The authors thank the Canadian Blood Services for a Graduate Fellowship Program Award to T.N.T. This research received financial support from the Canadian Blood Services' Centre for Innovation, funded by the federal government (Health Canada) and the provincial and territorial ministries of health. The views herein do not reflect the views of the federal, provincial, or territorial governments in Canada.

Ottenere l&#39;approvazione per l&#39;uso di campioni umani da parte l&#39;etica della ricerca pensione / pensione revisione istituzionale, e ottenere il consenso firmato da tutti i donatori umani. La MMA può essere eseguita anche utilizzando PBMC del mouse in un modo simile come il saggio umana, in seguito all&#39;approvazione uso animale etica. Il MMA utilizza tecniche di coltura dei tessuti asettiche. NOTA: Vedere la Figura 1. NOTA: Anche se si consiglia l&#39;uso di un armadio biocontenimento livello 2 durante il dosaggio per mantenere la tecnica asettica, come il metodo è solo un metodo di coltura &quot;a breve termine&quot;, non c&#39;è il tempo davvero sufficiente per i batteri di contaminare il test. Pertanto, se un cabinet biocontenimento livello 2 non esiste, piuttosto che acquistare uno solo per questo saggio, il saggio può essere eseguito al di fuori di un armadio biocontenimento, su un banco aperto. L&#39;uso di un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2, tuttavia, non è un&#39;opzione e deve essere utilizzato perRisultati ottimali. L&#39;isolamento delle cellule 1. sangue periferico mononucleari <ol><li> Ottenere sangue umano intero da un donatore sano o di un paziente tramite venipuntura utilizzando vacutainer contenenti acido citrato destrosio (ACD) anticoagulante (giallo-top tubes). NOTA: sangue intero può essere conservato in ACD a temperatura ambiente (18-22 ° C) per un massimo di 36 ore prima di procedere alla fase successiva 11. Normalmente, 1-2 vacutainer 10 ml di sangue intero sono sufficienti per il dosaggio. </li><li> Diluire il sangue intero 1: 1 v / v in acqua calda completo RPMI (RPMI-1640 supplementato con siero fetale bovino al 10%, 20 mM HEPES, e 0,01 mg / ml gentamicina). </li><li> Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue intero diluito con densità centrifugazione in gradiente, come raccomandato dal produttore (vedere elenco dei materiali). Strato sangue diluito molto lentamente sopra il gradiente di densità (riscaldato a temperatura ambiente, 18-22 ° C). NOTA: Ridurre al minimo la quantità di Mixing all&#39;interfaccia per la separazione ottimale del sangue attraverso la stratificazione accuratamente la miscela di sangue in un modo a gocce o utilizzando una pipetta. <ol><li> Lasciare la miscela di sangue al layer lentamente sopra la parte superiore del gradiente di densità posizionando la punta della pipetta vicino al gradiente di densità e consentendo la miscela sangue per correre lungo il lato del tubo molto lentamente. </li><li> A seconda della scala dell&#39;esperimento, strato 10 ml di miscela di sangue sulla cima di 3 mL di gradiente di densità (in un tubo da 15 ml) o strato 35 ml di miscela di sangue sulla cima di 15 mL di gradiente di densità (in 50 mL tubo). Tipicamente, 10 ml di sangue intero fornisce 10 milioni di PBMC, con qualche variazione donatore-to-donatore. NOTA: È molto importante che vi sia alcuna miscelazione della miscela di sangue con gradiente di densità. La miscela sangue dovrebbe strato sopra il gradiente di densità e salire lentamente fino a che tutto il sangue è sopra il gradiente di densità. </li><li> Centrifugare la miscela stratificata a 700 g per 30 minuti senza freni. il centrmiscela ifuged dovrebbe separare in 5 strati (dall&#39;alto verso il basso): plasma, buffy coat (contenente PBMC), materiali gradiente di densità, granulociti, e globuli rossi. </li><li> Rimuovere e scartare la maggior parte del plasma e recuperare attentamente il contenuto buffy coat (PBMC) in un nuovo tubo da 15 ml con una pipetta Pasteur e una lampadina di aspirazione. NOTA: La rimozione dello strato di buffy coat è effettivamente fatto applicando aspirazione sulla pipetta Pasteur durante l&#39;esecuzione di un movimento circolare intorno alla parte esterna dello strato, con la punta della pipetta contro il tubo. </li></ol></li><li> Lavare le PBMC isolate tre volte in pH 7,3 tampone fosfato salino (PBS) per centrifugazione a 350 xg per 10 min (con freni pieni) tra lavaggi. Ricostituire il pellet PBMC in terreno completo RPMI. A seconda delle dimensioni del pellet, 3-7 ml di mezzo è sufficiente. </li><li> Contare il PBMC utilizzando trypan blue e un emocitometro. contare solo quelle cellule che non sono macchiati dal blu trypan. Reconstitute le PBMC a 1.750.000 cellule / ml in terreno completo RPMI. </li><li> Seed 400 ml (700.000 cellule) in ciascun pozzetto di una sagoma 8-camera. Incubare il vetrino a 37 ° C, completamente umidificata incubatore di coltura tissutale (supplementato con 5% CO 2) per 1 h per permettere i monociti / macrofagi di aderire. </li></ol> 2. Pre-trattamento dei aderito monociti NOTA: Questo passaggio è necessario solo se alla ricerca di modi per inibire o migliorare la fagocitosi. <ol><li> Pre-treat aderito monociti con qualsiasi farmaco (s) o composti (s) di interesse. Ricostituire