Name: preparation of extracellular matrix protein fibers for brillouin spectroscopy
Uploaded: 2016-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
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This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.

Attenzione: Si prega di consultare i protocolli di sicurezza biologica e tutte le schede di sicurezza dei materiali rilevanti (MSDS) prima dell&#39;uso. Il laser impiegato in questi esperimenti è un laser di classe 3B; è richiesto il rispetto delle norme locali per un uso sicuro del sistema. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate durante l&#39;esecuzione di una misura di spettroscopia laser compreso l&#39;uso di dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza). tendini coda sono stati ottenuti 7-8 settimane di età ratti Wistar sacrificati per altri scopi, conformemente al regolamento UE 1099/2009 e il benessere degli animali (macellazione o l&#39;abbattimento) del 1995. bovino legamento nucale sono stati ottenuti da un mattatoio locale. 1. preparazione di fibre campione NOTA: fibre proteiche della matrice extracellulare possono essere estratti da vari tessuti, con procedure diverse. I protocolli sono stati raffinati in base a procedure ampiamente applicate. <ol><li><strong&gt; Estrazione di fibre di collagene da coda di topo <ol><li> Sacrifica un ratto mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di peso corporeo pentobarbitone sodio. Poi tagliare la coda direttamente nel punto di contatto con il corpo, premendo con una lama di rasoio singolo bordo. Avvolgere la coda nella pellicola e conservarlo congelato a -20 ° C fino al momento. </li><li> Raccogliere la coda dal congelatore, tagliare una lunghezza di 20 mm segmento dall&#39;estremità prossimale mentre ancora congelato e poi lasciarlo scongelare in una capsula di Petri riempito con una soluzione tampone fosfato salino (PBS) (pH 7,4) a temperatura ambiente. </li><li> Una volta che la coda è scongelato, fare un&#39;incisione lungo la lunghezza del segmento utilizzando un bisturi per dividere la pelle. Poi buccia indietro per rivelare quattro fasci tendinei guaina circa la vertebra della coda. </li><li> Utilizzando una pinza sottile e facendo attenzione a non applicare alcuna pre-deformazione, aspirare lentamente ogni fibra dalla guaina e metterlo in un flaconcino contenente acqua distillata con 0,01% w / v di sodio azide (NaN 3) per prevento crescita batterica, e conservare in frigorifero. Una singola coda produce una trentina di fibre tendinee. </li><li> Per ottenere il tipo fibroso puro collagene, applicare un tre parti processo di digestione enzimatica 10 alle fibre tendinee per rimuovere i proteoglicani e ogni altro materiale noncollagenous. <ol><li> In primo luogo, immergere le fibre in 0,125 U / ml condroitinasi ABC in 0,05 M Tris buffer e 0,06 M acetato di sodio (CH 3 COONa) a pH 8,0 per 24 ore a 37 ° C in un incubatore agitazione a 200 rpm. </li><li> Poi, immergere le fibre in 1 U / ml Streptomyces ialuronidasi in 0,05 M Tris buffer e 0,15 M di cloruro di sodio (NaCl) a pH 6.0 e tornare alla incubatore agitazione per 24 ore a 37 ° C. </li><li> Infine, immergere le fibre a 1 mg / ml di tripsina in 0,05 M di fosfato di sodio (NaHPO 4) e 0,15 M NaCl a pH 7,2 per 16 ore in incubatore agitazione a 37 ° C. </li></ol></li><li> Conservare le fibre purificati refrigerati in flaconcini contenenti acqua distillata, with 0,01% NaN 3 per prevenire la crescita batterica, fino richiesto per la misurazione. </li></ol></li><li> Estrazione di fibre di elastina da bovini legamento nucale <ol><li> Ottenere bovina legamento nucale da macello, avvolgerla nella pellicola e conservarlo congelato a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Per produrre elastina puro, raccogliere il legamento dal congelatore, permettono di scongelare a temperatura ambiente, sgrassare utilizzando un bisturi e digerire il legamento in un bagno di acqua bollente secondo la procedura di Lansing, 11 come segue. <ol><li> Preparare una soluzione di idrossido di sodio (NaOH) in acqua distillata 0,1 M e aggiungerlo al legamento sgrassata in una beuta, coprendo il tessuto. </li><li> Far bollire il pallone in un bagno d&#39;acqua a 95 ° C per 45 min. </li><li> Rimuovere il legamento dal pallone Kjeldahl e lavare il blocco tessuti insolubile ripetutamente in acqua bidistillata fino a pH 7,0 (monitorati utilizzando un pHmetro). </li><li> Rimuovere il tessuto dalla finaleSoluzione di lavaggio e immergerlo in acqua distillata (miscelato con lo 0,01% NaN 3 per prevenire la crescita batterica) in un contenitore sigillato e conservarlo in frigorifero. </li></ol></li><li> Raccogliere il tessuto dal frigorifero e, facendo attenzione a non applicare una forza eccessiva e pre-deformazione, usa le pinzette per tirare delicatamente segmenti di elastina più piccoli (da 20 a 50 mm di lunghezza, circa 2 mm di spessore) di distanza dal blocco più grande e metterli in una capsula di Petri con la soluzione PBS (pH 7,4). </li><li> Utilizzando una pinza sottile, prendere in giro delicatamente piccoli fasci di fibre intorno 1 mm di spessore e tagliarli a lunghezze di pochi millimetri con un bisturi. </li><li> Trasferire le fibre di flaconi contenenti acqua distillata (con il 0,01% NaN 3 per prevenire la crescita batterica) e memorizzarli in frigorifero fino al momento per la misurazione. </li></ol></li><li> Montaggio delle fibre su supporto d riflettente <ol><li> Utilizzando un tagliatore di diamanti, tagliare un pezzo di silicone scorrevole riflettente. </li><li> Per creare un compartme idratatant, tagliare una striscia di Parafilm per adattarsi sopra la diapositiva in silicone con un taglio cava nel centro (grande abbastanza da contenere una fibra) e posizionarlo sul substrato di silicone. NOTA: Per misure fibre secche, tagliare il parafilm in una forma ad U in modo che uno dei quattro lati rimane aperto all&#39;aria volta sigillato nel passaggio 1.3.4. </li><li> Rimuovere le fibre dal frigorifero, utilizzare un paio di pinze sottili per raccogliere una singola fibra dalla soluzione di stoccaggio e collocarlo in una piccola capsula di Petri riempita con acqua pura a temperatura ambiente per 5 minuti per lavare il campione. Poi, raccogliere la fibra e trasferirlo al centro della cavità parafilm sul substrato di silicone. Un&#39;attenta: Evitare di danneggiare la fibra allungando durante questa operazione, ed evitare riorientare il campione sul substrato poiché ciò può causare un cambiamento nelle proprietà meccaniche. </li><li> Inserire un sottile vetrino coprioggetto sulla fibra e sigillare la camera passando un saldatore riscaldato delicatamente sulla superficie