Name: fluorescence time-lapse imaging of the complete s. venezuelae life cycle using a microfluidic device
Uploaded: 2016-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
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The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).

1. Isolamento di Fresh S. venezuelae spore e Preparazione del terreno di coltura esaurito <ol><li> Seminare 30 ml maltosio-Yeast Extract-estratto di malto (MYM) medio, integrato con 60 microlitri R2 soluzione oligoelemento (TE), con 10 microlitri spore di tensione SV60 [ATTB φ BT1 :: pSS209 (P divIVA - divIVA-mCherry P FtsZ -ftsZ-ypet)]. Per la crescita costante e sporulazione delle cellule, utilizzare un pallone confuso o un pallone che contiene una molla per consentire una sufficiente aerazione. </li><li> cellule di coltura per 35-40 ore a 30 ° C e 250 rpm. </li><li> Esaminare le cellule di liquido montato microscopio a contrasto di fase. A questo punto frammenti e spore micelio saranno visibili. </li><li> Centrifuga 1 ml cellule in una centrifuga da tavolo a 400 xg per 1 minuto per far sedimentare il micelio e frammenti di cellule più grandi. </li><li> Trasferire circa 300 microlitri surnatante containing una sospensione di spore in una nuova provetta da 1,5 ml e tenere in ghiaccio. Tenere il terreno di coltura per la restante fase 1.7. </li><li> Diluire spore 1:20 in MYM-TE (concentrazione finale: 0,5-5 x 10 7 spore / ml) e tenere in ghiaccio fino al momento (vedi punto 2.3). Nota: Anche se le esatte condizioni che scatenano sporulazione in Streptomyces non sono compresi, utilizzando speso medio MYM-TE, comprese le eventuali segnali extracellulari sconosciuti da una cultura sporulanti, stimola la sporulazione. </li><li> Filtro-sterilizzare 10 ml di terreno di coltura residuo per ottenere speso MYM-TE che è libero di spore e frammenti di micelio. Utilizzare un filtro siringa da 0,22 micron sterile e trasferimento trascorso MYM-TE a una provetta sterile 15 ml. </li><li> Tenere il preparato speso MYM-TE per alcuni giorni a 4 ° C, se gli esperimenti aggiuntivi utilizzando le condizioni di crescita simili devono essere effettuate. </li></ol> 2. Preparazione del dispositivo a microfluidi Nota: ogni pla microfluidicate permette fino a quattro esperimenti indipendenti da effettuare. Per evitare la contaminazione delle camere di flusso non utilizzati, usare soluzioni sterili e le condizioni di lavoro quando si imposta un esperimento. <ol><li> Rimuovere soluzione di spedizione dalla piastra microfluidica e lavare i pozzetti con sterili MYM-TE. </li><li> Aggiungere 300 ml MYM-TE a presa bene 1 e 300 ml speso MYM-TE per pozzi da 2 a 6. </li><li> Caricare 40 ml diluiti spore dal punto 1.6 a carico delle cellule ben 8 di corsia &quot;A&quot; e sigillano il collettore alla piastra secondo le istruzioni produce. </li><li> Avviare il software di controllo microfluidica, selezionare il tipo di piatto appropriato e impostare un programma di flusso per innescare il canale di flusso e la camera di cultura da parte di media che scorre da pozzi di ingresso da 1 a 5 a 6 psi per 2 minuti per pozzetto. </li><li> Nel software di controllo microfluidica, creare un protocollo di flusso per l&#39;esperimento: scorre MYM-TE dal bocchettone 1 per 6 ore per consentire la germinazione e la crescita vegetativa delle cellule. Interruttorepoi perfusione trascorso MYM-TE da ben 2 a 5 per il tempo rimanente dell&#39;esperimento. Nel corso dell&#39;esperimento mantenere costante la pressione di flusso a 6 psi (corrispondenti a circa 9 microlitri medio / hr). Avviare il programma di flusso dopo la fase 3.5. </li></ol> 3. Impostazione del microscopio e il protocollo Time-lapse Nota: Questo metodo è stato implementato su un microscopio invertito widefield completamente motorizzato e automatizzato dotato di una fotocamera sCMOS, una lampada ad alogenuri metallici, una messa a fuoco automatica dell&#39;hardware, un supporto palcoscenico per 96 pozzetti e una camera climatica. <ol><li> Pre-riscaldare la camera ambientale di 30 ° C in anticipo per