il farmaco (s) o altro materiale di prova alla concentrazione desiderata con mezzo completo RPMI. NOTA: per esempio, 200 mg / mL di IVIG è in genere utilizzato per produrre un&#39;inibizione 95-100% della fagocitosi quando si utilizza monociti umani. </li><li> Aspirare e scartare il surnatante contenente le cellule non aderenti dalla slitta 8-camera dopo 1 h di incubazione (dopo il punto 1.6). Sostituirlo con 400ml di un farmaco o altro trattamento e incubare per 1 ora a 37 ° C. <ol><li> Quando aspirazione e sostituendo soluzioni nella slitta 8-camera, assicurarsi di controllare il flusso dei fluidi in modo che le cellule debolmente aderito non tolgono. Inoltre, lavorare con solo 2-3 pozzetti vuoti alla volta ed evitare l&#39;essiccamento dei pozzetti. NOTA: Tipicamente, ogni trattamento viene eseguito in triplicato tecnici. </li></ol></li></ol> 3. Opsonizzazione di R 2 R 2 globuli rossi NOTA: L&#39;R 2 R 2 utilizzati qui sono ottenute dal sangue Collezione Center (Canadian Blood Services), ma sono anche disponibili in commercio. Opsonizzati R 2 R 2 globuli rossi vengono utilizzati come controllo positivo per la fagocitosi FcγR-mediata. Naïve R 2 R 2 deve essere conservato in soluzione di Alsever (per prolungare la shelf life) a 4 ° C per un massimo di 1 mese. La soluzione di Alsever è fatto in casa e composta da 0,8% W v trisodio citrato (diidrato), 1,9% w / v destrosio, 0,42% w / v di cloruro di sodio e 0,05% w / / acido citrico v (monoidrato). Se R 2 R 2 cellule non sono disponibili, altre cellule Rh-phenotyped, come R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 R, o R 2 R, può essere utilizzato. <ol><li> Lavare R 2 R 2 (CDE / CDE) globuli rossi nel PBS per un totale di tre volte utilizzando centrifugazione a 350 xg per 5 minuti ciascuna. NOTA: La quantità di globuli rossi necessari dipende dalla dimensione sperimentale e può essere back-calcolato. Lavare sempre una quantità in eccesso di globuli rossi, globuli rossi poiché sono persi durante ogni lavaggio causa di lisi o durante la rimozione del supernatante. Ad esempio, in un esperimento con 5 trattamenti e 2 controlli, tutti condotti in triplicato tecnici, c&#39;è un totale di 21 pozzetti. 21 pozzi con 400 ml / pozzetto di 1,25% miscela RBC indica che 105 ml di sacco, opsonizzati sono necessari RBC. 200 ml di RBC dovrebbe essere inizialmente lavato e 150 &amp; #181; L opportuno opsonizzati per garantire che vi sia una adeguata quantità di globuli rossi per la fase fagocitosi. </li><li> Opsonize il lavato R 2 R 2 pellet con 1: 1 v / v policlonali anti-D anticorpi da siero umano e incubare per 1 ora a 37 ° C, con miscelazione intermittente. NOTA: Se policlonali anticorpi anti-D non sono disponibili, è possibile utilizzare anticorpi monoclonali anti-D, che sono disponibili in commercio, o anti-D che viene normalmente utilizzato per Rh profilassi immunitaria, che può essere ottenuto da banche del sangue o trasfusioni Servizi. test ottimizzazione dovrebbe essere condotta all&#39;inizio, quando si imposta il test, e ogni volta che il passaggio sacco di anticorpi policlonali non-titolato o il passaggio a un anticorpo monoclonale. Questo è di identificare la concentrazione ottimale o volume di anti-D richiesto per un test antiglobulina (IAT) risultato compreso tra 3+ e 4+ e un risultato di fagocitosi tra 70-90 eritrociti fagocitati per 100 monociti contati. </li><li> Lavare il opsonized R 2 R 2 un totale di tre volte in PBS mediante centrifugazione a 350 xg per 5 minuti ciascuna. NOTA: opsonizzazione di successo di R 2 R 2 può essere confermata eseguendo una IAT indiretta. Brevemente, secondarie policlonali anticorpi anti-umani vengono aggiunti per legare anticorpi opsonizzante primarie sulle superfici RBC, e il segnale amplificato possono essere osservati sotto forma di emoagglutinazione. Un dettagliato protocollo produttore può essere trovato nel file materiali supplementari. </li><li> Ricostituire il lavato R 2 R 2 pellet al 1,25% v / v usando mezzo completo RPMI. NOTA: Eccesso opsonizzati 2 R 2 R può essere conservato in soluzione di Alsever a 4 ° C per una settimana. </li></ol> 4. La fagocitosi mediata da recettori Fc <ol><li> Aspirare il farmaco o mezzo supernatante dalla slitta 8-camera e aggiungere 400 ml di 1,25% v / v R 2 R 2 miscela. Incubare a 37 ° C per 2 ore. </li><li> A poppaer 2 h di incubazione, rimuovere le camere utilizzando gli adattatori del produttore. Tamponare l&#39;eccesso di R 2 R 2 su un tovagliolo di carta. Assicurarsi che la diapositiva non si asciughi. </li><li> Riempire un bicchiere da 100 ml con PBS. Immergere e lavare la slitta spostando lentamente la slitta avanti e indietro (circa 30-40 colpi) per rimuovere la maggior parte dei non-fagocitati R 2 R 2. </li><li> Rimuovere il vetrino dal PBS. Tamponare l&#39;eccesso di PBS usando un tovagliolo di carta o tessuto e aria asciugare la diapositiva. </li><li> Fissare la slitta di aria secca in 100% di metanolo per 45 s. Poi, aria asciugare il vetrino fisso. NOTA: diapositive può essere fissato utilizzando un altro metodo che è più compatibile per la colorazione downstream, quali la macchia Grünwald-Giemsa 21 o Wright-Giemsa 22. </li><li> Montare la slitta con un in-house fatta di montaggio elvanol medio (o di un altro mezzo di