del vetro per fondere il parafilm sottoil vetro. Attenzione: Evitare di danneggiare la fibra da non portare la punta di saldatura troppo vicino o il riscaldamento del substrato eccessivamente. </li><li> Posizionare la camera stagna su una superficie piana in un piccolo peso e lasciare per circa 12 ore per ottenere un buon contatto tra il substrato di silicio campione e evitando danni al campione. </li><li> Rimuovere il peso e fissare la camera in posizione sul substrato, mediante viti. </li></ol></li></ol> 2. Configurazione del test Brillouin e l&#39;acquisizione di Spectra Fiber <ol><li> Preparazione del vano campione <ol><li> Montare il campione preparato come parte 1.3 su un supporto verticale dotato di un goniometro per permettere la rotazione nel piano del campione mantenendo un angolo di diffusione costante (2 Φ = 90 °; vedere Figura SI-1) e dispersione posizione di volume. </li><li> Eseguire una regolazione precisa messa a fuoco della luce laser sul campione attraverso lens. 9 Un&#39;attenta: La potenza di uscita del laser può essere troppo elevato e produrre una bruciatura nel campione. Assicurarsi che sia impostato sufficientemente alto per dare una buona sensibilità, ma non troppo alto per evitare danni al campione. Qui abbiamo usato una potenza di circa 76 mW sul campione. Questo era sufficiente per ottenere una buona sensibilità senza bruciare il campione, anche considerando che questo è sottile e in contatto con un substrato che aiuta a dissipare il calore generato dall&#39;illuminazione laser. </li><li> Posizionare il campione ad un angolo di 45 ° (Φ) al fascio laser incidente utilizzando una scala Vernier. Ottenere un posizionamento ottimale eseguendo una misurazione e massimizzando l&#39;intensità dei picchi nello spettro (vedi sotto). </li></ol></li><li> Impostazione dello spettrometro <ol><li> Aprire il software per l&#39;acquisizione e la manipolazione dei dati e impostare l&#39;acquisizione di uno spettro Brillouin del campione 12. La procedura qui descritta si applica al multipass tandem interferometro (Figura SI-1A). </li><li> Allineare i due Fabry-Perot (FP) interferometri mutevoli autonomamente le tensioni applicate al piezo dall&#39;unità di controllo. Per questa procedura di pre-allineamento, osservare la luce riflessa da ogni FP. Quando l&#39;intensità riflessa dai due PQ tende a zero, viene raggiunto il corretto allineamento. </li><li> Calibrare spettro: la gamma di frequenza accessibili, o intervallo spettrale libera FSR (), dipende dalla distanza tra i due specchi della prima cavità FP, L, attraverso FSR = c / 2 L, dove c è la velocità della luce e L è misurata da un quadrante calibro. </li><li> Sincronizzare le scansioni dei due interferometri FP e commutare il sistema ottico per la configurazione tandem multipass. Un controllo in retroazione della intensità della luce laser trasmesso manterrà automaticamente l&#39;allineamento dei due PQ durante la misurazione. </li></ol></li><li> misura of Brillouin Spectra Un&#39;attenta: Lo spettro Brillouin è fortemente dipendente dalla temperatura e idratazione del campione e così attento controllo di questi parametri è la chiave per ottenere spettri riproducibile. <ol><li> Avviare l&#39;acquisizione di uno spettro Brillouin del campione ed eseguirlo fino ad ottenere un buon rapporto segnale-rumore. Questo può richiedere alcuni minuti a seconda della dispersione sezione trasversale, concentrazione e spessore del campione. NOTA: Non c&#39;è una regola per il rapporto segnale-rumore, ma la qualità spettrale viene controllato dal sperimentatore basato sul campione analizzato specifico. Vi è un compromesso tra qualità spettrale e durata della misurazione, quindi i parametri sperimentali devono essere selezionati in base alla specifica applicazione. </li><li> Per la misurazione di un campione secco, prendere successive spettri - per ciascuno di essi, seguendo passo 2.3.1 - fino cambiamenti nella posizione dei picchi is osservate. Ciò si ottiene quando il campione è in equilibrio con l&#39;atmosfera ambiente e senza ulteriore essiccamento influenzerà spettro. </li><li> Selezionare la polarizzazione della luce (VV o VH; V sta per verticale e H per la direzione orizzontale della polarizzazione della luce rispetto al piano di scattering) e acquisire spettri ad ogni angolo rispetto all&#39;asse della fibra (θ; Figura SI-1) ruotando il campione plane mano. </li><li> Salvare gli spettri Brillouin di file per la successiva elaborazione. </li></ol></li></ol> 3. Analisi di Brillouin Spectra NOTA: analisi Fit dei picchi di Brillouin possono essere eseguiti utilizzando diverse funzioni. Una smorzata oscillatore armonico (DHO) Funzione di 4,13 è stato selezionato come questo è un modello valido per i picchi provenienti da modi acustici smorzate in mezzi viscoelastici. <ol><li> Analisi Fit di picchi di Brillouin <ol><li> Selezionare l&#39;intervallo spettrale per il picco di interesse in the spettro di Brillouin. </li><li> Attiva una linea di base nella forma se lo sfondo spettrale è molto superiore a zero. NOTA: La linea di base può variare tra spettri. Assicurarsi che la correzione viene applicata in modo sistematico e riproducibile. </li><li> Applicare un dettagliato minimi quadrati utilizzando una funzione DHO 4,13 al picco di Brillouin di interesse in modo iterativo fino al raggiungimento della convergenza e la migliore curva si ottiene. Poi, salvare i risultati in forma di file. </li><li> Ottenere valori medi dai parametri fit dei due picchi di ciascun doppietto Brillouin. </li><li> Calcolare la velocità dell&#39;onda acustica dalla frequenza di picco (utilizzando l&#39;espressione sotto). </li><li> Tracciare i risultati in forma attraverso grafici, ad esempio, velocità delle onde acustiche vs. angolo all&#39;asse della fibra, θ E applicare modelli rilevanti (ad esempio, per i sistemi acusticamente anisotropi 9) per estrarre le quantità meccaniche come i coefficienti di elasticità tensore. </li></ol>
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	<li>Brillouin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+de+la+lumi&#232;re+et+des+rayonnes+X+par+un+corps+transparent+homog&#232;ne;+influence+de+l'agitation+thermique.">Diffusion de la lumi&#232;re et des rayonnes X par un corps transparent homog&#232;ne; influence de l'agitation thermique.</a> Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).</li><li>Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+effects+on+the+elastic+properties+of+amorphous+polymeric+materials.">Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials.</a> J. Chem. 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The authors have nothing to disclose.