evitare problemi con l&#39;autofocus dopo l&#39;inizio dell&#39;esperimento. Il tempo richiesto dipende dalla camera ambientale usato, il microscopio e il sistema di riscaldamento. Iniziare a riscaldare il sistema la notte prima dell&#39;esperimento. </li><li> Accendere il microscopio e l&#39;automazione e il controllo microscopio softwari. Utilizzare un&#39;alta apertura numerica (NA) obiettivo ad immersione per la raccolta ottimale del segnale e risoluzione spaziale, come ad esempio un 100X, 1.46 olio NA obiettivo DIC. Selezionare filtri appropriati e specchi bicrome di acquisire differenziale di contrasto interferenze immagini (DIC) e le immagini di fusioni di proteine ​​di colore giallo-fluo e rosso-fluorescenti. </li><li> Mettere una goccia di olio di immersione sul oggettivo e aggiungere liquido di immersione al fondo della finestra di imaging sulla piastra microfluidica per migliorare cell-focus durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. montare con attenzione il dispositivo di microfluidica sigillata (passo 2.5) sul palco del microscopio invertito. Assicurarsi che la piastra sia posizionato correttamente nel supporto fase e non si sposta nel corso dell&#39;esperimento. </li><li> Portare la finestra di imaging della camera di cultura microfluidica a fuoco utilizzando gli indicatori di posizione integrati per l&#39;orientamento. Primo sulla parte sinistra della prima camera di flusso (etichetta &quot;A&quot;) con la dimensione trap 5, corrispondenti aun&#39;altezza trappola di 0,7 micron. </li><li> Nel software microfluidica, celle di carico dal bocchettone 8 a 4 psi per 15 sec. Controllare la densità delle cellule nella camera di coltura spostando la fase attraverso la finestra di imaging. Se non spore sono stati intrappolati, ripetere la fase di caricamento delle cellule oppure aumentare la pressione e / o il tempo di caricamento fino a raggiungere la densità cellulare desiderato (1-10 spore per finestra di imaging con 2.048 x 2.048 pixel). Evitare di sovraccaricare la camera di cultura. Nota: normalmente si usa dimensioni trappola 5 per l&#39;imaging Streptomyces, ma abbiamo anche ottenuto buoni risultati con la trappola grandezze 4 e 3. Consultare il manuale del fornitore per ulteriori suggerimenti su come ottimizzare il processo di caricamento delle cellule. </li><li> Avviare il programma di flusso nel software di controllo dal punto 2.5 e lasciare che la piastra microfluidica per riscaldare-stabilizzi per 1 ora in fase di microscopio prima di avviare l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. </li><li> Nel software di controllo del microscopio, impostare una acquisizione multi-dimensionale di prendere muimmagini ltiple a più posizioni di scena nel corso del tempo: <ol><li> Per Salvataggio automatico: specificare la directory per il salvataggio automatico dei file di immagine. </li><li> Per le impostazioni di illuminazione, determinare le impostazioni di illuminazione ottimali per ogni costrutto specifica in anticipo. Per l&#39;esperimento descritto, utilizzare i seguenti tempi di esposizione: DIC 150 msec, YFP 250 msec, RFP 100 msec. </li><li> Per Time-series: impostare una serie di tempo per acquisire le immagini in corrispondenza dei punti di tempo desiderato in sequenza. Per l&#39;imaging del ciclo di vita di S. venezuelae, selezionare un intervallo di tempo di 40 minuti per un periodo di 24 ore. </li><li> Per le posizioni di scena e messa a fuoco automatica: scansione della camera di cultura spostando le posizioni palco e palco negozio per ogni posizione di imaging di interesse. Assicurarsi che le singole posizioni stadio si trovano sufficientemente a parte per ridurre al minimo photobleaching e phototoxicity.Typically utilizzano fino a 12 posizioni. routine di messa a fuoco automatica Eseguire per ogni punto di tempo per correggere la deriva focale lento. Se disponibile nel software di controllo del microscopio, La strategia messa a fuoco automatica è impostato su &quot;aggiornamento superficie locale messa a fuoco automatica dell&#39;hardware&quot;. Una