montaggio disponibile in commercio) e aggiungere lamelle. NOTA: Elvanol mezzo di montaggio è composto da 15% w / v poresina alcool lyvinyl e il 30% v / v in PBS glicerina. La miscela viene riscaldata fino a quando tutta la resina è sciolto e la glicerina è omogeneamente miscelato. Questo può essere sostituito con altro mezzo di montaggio disponibile in commercio. </li><li> Lasciare che il supporto per asciugare durante la notte prima di quantificazione. </li></ol> 5. Quantificazione della fagocitosi <ol><li> Utilizzando un microscopio a contrasto di fase e una lente obiettivo 40X, quantificare manualmente la quantità di eventi fagocitarie contando almeno 200 monociti e il numero dei fagocitati R 2 R 2 all&#39;interno di questi monociti. Avere un contatore in ogni mano per quantificare contemporaneamente il numero dei monociti e il numero di fagocitati R 2 R 2. </li><li> Ottenere l&#39;indice medio di fagocitosi dividendo il numero di fagocitati R 2 R 2 per il numero di monociti e moltiplicando per 100. espresso i dati come la media (indice di fagocitosi media) ± l&#39;errore standard della media (SEM). </li&gt; </ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il MMA è una tecnica laboriosa che richiede competenze sia nella coltura di tessuti e microscopia. Ci sono diversi passaggi critici per garantire il successo: 1) generazione del monostrato monociti; 2) opsonizzazione dei globuli rossi, e 3) la quantificazione manuale. Il monostrato monociti non aderisce fortemente alla diapositiva camera, in modo pH fisiologico deve essere mantenuta durante tutta la seduta 11 e un numero adeguato di PBMC dovrebbe essere seminato. pipettaggio vigoroso, che potrebbe disturbare le cellule aderito, dovrebbe essere evitato. Un approccio è quello di rimuovere sempre e aggiungere soluzioni dal medesimo angolo della camera e per assicurare che il movimento è lento e costante. Allo stesso modo, durante l&#39;ultima fase di lavaggio per rimuovere l&#39;eccesso di globuli rossi, il movimento deve essere lento e costante. Questo assicura il minimo disturbo al monostrato pur eliminando la maggior parte dei globuli rossi non-fagocitati. lavaggio inadeguata porterà ad un fondo elevato di globuli rossi contaminanti, il che rende qua manualentification difficile. In secondo luogo, i globuli rossi R 2 R 2 devono essere sufficientemente opsonizzati per ottenere un indice medio fagocitosi del 80-120 per il controllo fagocitosi. Questa gamma dei fagociti desiderato un equilibrio tra la facilità di conteggio (ad esempio, monociti con più di 5 fagocitati globuli rossi sono difficili da quantificare con precisione) e il mantenimento di una adeguata quantità di fagocitosi per l&#39;analisi statistica. Il grado di opsonization può essere confermata da un IAT, ed è necessaria una lettura tra 3+ a 4+. L&#39;R 2 R 2 RBC deve essere eliminata quando c&#39;è eccesso lisi durante il lavaggio, quando il supernatante diventa rosso scuro, o quando una diminuzione significativa nella fagocitosi è osservata in esperimenti a causa dell&#39;invecchiamento delle cellule in deposito. Infine, la quantificazione manuale utilizzando il microscopio può essere difficile, soprattutto quando si confrontano i conteggi tra il personale di laboratorio e tra esperimenti. Esaminando stesso campo in ogni pozzetto, o semplicemente contando più cellule, Un conteggio più coerente può essere ottenuta. Si raccomanda di formazione Side-by-side con un tecnico esperto e l&#39;uso di un insieme designato di diapositive formazione. Un importante critica del MMA è la soggettività del passo quantificazione manuale. Tuttavia, con una formazione adeguata, la coerenza può essere ottenuto attraverso diversi contatori. Un altro limite è la intrinseche differenze donatore-to-donatore in monociti capacità fagocitarie e in R 2 R livelli di espressione dell&#39;antigene 2 di superficie, che è una fonte di variazione dei dati quando si tratta di campioni umani. Altre tecniche alternative sono disponibili per l&#39;esame fagocitosi FcγR-mediata. La maggior parte dei kit commerciali utilizzano uscita fluorescente per monitorare la fagocitosi (ad esempio, bioparticelle, sensibile al pH della proteina di fluorescenza, o sfere di lattice fluorescenti IgG-etichettati). L&#39;uso di uscita fluorescente non offrono quantificazione più oggettiva, ma ha anche bisogno di ConSider la disponibilità, costo e formazione associata con l&#39;uso di un microscopio a fluorescenza o un citometro a flusso, nonché la dipendenza conseguente upon kit disponibili in commercio. Infine, questo dosaggio può essere modificato a seconda della domanda di ricerca. Ad esempio, quando si verifica l&#39;inibizione farmaco di fagocitosi, monociti possono sia essere pretrattate o co-incubate con entrambi i farmaci e RBC opsonizzati (cioè, un saggio di competizione). La segnalazione a valle di anticorpi di diversi sottotipi, anticorpi chimerici, o costrutti ricombinanti può essere testato. Con i recenti progressi nello sviluppo di un sangue dell&#39;antigene nullo universale 24, la MMA potrebbe essere utilizzato nelle schermate iniziali di questi globuli rossi antigene-null con diversi anticorpi per valutare se esiste effettivamente un efficacia abbassato nello scatenare la fagocitosi.