spettroscopia Brillouin dispersione è uno strumento unico con cui i singoli componenti del tensore di elasticità di una fibra della proteina possono essere caratterizzati in dettaglio senza precedenti. Inoltre, le misurazioni possono essere effettuate su scala microscopica e quindi ci fornirà nuove intuizioni meccanica micro-scala di strutture biologiche, che ci permette, per la prima volta, di capire la meccanica, e probabilmente funzionali, significatività delle complessità in architettura a matrice e biochimica, che è stato rivelato in questi ultimi anni. La tecnica misura caratteristiche meccaniche in un intervallo di frequenza GHz. Questo dominio non è mai stata esplorata prima di biopolimeri strutturali e sia alza e fornisce i mezzi per rispondere a domande fondamentali su meccanismi molecolari di elasticità. Abbiamo descritto le istruzioni per estrarre le fibre di collagene ed elastina da tessuti animali e per misurare Brillouin scatterispettri ng utilizzando un substrato riflettente per ottenere la descrizione completa di biomeccanica fibra. Passaggi critici all&#39;interno del protocollo sono quelli che garantiscono che le fibre purificate sono ottenuti ed appropriate condizioni sperimentali sono in atto per le misurazioni riproducibili delle proteine ​​fibrose. Tuttavia, si deve tener presente che le procedure di estrazione possono modificare le proprietà meccaniche delle fibre. Modifiche della tecnica comportano l&#39;accoppiamento con la microscopia ottica per lo scattering Brillouin microfocused e mappatura avvicina 13 e la possibile combinazione con tecniche complementari (ad esempio, Raman scattering). Le attuali applicazioni della tecnica si concentrano principalmente su materiali biologici escisse, ma importanti sviluppi, ad esempio, quelli basati su più etalon VIPA 14, stanno rendendo possibile la traduzione di questa tecnica dal banco al capezzale con una serie di applicazioni già demonestrare 15,16 compreso potenziale nelle applicazioni in vivo. L&#39;approccio VIPA è un&#39;alternativa a quello che descriviamo; ha tempo di acquisizione veloce ma non è necessariamente appropriata nel caso di campioni opachi come quelli qui analizzato. Inoltre, l&#39;uso di un substrato riflettente non è pratico in set-up che utilizzano i etalon VIPA perché il loro contrasto non sarebbe sufficiente per respingere la luce quasi-elastica. Limitazioni relative alla velocità di acquisizione di un set di dati spettrali e la sezione trasversale di scattering intrinsecamente debole del materiale possono limitare le applicazioni a sistemi biologici dinamici e per l&#39;acquisizione di dati dal profondo tessuti, ma filtri tecniche possono migliorare le prestazioni di corrente. BLS promette di essere uno strumento importante nella ricerca biofisica fondamentale sulla matrice extracellulare e, quindi, per la produzione di nuove intuizioni l&#39;evoluzione delle proprietà meccaniche durante la crescita della matrice e la loro perdita in patologicadegenerazione. Tuttavia, è importante ricordare che le misure sono invasiva e possono pertanto essere intrapresi in vivo. Infatti, questo è già stato realizzato nella cornea 16 e tale lavoro può fornire una piattaforma per lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici per una vasta gamma di malattie del tessuto connettivo. Ultrasuoni elastografia e microscopia a forza atomica (AFM) sono metodi alternativi di misura micromeccanica, ma la tecnica BLS offre una migliore risoluzione spaziale (su una scala subcellulare) rispetto al primo e, a differenza di AFM, non impone forze meccaniche sul campione e non è limitata a l&#39;analisi solo di caratteristiche superficiali. moduli di Brillouin di collagene ed elastina sono nella gamma GPa, mentre moduli di Young da ceppi macroscopici sono dell&#39;ordine di MPa (ulteriori dettagli saranno riportati altrove). Questo risultato indica un modulo elastico differenziale con una forte dipendenza dalla frequenza di eccitazione, a causail comportamento viscoelastico delle fibre. BLS possono essere applicati a una vasta gamma di problemi e materiali in scienza biomedica. Essa può aiutare a rispondere a domande sulla fisiologia e patologia dei tessuti biologici, oltre a fornire uno strumento fisico per la comprensione fondamentale dei materiali e delle interazioni a livello molecolare.