volta che le Z-coordinate delle posizioni stadio selezionato sono verificate, attivare la messa a fuoco automatica dell&#39;hardware. </li></ol></li><li> Avviare l&#39;esperimento time-lapse nel software di controllo del microscopio. </li><li> Verificare che tutte le posizioni di scena sono ancora a fuoco nei punti successivi. Per gli esperimenti time-lapse in esecuzione su diverse ore, occasionalmente osserviamo una deriva palco anche quando si utilizza l&#39;autofocus. Se le posizioni fase devono essere riorientato, interrompere l&#39;esperimento in un punto momento opportuno, regolare il fuoco e riavviare l&#39;esperimento entro l&#39;intervallo di tempo di imaging definito (punto 3.7.3). Vedere il punto 4.3 per come concatenare le serie storiche. </li><li> Smettere di acquisizione delle immagini dopo 24-30 ore o quando le ife nella regione di interesse sono differenziate in spore (vedi DIC serie di immagini). Fermare il programma di flusso nel software e smontare il dispositivo a microfluidi. </li><li> Preparare piatto microfluidica utilizzato per sto a breve terminerabbia. Rimuovere restante MYM-TE e ha trascorso MYM-TE da ben 1 a 6, ben rifiuti vuoto 7 e il caricamento delle cellule ben 8. In condizioni sterili, ri-riempire pozzi di corsia &quot;A&quot; e pozzi di piste non utilizzati ( &quot;B&quot; utilizzato per &quot;D&quot;) sulla piastra con sterile tampone fosfato (PBS). Sigillare la piastra con parafilm per evitare che si secchi e conservare a 4 ° C. </li></ol> 4. Generazione di Time-lapse film usando Fiji Software Nota: Prendiamo atto che diversi pacchetti software commerciali e di connessione sono a disposizione per elaborare le immagini di microscopia time-lapse compreso ZenBlue, Metamorph, ICY, ImagePro o ImageJ. Qui ci concentriamo su Fiji, che è un programma di elaborazione delle immagini open-source basata su ImageJ, e che già fornisce una serie di utili plug-in preinstallati. <ol><li> dati di imaging trasferimento dal vostro esperimento time-lapse a un computer che ha installato Fiji. </li><li> Avviare il programma e importare il file di immagini utilizzando &amp;# 34; File&gt; Importa&gt; Bio-formati &quot;. O semplicemente trascinando il file di immagini in Fiji In&quot;-Formati Bio opzioni di importazione &quot;, spuntare la casella&quot; canali Split &quot;per ottenere una pila di un&#39;immagine separata per ogni canale illuminazione (DIC , RFP, YFP). </li><li> Opzionale: Per unire serie temporale separata risultante da una pausa nel nella acquisizione delle immagini a causa della rifocalizzazione (passo 3.9), aprire rispettive pile di immagini ed eseguire &quot;Immagine&gt; Stack&gt; Strumenti&gt; concatenare&quot; per ciascun canale (DIC, RFP, YFP ). </li><li> Valutare la qualità dei dati time-lapse scorrendo le pile di immagini. Cercare ife che rimase a fuoco nel corso del tempo, spettacolo crescita del micelio e, infine, formare spore (DIC stack). Esaminare la localizzazione subcellulare prevista per DivIVA-mCherry a punte ifali (stack RFP) e FtsZ-YPet formando anelli singoli o multipli, strutture scala simili a vegetativa o sporigeni ife (stack YFP), rispettivamente. </li><li> Isolare una regione di interesse per i Processi a valleng delle immagini. Time-lapse microscopia spesso produce file di grandi dimensioni, che possono rallentare l&#39;elaborazione da parte Fiji. Si raccomanda pertanto di identificare e isolare una regione di interesse (ROI) e per eseguire ulteriori fasi di elaborazione dell&#39;immagine in questa versione più piccola della serie di immagini. <ol><li> Selezionare lo strumento &quot;rettangolare Selezione&quot; nel menu e disegnare una ROI rettangolare nella serie di immagini DIC in modo tale che le ife sviluppo sono racchiusi dalla ROI tutta la serie di immagini. </li><li> Duplicate ROI-stack con &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li> Fare clic sulla barra nome della pila di immagini YFP e selezionare &quot;Modifica&gt; Selezione&gt; Ripristina Selezione&quot; nel menu per ripristinare la precedente selezione