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood5. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient's blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient6. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient's blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis7. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting1-5.
Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed10. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples11.
Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the 51Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the 51Cr release test, the patient is injected with 51Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)14. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome15. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior16. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay's optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis11.
In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy17. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of Fc&#947;R-mediated phagocytosis18-20 and to study the downstream signaling of Fc&#947;R-mediated phagocytosis21. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce Fc&#947;R-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and Fc&#947;R interaction that induce phagocytosis.

<table><tbody><tr><td>Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers</td><td>BD</td><td>REF364606</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Multicell&amp;nbsp;</td><td>080150</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-64</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-03</td><td>https://www.gelifesciences.com/</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>8-chamber slides</td><td>Lab-Tek-ll</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>R&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;R&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (cDE/cDE) red blood cells</td><td>Canadian Blood Services</td><td></td><td>Commercially available (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)</td></tr><tr><td>Polyclonal anti-D from human serum</td><td>Gamma Biologics</td><td>DIN 02247724</td><td>Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin</td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>Caledon</td><td>6700-1-42</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol resin</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td>Can be substituted with commercially available mount</td></tr><tr><td>UltraPure glycerine</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Novaclone anti-IgG</td><td>Immucorgamma</td><td>5461023</td><td>Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)</td></tr></tbody></table>