L&#39;effetto luce Brillouin Scattering (BLS) è stato scoperto da Léon Brillouin nel 1922. 1 Si tratta della scattering anelastico di luce visibile da fononi acustici attivati ​​termicamente in un materiale. In fisica dello stato solido, fononi acustici sono vibrazioni coerenti di tutti gli atomi in un reticolo. Una catena unidimensionale di due tipi alternati di atomi in un reticolo è un semplice modello che illustra la differenza tra fononi acustici, rivelate da BLS e fononi ottici, controllati mediante assorbimento IR e Raman (Figura 1). fononi acustici sono movimenti in fase di atomi nella catena con uno spostamento lungo la direzione di propagazione (fononi acustici longitudinali) o perpendicolare alla direzione di propagazione (trasversali fononi acustici), mentre fononi ottici sono out-of-fase movimenti degli atomi producendo un momento di dipolo elettrico oscillante (longitudinale o modi trasversali). BLS Spectroscopia è stato utilizzato in scienza analitica dal 1920; tuttavia, solo dal 1980 hanno misure alto contrasto stato possibile attraverso l&#39;uso del multipass spettrometro Fabry-Perot tandem. Da allora, un numero crescente di progressi nella BLS per applicazioni analitiche in materia condensata (in cui viene sfruttato l&#39;interazione fotone-fononi) 2-4 e magnetici materiali (attraverso l&#39;interazione fotone-Magnon) 5 è stato portato. Opere seminali sulle applicazioni biomediche 6-8 hanno aperto la strada per lo sviluppo di vari approcci, compreso quello applicato qui e quella precedentemente descritta 9 utilizzando un substrato riflettente in una configurazione di piastrine come per ottenere la descrizione completa del tensore elasticità un campione. Nel presente lavoro, si applica la spettroscopia BLS ai componenti fondamentali della matrice extracellulare nei tessuti connettivi, le proteine ​​fibrose di elastina e collagene di tipo I-. Tipo collagene è una molecola rigida elica, tripla che assembla lateralmente e longitudinalmente con una vasta collegamento trasversale per formare fibre sostanzialmente rigidi in tessuti come tendini. Reti di collagene spesso coesistono con le reti di elastina, una proteina che, insolitamente, genera lungo raggio elasticità attraverso una combinazione di entropia e interazioni idrofobiche con l&#39;ambiente ed è essenziale per le funzioni di tessuti come il polmone e la pelle. Entrambe le fibre sono modellati utilizzando un modello di cristallo esagonale nella ricerca attuale. 9 Nella parte 1, descriviamo il protocollo per estrarre le fibre provenienti da tessuti animali e per preparare il campione per le misure spettroscopiche. Nella parte 2, la procedura per la messa in opera dell&#39;apparecchiatura Brillouin e l&#39;acquisizione di spettri dalle fibre è presentato. Parte 3 fornisce dettagli di analisi dei dati applicati agli spettri Brillouin per estrarre le informazioni pertinenti meccanica ivi contenute. Poi, risultati rappresentativi sono presentati e discussed.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chondroitinase ABC&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2905</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tris Buffer&lt;/strong&gt;</td><td>Fluka</td><td>93358</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Acetate&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S608-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PBS&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Azide&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Streptomyces Hyaluronidase&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1136-1AMP</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Chloride&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Trypsin&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4665</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Phosphate&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Hydroxide&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S320-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pure Water&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore</td><td>ZRQS0P3WW</td><td>Produced in-house</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Distilled Water&lt;/strong&gt;</td><td>Bibby Scientific Limited</td><td>D4000</td><td>Produced in-house from water still</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Euthatal&lt;/strong&gt;</td><td>Merial&amp;nbsp;</td><td>J01601A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tandem Interferometer TFP-1&lt;/strong&gt;</td><td>JRS Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Freezer&lt;/strong&gt;</td><td>Lec</td><td>TU55144</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Refrigerator&lt;/strong&gt;</td><td>Zanussi</td><td>ZBA15021SA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hot Plate&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88857206</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Clamps&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>241-7311 &amp;amp; 241-7201</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Clamp Stand&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp;241-0093</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Thermometer&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-201-401</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cling Film&lt;/strong&gt;</td><td>Sainsbury&#039;s</td><td>7650540</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Parafilm&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Silicone&lt;/strong&gt;</td><td>IDB Technologies</td><td>N/A</td><td>No catalogue number. Order upon request.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cover Glass&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>631-1571</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Conical Flask&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>214-1175</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Beaker&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>213-0469</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Measuring Cylinder&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>612-3838</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Vial&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>548-0051 &amp;amp; 548-0863</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Petri Dish&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>391-0441</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Scalpel&lt;/strong&gt;</td><td>Swann Morton Ltd</td><td>&amp;nbsp;0914 &amp;amp; 0308</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Diamond Scribe&lt;/strong&gt;</td><td>RS Instruments</td><td>394-217</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Soldering Iron&lt;/strong&gt;</td><td>RS Instruments</td><td>231-5332</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fine Forceps&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>232-0188</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Double Micro-Spatula&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>Various Sizes</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;pH Meter&lt;/strong&gt;</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI-2210-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Orbital Shaker&lt;/strong&gt;</td><td>IKA</td><td>&amp;nbsp;0002819000</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of extracellular matrix protein fibers for brillouin spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