rettangolare dall&#39;originale DIC impilare allo stesso positon nello stack YFP e duplicare il ROI con &quot;Ctrl&quot; + &quot;shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li> Ripetere questo processo per lo stack RFP. </li></ol></li><li> Allineare le immagini nell&#39;immagine tre pile to rimuovere le derive di scena nel piano xy nel corso del tempo. Scorrere fino all&#39;ultimo fotogramma nella pila DIC e selezionare &quot;Plugin&gt; Registrazione&gt; StackReg&gt; RigedBody&quot; dal menu. Ripetere questo passaggio per la richiesta di offerta e la serie di immagini YFP. Se necessario, ritagliare il ROI ripetendo il passaggio 4.5.1-4.5.3. </li><li> Optional: Regolare la luminosità e il contrasto manualmente per ogni pila di immagini con il &quot;regolare luminosità e contrasto Tool&quot; ( &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;C&quot;), oppure selezionare &quot;Processo&gt; Migliora contrasto&quot; dal menu e applicare il &quot;normalizzare&quot; comando per tutte le immagini nella pila. Va osservato che quest&#39;ultimo comando alterare i valori di pixel e può quindi influenzare analisi dell&#39;immagine valle. </li><li> Opzionale: Combinare le singole pile (convertiti nel formato di file RGB, vedi 4.11) orizzontalmente o verticalmente utilizzando il plug-in &quot;Immagine&gt; Stack&gt; Strumenti&gt; Combine&quot;. </li><li> Aggiungere una barra di scala ( &quot;Analizza&gt; Strumenti&gt; Scala Bar&quot;) e una matrice di tempo (&amp;# 34; immagine&gt; Stack&gt; Tempo Stamper &quot;). </li><li> Salva pile di immagine modificati come una sequenza di immagini nel formato &quot;.tiff&quot;. Per produrre un film, salva come &quot;.avi&quot;. In alternativa, serie di immagini di esportazione in formato QuickTime con il &quot;Bio-Formati&gt; Bio-Formati Exporter&quot; plug-in e selezionare il tipo di file &quot;.mov&quot;. </li><li> Per ottenere immagini da singoli fotogrammi, selezionare il frame di interesse e duplicare l&#39;immagine &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. Cambiare il tipo di immagine risultante in &quot;RGB&quot; o &quot;8-bit&quot; sotto &quot;Immagine&gt; Tipo&gt; colore RGB o 8-bit&quot; e salvare l&#39;immagine come &quot;.tiff&quot;. Nota: Fiji offre una serie di funzioni aggiuntive per annotare ulteriormente o serie processo di time-lapse. Vai a supporto online Fiji per informazioni dettagliate (http://fiji.sc/Fiji). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Time-lapse microscopia del ciclo di vita Streptomyces è tecnicamente impegnativo in passato. Qui vi presentiamo un protocollo robusto per eseguire l&#39;imaging dal vivo di cellule del ciclo di vita completo utilizzando fusioni proteina fluorescente al marcatore DivIVA polarità delle cellule e la proteina divisione cellulare FtsZ per aiutare a visualizzare e tracciare la progressione attraverso il programma di sviluppo (Figura 2). Al centro di questo metodo è la coltivazione di S. venezuelae in un dispositivo a microfluidi che permette costante perfusione media e lo scambio di normale mezzo di crescita (MYM-TE) con il mezzo trascorso (speso MYM-TE). Il cambio di condizione di cultura è importante per il protocollo descritto perché la scalata nutrizionale come pozzi come eventuali segnali extracellulari ancora non identificati (ad esempio il quorum sensing segnali) nel terreno di coltura speso, promuovere la sporulazione, mentre una fornitura continua di media ricchi di nutrienti stimola growt vegetativoh con quasi nessuna formazione di spore (dati non riportati). Così, coltura di cellule in questo sistema microfluidico è superiore alla coltura di cellule in agarosio in quanto offre la flessibilità più sperimentali e consente il monitoraggio a lungo termine delle variazioni di crescita batterica in risposta alle mutevoli condizioni di coltura. Sebbene le piastre microfluidica sono progettati per uso singolo, flusso canali che non sono stati inoculati con cellule possono essere utilizzati in esperimenti successivi. Si consiglia di utilizzare tutti i canali di una