuoto è quindi eseguito23,24,25. Sublimazione di acqua dalla rete è abbastanza delicato per mantenere le strutture 3D specifiche del materiale. Nel gas di schiumatura, una soluzione è in streaming con un gas mentre la polimerizzazione avviene, lasciando i pori all'interno del gel di21. La dimensione e la distribuzione dei pori può essere regolate a seconda del flusso di gas.
Per formare la proteina idrogel, BSA viene fatto reagire con cloruro di tetrachis (idrossimetil) fosfonio (THPC) in una reazione di Mannich-tipo per consentire la formazione di legami covalenti tra le ammine primarie e i gruppi idrossi della molecola del linker quattro braccia26. Eventuali intermedi reattivi nocivi vengono rimossi mediante lavaggio eccessivo del materiale dopo la reazione si verifica.
Questo studio dimostra la possibilità di trattare un materiale a base di BSA con diverse tecniche per manipolare e adattare la dimensione dei pori. Ciascuna delle tecniche può essere utilizzato in qualsiasi laboratorio in tutto il mondo, come nessuna attrezzatura speciale è necessaria. Inoltre, diversi parametri, come rapporto di gonfiore, degradabilità enzimatica, stabilità del pH e la sensibilità di temperatura, esaminati e confrontati tra loro, soprattutto rispettano all'influenza delle diverse tecniche sulla generazione di architetture 3D. Infine, i materiali sono stati funzionalizzati con peptidi di cella-adesivo per indagare la possibile applicazione dei materiali in coltura cellulare. Due linee di cellule di diverso modello sono stati utilizzati: A549 e MCF7.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (high glucose)</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nonessential Amino Acid Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7145-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.05% Phenol Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 99.8%, verg&amp;auml;llt</td><td>&amp;Ouml;lfabrik Schmidt</td><td>2133</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>3854.2</td><td></td></tr><tr><td>THPC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>404861-100ML</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>0.1% Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>Slightly toxic</td></tr><tr><td>Phalloidin-rhodamine&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>3.7% Formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>F8775-25ML</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>2 83.1826.001&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro; slide 8 well</td><td>Ibidi GmbH</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>KCSSGKSRGDS peptide</td><td>UPEP Ulm</td><td>Custom sysnthesis</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 99.8%, verg&amp;auml;llt</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>K928.5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 50 ml&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 1.5 ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,690,001</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 2 ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM</td><td>Greiner</td><td>655073</td><td></td></tr><tr><td>FreezeDryer Epsilon 1-6D,&amp;nbsp;</td><td>Christ, Osterode am Harz, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7</td><td>GSA GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

easy manipulation of architectures in protein-based hydrogels for cell culture applications

Idrogeli sono riconosciuti come materiali promettenti per applicazioni della coltura delle cellule dovuto la loro capacità di fornire ambienti di cellule altamente idratata. Il campo dei modelli 3D è in aumento per la somiglianza potenziale di tali materiali alla matrice extracellulare naturale. Idrogel a base di proteine sono particolarmente promettenti, perché possono facilmente essere funzionalizzati e può raggiungere strutture definite con proprietà fisico-chimiche regolabile. Tuttavia, la produzione di modelli 3D di macroporoso per applicazioni della coltura delle cellule usando materiali naturali è spesso limitata dalla loro proprietà meccaniche più deboli rispetto a quelle dei materiali sintetici. Qui, sono stati valutati diversi metodi per produrre macroporosa albumina di siero bovino (BSA)-sistemi basati su idrogel, con dimensioni dei pori regolabile nel range di 10 a 70 µm nel raggio. Inoltre, è stato stabilito un metodo per generare canali in questo materiale di base di proteine che sono lungo diverse centinaio di micron. I diversi metodi per produrre i pori, come pure l'influenza della dimensione dei pori sulla proprietà del materiale come gonfiore rapporto, pH, stabilità di temperatura e comportamento di degradazione enzimatica, sono stati analizzati. Dimensioni dei pori sono stati studiati nello stato nativo, gonfio di idrogeli mediante microscopia a scansione laser confocale. La fattibilità per applicazioni della coltura delle cellule è stata valutata usando una cella-adesivo RGD peptide modifica del sistema della proteina e di due linee cellulari modello: cellule di cancro al seno umane (A549) e adenocarcinomic alveolare basale epiteliale cellule umane (MCF7).

Hydrogel development has become one of the most prominent fields in material research-related biological studies, with thousands of entries indexed in scientific research archives. Although the behavior of many systems is well studied, the manipulation of 3D networks, especially of sensitive protein-based materials, is often a major issue in material science. Another commonly underestimated challenge is the correct measurement of the native structure of a material using cryo electron micr...

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Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Diversi metodi per manipolare architettura tridimensionale in idrogel a base di proteine vengono valutate qui rispetto alla proprietà del materiale. Le reti di macroporosa sono funzionalizzate con un peptide di cella-adesivo, e loro fattibilità in coltura cellulare viene valutata utilizzando due linee cellulari di modello diverso.

Facile manipolazione delle architetture in idrogel a base di proteine per applicazioni della coltura delle cellule

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.7K Views.  Ulm University. Diversi metodi per manipolare architettura tridimensionale in idrogel a base di proteine vengono valutate qui rispetto alla proprietà del materiale. Le reti di macroporosa sono funzionalizzate con un peptide di cella-adesivo, e loro fattibilità in coltura cellulare viene valutata utilizzando due linee cellulari di modello diverso.

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Ricerca

Bioingegneria

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

Fabbricazione di idrogel Micropatterned per i sistemi Cultura neurali utilizzando Dynamic Fotolitografia proiezione Mask

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

Preparazione di idrossi-PAAM idrogel per dissociare gli effetti di meccanotrasduzione Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Costruzione di fogli modulare idrogel per micropatterned macro-scala 3D Cellular Architettura

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Patterning bioattivi proteine o peptidi su idrogel utilizzando fotochimica per applicazioni biologiche

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Produzione di elastina-come proteina idrogeli per incapsulamento e Immunostaining delle cellule in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Misurazione della proteinasi metallica della matrice cellulare globale e l'attività metabolica in idrogel 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Ceppo controllato di idrogel 3D in imaging a microscopia dal vivo

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...