L&#39;apparecchiatura spettroscopia Brillouin utilizzato in questo esperimento (Figura SI-1A) è stata precedentemente descritta. 9 Si impiega una modalità singola 532 nm laser a stato solido con potenza di uscita 76 mW a campione. Una lente acromatica 20 centimetri focalizza la luce laser sul campione e raccoglie la luce diffusa dal campione in una geometria backscattering. Un tandem multipass Fabry-Perot è utilizzato per filtrare la luce diffusa, che viene rilevata da un rilevatore fotodiodo basso rumore. Questo approccio dà contrasto estremamente elevato (circa 120 dB) e la stabilità attraverso l&#39;auto-allineamento piezo-scansione dei etalon. Un polarizzatore e analizzatore vengono introdotti per selezionare la polarizzazione della luce incidente e diffusa. Gli spettri vengono solitamente ottenuta con il polarizzatore mantenuto fisso selezionando la direzione verticale (V) della luce incidente polarizzazione e l&#39;analizzatore selezionando alternativamente verticale (V) or orizzontale (H) in direzione della polarizzazione della luce diffusa. In questa configurazione, modi acustici longitudinali e trasversali vengono rilevati rispettivamente. Un tipico spettro Brillouin ha un intenso picco centrale a causa di diffusione elastica e uno o più insiemi di picchi equamente spostate, o doppietti Brillouin, che sono la firma della meccanica del campione. In queste misurazioni, la luce diffusa può provenire sia da fononi bulk viaggiano quasi-ortogonale al campione e, dopo la riflessione della luce incidente all&#39;interfaccia campione-substrato, da fononi bulk viaggiano parallelamente alla superficie (modalità PS). 9 La figura 2 mostra BLS spettri delle fibre di collagene tripsina-digeriti secchi e idrati ottenuti con VV polarizzazione ad una risoluzione di 0,2 GHz, con una gamma spettrale gratuita di 30 GHz e circa il tempo di raccolta 10 minper ogni spettro. Ogni spettro corrisponde ad un determinato angolo di rotazione, θ (Figura SI-1C). In fibre collagene secco a θ = 0 °, modi longitudinali danno luogo ad un picco massa a (18.92 ± 0.02) GHz mentre la modalità PS è a (9,85 ± 0,03) GHz (Figura 2A). I turni PS picco a frequenze più basse come θ va da 0 ° (fononi sondare l&#39;orientamento assiale della fibra) a 90 ° (fononi sondare l&#39;orientamento radiale), mentre il picco di massa solo leggermente rosso-sposta al variare θ nello stesso intervallo (fonone sondare una direzione quasi-radiale durante la rotazione). In fibre collagene bagnato, i due picchi dovuti alla fononi longitudinali sono sostanzialmente immutato durante l&#39;esperimento, con il picco massa a circa 10,5 GHz e il picco PS a 4,9 GHz (Figura 2B). Questo indica una riduzione dall&#39;80 al 100% in frequenza di picco (relative ai dati di 18.92e 9,85 GHz, rispettivamente), e quindi della rigidità del materiale, a causa di idratazione. Notare che i modi rinfusa e PS di collagene idratato trovano vicino in frequenza per i modi di acqua pura, suggerendo che le sue costanti elastiche sono una combinazione dei contributi acqua e fibre, con un ruolo dominante svolto da acqua. La figura 3 mostra uno spettro di secca fibre collagene tripsina digerito misurato a θ = 30 ° con VH polarizzazione; una perdita della polarizzazione VV permette al PS e picchi di massa per ancora essere osservati. Modi trasversali rappresentano un picco a (4.1 ± 0.2) GHz (θ = 0 °) che leggermente blu-turni i cambiamenti θ da 0 ° a 90 °. risultati Fit sia per la trasversale e picchi di PS sono mostrati anche. Parametri di picco sono stati estratti e velocità delle onde acustiche sono state derivate da V L = v λ / √2, dove <em&gt; v è la frequenza del modo ottenuta mediante analisi della curva-fit dei picchi e λ è la lunghezza d&#39;onda di eccitazione, 532 nm. Si noti che in questa geometria, la conoscenza dell&#39;indice di rifrazione del materiale non è richiesto per ottenere la velocità modalità acustica (grazie alla geometria di scattering, q s = 2 k i sin (Φ); Figura SI-1b, c), quindi rendendo questo approccio particolarmente vantaggioso. La figura 4 è un grafico delle velocità delle onde acustiche ottenuti modi longitudinali e trasversali (picchi PS e T) in funzione della θ angolare . Analisi Adatta ad un modello di esagonale simmetrica solido elastico 7 - Equazioni A1 e A2 sotto - fornisce i cinque componenti del tensore elastico di tipo tripsina-digerito secco collagene fibre (Tabella 1). 9 <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54648/54648eq1.jpg" /> , (A1) <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54648/54648eq2.jpg" /> , (A2) dove ρ è la densità del materiale, ec 11, c 33, c 44 c 13 sono quattro dei cinque costanti elastiche che caratterizzano i sistemi a simmetria esagonale. Il quinto costante, c 12, può essere derivata dalla relazione approssimata c ~ 12 c 11 -. 2 c 44 7 I coefficienti sono simili a quelli precedentemente ottenuti da non purificato fibe collageners. 9 A differenza notevole si verifica per il coefficiente c 13 che si riflette in valori simili dell&#39;elastico moduli E ǁ ed E <img alt="Perpendicolare" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig_flippedT.jpg" /> (Circa 7,2 e 7,7 GPa) per il collagene purificato. La figura 5 è un grafico della velocità longitudinale onda acustica di collagene bagnato rispetto θ . In questo caso, nessun cambiamento periodico in frequenza è osservato, dando una velocità costante entro l&#39;errore. La Figura 6 mostra lo spettro di fibre di elastina secchi e idrati misurati a θ = 0 °. modi trasversali non sono stati rilevati per questi campioni. In elastina secca, il picco di massa si verifica a 16.8 GHz, mentre la modalità PS a 8,2 GHz 9 (13 e 20% inferiore ai corrispondenti picchi di collagene secca). le fibre di elastina Wet presentano una massa peak a (12,30 ± 0,01) GHz (37% più basso in frequenza rispetto al picco di massa di elastina secco). La modalità PS di elastina bagnato non risulta nello spettro causa dell&#39;intenso coda del picco elastica a quelle frequenze. D&#39;altro canto, il picco a circa 7,5 GHz è attribuita all&#39;acqua bulk. La Figura 7 mostra la dipendenza della velocità dell&#39;onda acustica in fibra di elastina asciutto su θ. Da questi dati, i componenti elasticità tensore (e moduli meccanici) sono stati ottenuti (Tabella 1). 9 Come nel collagene bagnato, vi è evidenza di isotropia nel modulo meccanica delle fibre di elastina idrati. Questi risultati indicano come la spettroscopia Brillouin può dare informazioni rilevanti sulla rigidità, composizione e aspetti strutturali di un materiale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig1.jpg" /> Fifigura 1. acustica e fononi ottici a catena unidimensionale di atomi. Schema di vibrazioni acustiche e ottiche in una catena biatomica unidimensionale. Gli atomi hanno massa m 1 e m 2 e si alternano. Le frecce indicano gli spostamenti degli atomi. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54648/54648fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig2.jpg" /> Figura 2. Brillouin spettri di tipo tripsina-purificata collagene fibre di coda di topo tendine. Spectra di (A) di fibra secca e (B) idratata fibra da misure VV ad angolo diverso da all&#39;asse della fibra θ, in gradi. è anche mostrato Uno spettro di acqua distillata pura. Gli spettri sono stati normalizzati all&#39;intensità (altezza) del picco di massa.