piastra microfluidica entro una settimana, come abbiamo sperimentato problemi di tenuta del collettore di piatti che sono stati aperti per tempi più lunghi. Quando si imposta un esperimento, abbiamo scoperto che le spore preparate al momento germinati entro due ore di essere caricati nella camera di flusso, mentre le spore provenienti da uno stock di glicerolo congelato necessari almeno 6 ore prima di tubi germinali sono emersi (dati non riportati). Questo ritardo nella germinazione estende la durata dell&#39;esperimento e può interferire condisponibilità di attrezzature e condizioni sperimentali. E &#39;anche importante iniziare l&#39;esperimento con perfusione di MYM-TE per almeno 3 ore per fornire nutrienti sufficienti per lo sviluppo e la conseguenza di tubi germinali. Perfusione con MYM-TE può essere esteso al di là della iniziale di 3 ore se l&#39;esperimento è stato progettato per studiare la crescita vegetativa. Mentre spore forniscono la scelta preferita di materiale di partenza, frammenti breve ifali possono essere caricati nella piastra microfluidica. Tuttavia, l&#39;efficienza di carico quando si utilizza micelio tosato è significativa più bassa e spesso richiede diversi percorsi di carico che possono presentare una limitazione in sede di esame mutanti non sporulanti. Indipendentemente dal tipo di inoculo utilizzato, è importante non sovraccaricare la camera di coltura con spore o frammenti ifali come questa di una rapida sovraffollamento che possono interferire con la diffusione multimediale e complicare analisi dell&#39;immagine. È importante pianificare la costruzione di proteine ​​reporter carefully per l&#39;uso della fluorescenza time-lapse imaging in Streptomyces. Lunghezza Linker tra la proteina bersaglio e il reporter fluorescente e la scelta di N- o fusioni C-terminale può essere critico. Inoltre, le condizioni sperimentali ottimali, tra cui la frequenza delle immagini e il tempo di esposizione, devono essere determinati in anticipo per ogni proteina fluorescente-tag. S. venezuelae ife mostra auto-fluorescenza nel verde dei canali / giallo che può diventare problematico quando l&#39;imaging una proteina fluorescente che si esprime a livelli bassi. Inoltre, si deve notare che, durante la germinazione e la fase di crescita vegetativa iniziale, S. venezuelae è particolarmente sensibile alla luce a breve lunghezza d&#39;onda (ad esempio quando si utilizza fusioni di proteine ​​per PCP). Nonostante i continui progressi nelle tecniche di imaging e di sistemi reporter fluorescente per l&#39;imaging dal vivo di cellule di batteri, la maggior parte dei pacchetti software (ad esempio MicrobeTracker, Schnitzelcells, CellProfiler) per un successivo trattamento automatizzato di questi tipi di insiemi di dati non supportano l&#39;analisi di immagini derivate da batteri filamentosi con uno stile di vita pluricellulare 27-29. Pertanto, vi è la necessità di sviluppare un algoritmo adatto per l&#39;analisi quantitativa ad alta produttività dei dati di imaging di Streptomyces e altri batteri filamentosi. In sintesi, il lavoro descritto qui dimostra l&#39;immenso potenziale di S. venezuelae come un nuovo sistema di sviluppo di modello per il genere, a causa della sua capacità di sporulare in liquido. Il dispositivo di coltura microfluidica è semplice da usare anche per gli utenti meno esperti. Esso fornisce una piattaforma eccellente per studiare i processi biologici cellulari centrali al ciclo di vita Streptomyces, tra cui localizzazione dinamica delle proteine, la crescita polarizzata, e la differenziazione morfologica di un micelio multicellulare in catene di spore unigenomic. Inoltre questo sperimentale u setp fornisce anche un punto di partenza allettante per indagare gli eventi nello sviluppo che richiedono alternano condizioni di coltura, o l&#39;uso di coloranti fluorescenti come acidi fluorescenti D -ammino per monitorare sintesi del peptidoglicano o ioduro di propidio e 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per visualizzare l&#39;organizzazione dei cromosomi 30,31.