use of a monocyte monolayer assay to evaluate fc&#947; receptor-mediated phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Seguendo i passaggi cruciali nella figura 1 e la procedura sopra descritta, l&#39;MMA può essere riproducibile eseguita. IVIG è stato utilizzato come un esempio per l&#39;inibizione della fagocitosi in figura 2. IVIG è noto per legare e bloccare i recettori Fc, inibendo quindi il risultato a valle della fagocitosi. Titolando la quantità di IVIG utilizzato, una inibizione dose-dipendente è osservato, nel quale la concentrazione di sopra di 200 mg / mL portato vicino al 100% di inibizione e concentrazioni inferiori a 0,5 mg / mL non ha inibito affatto (Figura 2A). Quando gli indici fagocitarie vengono trasformati e normalizzati per il controllo positivo R 2 R 2 come 0% di inibizione, una curva di inibizione con una IC50 di 3 mg / ml può essere determinato (Figura 2B). Oltre a eseguire il dosaggio costante, quantificazione del saggio a volte può essere difficile. La figura 3 è una raccolta di contrasto di fase immagini al microscopio di varie diapositive MMA. Con l&#39;esperienza microscopia, si può distinguere un monociti da un RBC contaminante (Figura 3D), o un vacuolo da un RBC fagocitato (Figura 3B). Densi ammassi di cellule e / o detriti dovrebbero essere evitati durante la quantificazione (Figure 3E e F). Inoltre, si dovrebbe evitare un&#39;eccessiva opsonizzare R 2 R 2 RBC, che porterebbe alla fagocitosi rafforzata che overcrowds l&#39;interno monociti e interferisce con accurata quantificazione (Figura 3C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig1.jpg" /> Figura 1. Schema della MMA. Una rappresentazione step-by-step dei passaggi cruciali nella MMA: isolamento PBMC da sangue intero, che alimenta il monocyt aderitoes con opsonizzati R 2 R 2, e lavando le diapositive da camera. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55039/55039fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig2.jpg" /> Figura 2. endovenoso IgG (IVIG) inibisce la fagocitosi in vitro usando l&#39;MMA. IVIG è noto per inibire la fagocitosi e viene usato come controllo di inibizione nella MMA umana. (A) Titolazione di IVIG determinato una inibizione dose-dipendente di fagocitosi rispetto al greggia R comando R 2 2. I risultati mostrano la media ± errore standard della media (SEM) di n = 3 esperimenti. L&#39;analisi statistica è stata condotta utilizzando Student t-test: ** P≤0.01 e *** p≤0.001. (B) della curva di inibizione IVIG con un IC 50 of 3 mg / mL (linea tratteggiata). I risultati mostrano dati normalizzati per non trattati R 2 R 2 (0% di inibizione); media ± SEM di n = 3 esperimenti. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55039/55039fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig3.jpg" /> Figura 3. contrasto di fase immagini al microscopio di diapositive campione sotto 40X di ingrandimento. (A) La slitta perfetto in cui i monociti fagocitati 1-2 R 2 R 2 su (frecce nere con un bagliore alone distintivo) media, con pochissimi contaminante, non-fagocitato R 2 R 2 in background (frecce bianche). Vacuoli (B) Come mostrato in questa diapositiva, monociti a volte sono allargata (frecce bianche), che possono essere scambiati per fagocitato R 2 R 2. (C &lt;/ strong&gt;) Quando R 2 R 2 sono stati over-opsonizzati, più di 4-5 fagocitati R 2 R 2 per monociti (frecce nere) renda conteggio preciso difficile, poiché la R 2 R 2 sono affollate ai monociti e cellule distinta i confini non possono essere distinte. (D) di lavaggio inadeguata della slitta porta ad abbondanti R 2 R 2 contaminazione (frecce bianche), che potrebbe essere scambiato per globuli rossi aderito. (E) A volte, monociti e globuli rossi contaminanti possono formare gruppi. I cluster indicano anche la contaminazione batterica, che dovrebbe essere evitato. (F) I monociti può formare aggregati più grandi, che dovrebbero essere evitati durante la quantificazione. Utilizzando selezione casuale dei campi per vedere, pannello A è quello che di solito si osserva se il MMA è stata eseguita correttamente. barra della scala è di 20 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55039/55039fig3large.jpg" target="_blank">Per favore clicca qui</a>per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