<html> Le etichette B e PS denotano picchi relativi alla massa e modalità parallela-superficie, rispettivamente. Le barre di errore indicano l&#39;errore standard (radice quadrata del numero di conteggi). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54648/54648fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig3.jpg" /> Figura 3. spettro Brillouin di tipo tripsina-secco purificato collagene fibre di coda di topo tendine. Spectrum da una misura VH a θ = 30 °. Etichette T, PS e B denotano picchi relativi alla trasversale, modalità parallela-superficie e sfusi, rispettivamente. sono mostrati anche i risultati delle analisi in forma utilizzando un modello di oscillatore armonico smorzato (DHO) per entrambe le modalità T e PS. Le barre di errore indicano l&#39;errore standard (radice quadrata del numero di conteggi)./54648fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig4.jpg" /> Figura 4. Trama della velocità delle onde acustiche in collagene tripsina-purificato secco vs angolo all&#39;asse della fibra. Velocità longitudinali e trasversali onde acustiche di fibre collagene secca derivati ​​da analisi in forma dei picchi di Brillouin. I dati sono montati su un modello di esagonale simmetrica solido elastico. Linea rossa: Equazione A1 (R 2 = 0,99); linea blu: Equazione A2 (R 2 = 0,36). Le barre di errore indicano gli errori standard ottenuti dalla radice quadrata degli elementi diagonali della matrice di covarianza, dopo un non lineari Levenberg-Marquardt minimi quadrati di spettri Brillouin. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54648/54648fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare un Versi più grandi</a><html> su questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig5.jpg" /> Figura 5. Trama della velocità delle onde acustiche longitudinali in collagene tripsina-purificato bagnato vs angolo all&#39;asse della fibra. Velocità dell&#39;onda acustica longitudinale delle fibre collagene idratato derivato da analisi in forma dei picchi di Brillouin. La linea indicata è una guida per l&#39;occhio e fornisce il valore medio della velocità dell&#39;onda acustica in questo intervallo. Le barre di errore indicano gli errori standard ottenuti dalla radice quadrata degli elementi diagonali della matrice di covarianza, dopo un non lineari Levenberg-Marquardt minimi quadrati di spettri Brillouin. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54648/54648fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> jpg &quot;/&gt; Figura 6. Brillouin spettri delle fibre di elastina da bovini legamento nucale. Spettri di fibra secca e idratata a θ = 0 °. Gli spettri sono stati normalizzati all&#39;intensità (altezza) del picco di massa. Le etichette B e PS denotano picchi relativi alla massa e modalità parallela-superficie, rispettivamente. B F e B W riferiscono ai picchi di massa di fibra e di acqua, rispettivamente. Le barre di errore indicano l&#39;errore standard (radice quadrata del numero di conteggi). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54648/54648fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig7.jpg" /> Figura 7. Trama della velocità delle onde acustiche longitudinali in elastina secca vs angolo all&#39;asse della fibra. Velocità dell&#39;onda acustica longitudinale secca fib elastinaer derivato da analisi in forma dei picchi di Brillouin. I dati sono montati su un modello di esagonale simmetrica solido elastico. Linea rossa: Equazione A1 9 (R 2 = 0,74). Le barre di errore indicano gli errori standard ottenuti dalla radice quadrata degli elementi diagonali della matrice di covarianza, dopo un non lineari Levenberg-Marquardt minimi quadrati di spettri Brillouin. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54648/54648fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Supplementare Figura 1" src="/files/ftp_upload/54648/54648supfig1.jpg" /> Figura SI-1. Schema del Brillouin set-up e la geometria di scattering BLS. (A) La luce incidente emessa da un laser a stato solido viene inviato al campione attraverso una lente acromatica. La luce diffusa dalla fononi acustici di massa e da quelli derivanti da riflezione di luce alla superficie del substrato, che è in contatto con il campione, viene raccolta dalla lente, filtrato da un tandem-multipasso Fabry-Perot e rivelata da un fotomoltiplicatore. FP1 e FP2 indicano i due interferometri che costituiscono il tandem set-up. Un polarizzatore seleziona la polarizzazione della luce incidente, ed un analizzatore viene usato per selezionare la polarizzazione della luce diffusa. (B) geometria BLS con un esemplare in contatto con la superficie di un substrato di silicio riflettente. Un vetrino (non mostrato) è disposto sopra il campione per sigillare il vano e leggera pressione viene applicata attraverso rilievi agli angoli del substrato. La luce incidente (k i) passa attraverso l&#39;obiettivo, viene rifratta all&#39;interfaccia aria-campione (k &#39;i) e concentrato all&#39;interfaccia campione-substrato. La luce diffusa raccolti dalla stessa lente (K &#39;s) i risultati di interazione sia con i fononi rinfusa (qb) e quelli che viaggiano PS del campione (q s). . Angoli tra le direzioni di luce e la normale alla superficie sono indicati come Φ e Φ &#39;(C) Schema del campione e del sistema di coordinate adottata; z definisce l&#39;asse straordinario parallelo alla direzione delle fibre. Angoli θ e α sono quelli tra la direzione di fononi q s e q b per z -axis rispettivamente k i, k &#39;I, K s, k&#39; s:. Numeri d&#39;onda del incidente e luce diffusa; q b, q s, vettori d&#39;onda del prodotto sfuso e modalità PS, rispettivamente. (Ristampato da ref 9.) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54648/54648supfig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-con-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; Tabella 1. coefficienti del tensore elastico derivati ​​da analisi in forma delle velocità delle onde acustiche coefficienti tensori elastici di secca tipo tripsina-purificata collagene fibre (. questo lavoro) e fibre di elastina (rif 9). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> campione </td><td colspan="2"> coefficienti elastici (GPa) </td></tr><tr><td> collagene tripsina digerito </td><td> c 33 </td><td> 18.7 ± 0.1 </td></tr><tr><td></td><td> c 11 </td><td> 14.4 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> c 44 </td><td> 3.4 ± 0.1 </td></tr><tr><td></td><td> c 12 </td><td> 7.2 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> c 13 </td><td> 11.2 ± 0.3 </td></tr><tr><td> elastina </td><td> c 33 </td><td> 11.5 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> c 11 </td><td> 10.4 ± 0.1 </td></tr><tr><td></td><td> c 44 </td><td> 1.9 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> c 12 </td><td> 6.6 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> c 13 </td><td> 6.8 ± 0.3 </td></tr></tbody></table>