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Mark Buttner
to:
Mark J. Buttner

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The middle initial J. has been added to author Mark Buttner.

Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomycetes sono batteri che vivono nel suolo che sono caratterizzati da un ciclo di sviluppo complesso che coinvolge la differenziazione morfologica da un multicellulare, nutriente-lavaggio micelio di dormienti, spore unigenomic 1-3. In condizioni di crescita favorevoli, una spora tipici Streptomyces comincia a germinare estrudendo uno o due tubi germinali (Figura 1). Questi tubi allungare per estensione punta e crescono in una rete ramificata ifale conosciuto come il micelio vegetativo. la crescita polare e ifale ramificazione è diretto dal DivIVA essenziale delle proteine. Questa proteina coiled-coil è parte di un grande complesso citoplasmatico chiamato polarisome, che è cruciale per l&#39;inserimento di nuovo materiale dell&#39;involucro cellulare sulla punta estendentesi 4-7. Durante la crescita vegetativa, i filamenti ifali diventano compartimentato dalla formazione infrequente dei cosiddetti trasversali pareti 8. La formazione di queste pareti trasversali ri<html> quaderni FtsZ, la tubulina, come le proteine ​​del citoscheletro che è essenziale per la divisione cellulare nella maggior parte dei batteri 9. In Streptomyces, tuttavia, questi vegetative trasversali pareti non portano ad costrizione e cellula-cellula separazione e quindi la massa miceliari rimane come una rete di compartimenti sinciziale interconnessi. In risposta alla limitazione di nutrienti e altri segnali che non sono ben compresi, ife aerea specializzata staccarsi dal micelio vegetativo e crescere in aria 3. La costruzione di queste strutture avvia la fase riproduttiva dello sviluppo, durante la quale il lungo ife aeree multi-genomica diventare diviso in decine di uguali dimensioni compartimenti prespore unigenomic. Questo massiccio evento divisione cellulare è guidato dalla costrizione sincrono di anelli multipli FtsZ all&#39;interno singolo 2,10 ife sporigeni. differenziazione morfologica si completa con il rilascio di dormienti, spore, pigmentate spesse pareti. t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig1.jpg" /> Figura 1:. Il ciclo di vita Streptomyces su supporti solidi Questo è un modello del ciclo di vita basata su studi classici di S. coelicolor crescita su piastre di agar. Lo sviluppo cellulare di una spora inizia con la formazione di uno o due tubi germinali, che crescono per estensione punta per formare una rete di ramificazione ife. la crescita polare e la ramificazione delle ife vegetativo è diretto da DivIVA (rosso). La formazione di vegetative incrociati pareti richiede FtsZ (verde). In risposta alle limitazioni di nutrienti e altri segnali, ife aeree sono erette. Arresto della crescita aerea è strettamente coordinato con il montaggio di una scala di FtsZ-ring, che danno luogo alla setti sporulazione che compartimenti stagni le ife sporigeni in compartimenti prespore scatolari. Questi comparti assemblare un muro di spore di spessore e sono alla fine Released spore pigmentate come maturi. I principali eventi di sviluppo del ciclo di vita Streptomyces sono ben caratterizzati 1,3. Tuttavia, ciò che è ancora scarse sono studi sulle cellule biologiche che utilizzano la fluorescenza time-lapse microscopia a fornire una conoscenza dei processi alla base subcellulari differenziazione, come ad esempio le dinamiche di localizzazione