L&#39;uso di un monociti monostrato test per valutare fagocitosi Fcy recettore-mediata

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.0K Views.  University of Toronto. The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis.

Video: Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fcγ Receptor-mediated Phagocytosis

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

Determinazione dell&#39;attività fagocitaria dei Campioni anticorpi clinici

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, and foreign pathogens. The phagocytic capacity of monocytes versus macrophages is a concept that is not well understood. Here, we aim to examine a difference in the phagocytosis of monocytes versus macrophages, specifically M1/M2 macrophages, against various opsonized red cells using a modified and updated version of the established monocyte monolayer assay (MMA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from donor buffy coats. Using purified monocytes, inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 macrophages were produced by in vitro culture and polarization. M1/M2 cells were harvested and used in an MMA-like assay, which we refer to as the M-MA, to decipher clinically significant phagocytosis of various red cell antibodies. A phagocytic index (PI) &#62; 5 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of monocytes. A phagocytic index (PI) &#62; 12 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of M1/M2 macrophages. M2 macrophages demonstrate an increased ability to phagocytose opsonized RBCs compared to monocytes and M1s. The same weak antibody (anti-S) yields significant phagocytosis with only M2 macrophages (PI=43) but not M1s (PI=2) or monocytes (PI=0), and this was demonstrated repeatedly using various antibodies. The use of M2 macrophages instead of monocytes may allow for more accurate results as these cells are more phagocytic, offering further clinical relevance to the assay. Further studies with different antibodies to red blood cells, including validation of the monocyte-macrophage assay (M-MA) with antibodies having known clinical significance, may show the M-MA&#160;more useful to help predict clinically significant red cell alloantibodies and transfusion reactions. This method will advance the field of transfusion medicine and immunology.