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Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Preparazione della matrice extracellulare fibre proteiche per Brillouin Spettroscopia

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.3K Views.  University of Exeter. We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

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Bioingegneria

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but important bioinstruments capable of testing the force dependence of structural features in proteins. Scale has been a limiting parameter on how accurately researchers can peer into the nanomechanical world of molecules, such as nucleic acids, enzymes, and motor proteins that perform life-sustaining work. Atomic force microscopy (AFM) is well tuned to determine native structures of fibrous proteins with a distance resolution on par with electron microscopy. However, in AFM force studies, the forces are typically much higher than a single molecule might experience 1, 2. Optical traps (OT) are very good at determining the relative distance between the trapped beads and they can impart very small forces 3. However, they do not yield accurate absolute lengths of the molecules under study. Molecular simulations provide supportive information to such experiments, but are limited in the ability to handle the same large molecular sizes, long time frames, and convince some researchers in the absence of other supporting evidence2, 4.
The gravitational force spectrometer (GFS) fills a critical niche in the arsenal of an investigator by providing a unique combination of abilities. This instrument is capable of generating forces typically with 98% or better accuracy from the femtonewton range to the nanonewton range. The distance measurements currently are capable of resolving the absolute molecular length down to five nanometers, and relative bead pair separation distances with a precision similar to an optical trap. Also, the GFS can determine stretching or uncoiling where the force is near equilibrium, or provide a graded force to juxtapose against any measured structural changes. It is even possible to determine how many amino acid residues are involved in uncoiling events under physiological force loads 2. Unlike in other methods where there is extensive force calibration that must precede any assay, the GFS requires no such force calibration 5. By complementing the strengths of other methods, the GFS will bridge gaps in understanding the nanomechanics of vital proteins and other macromolecules.

This is a step-by step guide showing the purpose, operation, and representative results from the novel gravitational force spectrometer.