della proteina, il movimento dei cromosomi e la divisione cellulare evolutivamente controllata. Live-cell imaging di sviluppo Streptomyces è difficile a causa della complessità del ciclo di vita e le caratteristiche fisiologiche dell&#39;organismo. Precedenti studi sulla crescita vegetativa e le fasi iniziali di sporulazione septation hanno impiegato camere di imaging ossigeno-permeabile, o la crescita agarosio supportata di Streptomyces coelicolor su un palco microscopio 11-15. Questi metodi, tuttavia, sono limitati da una serie di fattori. Alcuni sistemi consentono solo di imaging a breve termine di una crescita cellulareproteine ​​fluorescenti D Prima cellule soffrono di apporto di ossigeno insufficiente o crescere fuori del piano focale dovuta al modello tridimensionale di sviluppo ifale. Nei casi in cui l&#39;imaging a lungo termine è possibile, coltivando le cellule sui rilievi agarosio limiti di flessibilità sperimentale perché le cellule non possono essere esposti a condizioni di crescita o di stress alternativi, e la fluorescenza di fondo dalla media delle pastiglie agarosio limita fortemente la possibilità di monitorare a fluorescenza più debole segnali. Qui si descrive un protocollo per live-cell imaging del ciclo di vita completo Streptomyces con ottima precisione e sensibilità. Con crescente Streptomyces in un dispositivo microfluidica collegato ad un microscopio a fluorescenza widefield (figura 2), siamo ora in grado di monitorare la germinazione, crescita vegetativa e la sporulazione septation per un periodo di tempo fino a 30 ore. Questo è notevolmente facilitata dall&#39;utilizzo dei nuovi Streptomyces organismo modello </em&gt; venezuelae perché sporulates al di completamento nella cultura sommersa e quindi supera la limitazione della specie modello classico S. coelicolor, che sporulates solo su terreni solidi 16-20. Per aiutare a visualizzare la crescita vegetativa e la sporulazione, abbiamo co-Express fluorescente tagged versioni del marcatore DivIVA polarità cellulare e la chiave di proteine ​​divisione cellulare FtsZ. Stiamo utilizzando un dispositivo di microfluidica disponibile in commercio che è stato impiegato con successo per micobatteri, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis e lievito 21-25. Il sistema intrappola cellule in un unico piano focale e permette il controllo di perfusione continua di terreno di coltura da diversi serbatoi. Nel protocollo dettagliato approfittiamo di questa funzione per esporre S. venezuelae micelio vegetativo ad una scalata nutrizionale per promuovere la sporulazione. Il protocollo deScribed è per l&#39;imaging dal vivo di cellule di tutto il ciclo di vita Streptomyces, ma le condizioni di media alternativi o le impostazioni del microscopio può essere scelto se specifici stadi di sviluppo sono di particolare interesse. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig2.jpg" /> Figura 2: Schema che descrive il flusso di lavoro sperimentale. Vengono visualizzati i tre passaggi principali descritti nel protocollo. Innanzitutto, spore e mezzo trascorso sono preparati da una cultura fase stazionaria. In secondo luogo, le spore freschi vengono caricati in un sistema di microfluidica e S. venezuelae viene esposta in tutto il suo ciclo di vita di sviluppo utilizzando un microscopio invertito completamente automatica con camera di incubazione a mantenere una temperatura di crescita ottimale. In terzo luogo, la serie di time-lapse ottenuto viene analizzato ed elaborati utilizzando il software open-source Fiji.