We have developed enhancements and updated methods for the existing monocyte-monolayer assay (MMA), in which macrophages are used to help better predict the clinical relevance of red cell alloantibodies in transfusion medicine and immunology. This assay is named the monocyte-macrophage assay (M-MA).

Previsione del significato degli anticorpi dei globuli rossi utilizzando il test dei monociti-macrofagi

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, ...

Real-Time Imaging of Macrophage Phagocytosis of IgG-Opsonized Red Blood Cells

Source: Horsthemke, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57566">Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor independent macrophage-mediated red blood cell (RBC) phagocytosis events. Mouse immunoglobulin G (IgG)-opsonized human RBCs are incubated with mouse macrophages and observed under a confocal microscope. The RBCs are engulfed by macrophages via a phagocytic cup formation and targeted for lysosomal degradation.

Imaging in tempo reale della fagocitosi macrofagica dei globuli rossi opsonizzati IgG

Source: Horsthemke, M., et al. Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

An In Vitro Assay for Evaluating the Immunomodulatory Impact of Monocytes on Leukocyte Proliferation

Source: Hsu, P., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53265">Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs).</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates an in vitro assay to explore the immunomodulatory influence of mesenchymal stem cells (MSCs) on effector T cell proliferation. The assay includes co-culturing MSCs with PBMCs to induce the monocyte population to acquire an immunomodulatory phenotype, leading to the secretion of interleukin-10 (IL-10). Following incubation with activated CD4+ T cells, the induced monocytes effectively suppress T cell proliferation.

Un test in vitro per valutare l'impatto immunomodulatorio dei monociti sulla proliferazione leucocitaria

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Density Gradient Isolation of ...

In Vitro and In Vivo Models

An Assay to Assess Phagocytosis and Oxidative Burst Activity In Granulocytes and Monocytes

Source: Meaney, M. P. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54264">Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the assay to confirm phagocytic activity by cells in human blood via flow cytometry. The granulocytes and monocytes confirm their phagocytic activity by showing green and red fluorescence confirming the presence of engulfed bacteria and oxidative burst activity respectively.

Un test per valutare la fagocitosi e l'attività di burst ossidativo nei granulociti e nei monociti

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

An Assay for Quantifying Antibody-Mediated Phagocytosis of Parasite-Infected Erythrocytes

Source: Quintana, M. d. P. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61538">Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates a flow cytometry-based phagocytosis assay involving labeled and opsonized Plasmodium falciparum-infected erythrocytes by monocytes. Flow cytometry identifies fluorescence in monocytes, confirming the successful identification of opsonized erythrocytes through phagocytosis.

Un test per quantificare la fagocitosi mediata da anticorpi di eritrociti infetti da parassiti

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Parasite culture
NOTE: Follow the ...

An In Vitro Assay to Measure Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis by Phagocytes

Source: Powell, R. L., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60149">Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to measure the antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) by breast milk phagocytes. Fluorescently labeled microspheres conjugated to an antigen-antibody complex, are combined with a cell suspension isolated from breast milk to induce antibody-dependent cellular phagocytosis by the phagocytic leukocytes. Upon labeling the cells with antibodies against common leukocyte antigen (CD45), flow cytometry is used to measure the fluorescence intensity of microsphere-positive viable phagocytic leukocytes, indicating the level of ADCP activity.

Un test in vitro per misurare la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente da parte dei fagociti

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Target Microsphere preparation

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L'uso di un monociti monostrato test per valutare fagocitosi Fcy recettore-mediata

Riepilogo

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