Dimostrare l&#39;Usi del romanzo Spectrometer forza gravitazionale su Stretch e misura proteine ​​fibrose

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Senza contatto, Label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante Spettroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Writing Bragg Gratings in Multicore Fibers

Fiber Bragg gratings in multicore fibers can be used as compact and robust filters in astronomical and other research and commercial applications. Strong suppression at a single wavelength requires that all cores have matching transmission profiles. These gratings cannot be inscribed using the same method as for single-core fibers because the curved surface of the cladding acts as a lens, focusing the incoming UV laser beam and causing variations in exposure between cores. Therefore we use an additional optical element to ensure that the beam shape does not change while passing through the cross-section of the multicore fiber. This consists of a glass capillary tube which has been polished flat on one side, which is then placed over the section of the fiber to be inscribed. The laser beam enters the fiber through the flat surface of the capillary tube and hence maintains its original dimensions. This paper demonstrates the improvements in core-to-core uniformity for a 7-core fiber using this method. The technique can be generalized to larger multicore fibers.

We describe a technique for inscribing identical fiber Bragg gratings into each core of a multicore fiber. This is achieved by introducing an additional surface into the optical path to mitigate lensing by the curved surface of the fiber cladding.

Scrivendo di Bragg in fibra Multicore

Fiber Bragg gratings in multicore fibers can be used as compact and robust filters in astronomical and other research and commercial applications. Strong ...

Ingegneria

High-speed Continuous-wave Stimulated Brillouin Scattering Spectrometer for Material Analysis

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as aqueous solutions and biomaterials, with fast acquisition times. Here, we discuss the assembly and operation of a Brillouin spectrometer that uses stimulated Brillouin scattering (SBS) to measure stimulated Brillouin gain (SBG) spectra of water and lipid emulsion-based tissue-like samples in transmission mode with &lt;10 MHz spectral-resolution and &lt;35 MHz Brillouin-shift measurement precision at &lt;100 ms. The spectrometer consists of two nearly counter-propagating continuous-wave (CW) narrow-linewidth lasers at 780 nm whose frequency detuning is scanned through the material Brillouin shift. By using an ultra-narrowband hot rubidium-85 vapor notch filter and a phase-sensitive detector, the signal-to-noise-ratio of the SBG signal is significantly enhanced compared to that obtained with existing CW-SBS spectrometers. This improvement enables measurement of SBG spectra with up to 100-fold faster acquisition times, thereby facilitating high spectral-resolution and high-precision Brillouin analysis of soft materials at high speed.

We describe the construction of a rapid continuous-wave-stimulated-Brillouin-scattering (CW-SBS) spectrometer. The spectrometer employs single-frequency diode-lasers and an atomic vapor notch-filter to acquire transmission spectra of turbid/non-turbid samples with high spectral-resolution at speeds up to 100-fold faster than those of existing CW-SBS spectrometers. This improvement enables high-speed Brillouin material analysis.

Ad alta velocità continuo-fluttui stimolato Brillouin Scattering spettrometro per analisi materiali

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

Sintesi enzimatica mediata OaAEP1 e immobilizzazione delle proteine polimerizzate per la spettroscopia a singola molecola

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Biochimica

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Sintesi di nanofibre cheratina-based per Ingegneria Biomedica

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

Alta velocità sub-GHz spettrometro per l&#39;analisi di Brillouin Scattering

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

Produzione di fibre di matrice extracellulare tramite fibra cava sacrificale membrana Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

Adsordimento molecolare indotto dalla luce delle proteine utilizzando il sistema PRIMO per micro-patterning per studiare le risposte cellulari alle proteine a matrice extracellulare

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Preparazione della matrice extracellulare fibre proteiche per Brillouin Spettroscopia

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Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

Dimostrare l'Usi del romanzo Spectrometer forza gravitazionale su Stretch e misura proteine fibrose

Senza contatto, Label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante Spettroscopia Raman

Scrivendo di Bragg in fibra Multicore

Ad alta velocità continuo-fluttui stimolato Brillouin Scattering spettrometro per analisi materiali

Sintesi enzimatica mediata OaAEP1 e immobilizzazione delle proteine polimerizzate per la spettroscopia a singola molecola

Sintesi di nanofibre cheratina-based per Ingegneria Biomedica

Alta velocità sub-GHz spettrometro per l'analisi di Brillouin Scattering

Produzione di fibre di matrice extracellulare tramite fibra cava sacrificale membrana Cell Culture

Adsordimento molecolare indotto dalla luce delle proteine utilizzando il sistema PRIMO per micro-patterning per studiare le risposte cellulari alle proteine a matrice extracellulare

Preparazione della matrice extracellulare fibre proteiche per Brillouin Spettroscopia

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Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

Dimostrare l'Usi del romanzo Spectrometer forza gravitazionale su Stretch e misura proteine ​​fibrose

Senza contatto, Label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante Spettroscopia Raman

Scrivendo di Bragg in fibra Multicore

Ad alta velocità continuo-fluttui stimolato Brillouin Scattering spettrometro per analisi materiali

Sintesi enzimatica mediata OaAEP1 e immobilizzazione delle proteine polimerizzate per la spettroscopia a singola molecola

Sintesi di nanofibre cheratina-based per Ingegneria Biomedica

Alta velocità sub-GHz spettrometro per l'analisi di Brillouin Scattering

Produzione di fibre di matrice extracellulare tramite fibra cava sacrificale membrana Cell Culture

Adsordimento molecolare indotto dalla luce delle proteine utilizzando il sistema PRIMO per micro-patterning per studiare le risposte cellulari alle proteine a matrice extracellulare

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