<table><tbody><tr><td>B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells</td><td>Merck-Millipore</td><td>B04A-03-5PK</td><td>Microfluidic culture plates</td></tr><tr><td>CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2)</td><td>Merck-Millipore</td><td>EV-262</td><td>The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Fully automated and motorized inverted widefield microscope</td></tr><tr><td>Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2</td><td>Zeiss</td><td>411857-9061-000</td><td>Environmental chamber surrounding the microscope</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>Ocra FLASH 4 V2</td><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Illuminator HXP 120V</td><td>Zeiss</td><td>423013-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>FL Filter Set 46 HE YFP shift free</td><td>Zeiss</td><td>489046-9901-000</td><td>Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm</td></tr><tr><td>FL Filter Set 63 HE RFP shift free</td><td>Zeiss</td><td>489063-0000-000</td><td>Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm</td></tr><tr><td>Mounting frame K-M for multiwell plates</td><td>Zeiss</td><td>000000-1272-644</td><td>Stage holder for microfluidic plate</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012</td><td>Zeiss</td><td>410135-1002-120</td><td>Microscope control software</td></tr><tr><td>ZEN Module Time Lapse</td><td>Zeiss</td><td>410136-1031-110</td><td>Software module to set up time-lapse microscopy experiments</td></tr><tr><td>ZEN Module Tiles/Positions</td><td>Zeiss</td><td>410136-1025-110</td><td>Software module to save specific stage positions (xzy)</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>open-source software package</td><td>&lt;u&gt;http://fiji.sc/Fiji&lt;/u&gt;</td><td>Generation of time-lapse movies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 4 g Maltose&lt;br/&gt; 4 g Yeast extract&lt;br/&gt; 10 g Malt extract&lt;br/&gt; add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving</td><td></td><td></td><td>Sporulation medium used to culture &lt;em&gt;S. venezuelae&lt;/em&gt; SV60</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;R2 Trace element solution (TE)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 8 mg ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 40 mg FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;B&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;-10H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;Mo&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;24&lt;/sub&gt;-4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; add 200 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; Autoclave and store at 4 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td><td></td><td></td><td>Add 0.002 volumes to MYM</td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline)</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage.</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m syringe filters</td><td>Satorius stedim</td><td>16532-K</td><td>Preparation of spent MYM-TE</td></tr><tr><td>SV60</td><td>John Innes Centre strain collection</td><td></td><td>&lt;em&gt;S. venezuelae&lt;/em&gt; strain expressing &lt;em&gt;divIVA-mcherry&lt;/em&gt; and &lt;em&gt;ftsZ-ypet&lt;/em&gt;</td></tr></tbody></table>

fluorescence time-lapse imaging of the complete s. venezuelae life cycle using a microfluidic device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

Il live-cell imaging di successo di tutta la S. venezuelae ciclo di vita produce una serie temporale continuo, compresa la chiave fasi di sviluppo di germinazione, crescita vegetativa e sporulazione (Figura 3, Film 1). Visualizzazione della progressione attraverso il ciclo di vita viene ulteriormente rafforzata dalla localizzazione subcellulare distinto di DivIVA-mCherry e FtsZ-YPet. Durante la germinazione e la crescita vegetativa, DivIVA-mCherry accumula esclusivamente alle punte ifali crescita o marchi di nuova formazione punti di diramazione (Figura 4A). Questi risultati sono in linea con il posizionamento subcellulare precedentemente riportato di DivIVA 12,26. Al contrario, FtsZ-YPet forma singole strutture ad anello simile a intervalli irregolari nel crescente micelio (Figura 4B). Queste strutture forniscono l&#39;impalcatura per la sintesi di non costrittiva vegetative incrociati pareti, portando alla formazione di interconnette scomparti ifali 8. La differenziazione cellulare di crescere ife in ife sporigeni diventa visibile dalla scomparsa polare foci DivIVA-mCherry, l&#39;arresto della crescita polare e l&#39;aumento concomitante di FtsZ-YPet fluorescenza (Figura 4C). In sporulanti ife, il modello di localizzazione di FtsZ-YPet cambia radicalmente; primi elicoidale filamenti FtsZ-YPet cadere lungo la ifa e poi, in un improvviso evento, quasi sincrono, queste eliche si fondono in una scala di anelli FtsZ-YPet intervalli regolari. Nelle condizioni sperimentali qui descritte, queste scale FtsZ-YPet uniformemente distribuiti persistono per circa 2 ore. Infine, la sporulazione setti diventare visibile nelle contrasto interferenziale differenziale (DIC) immagini (Figura 4D) e, infine, le nuove spore vengono rilasciati. Il successivo protocollo che descrive l&#39;elaborazione delle immagini utilizzando il software Fiji fornisce come<html> TEP-by-step spiegazione di come produrre un film per la pubblicazione della serie time-lapse acquisita (Film 1). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig3.jpg" /> Figura 3: Istantanee da un rappresentante di fluorescenza time-lapse serie di microscopia di S. venezuelae producendo fluorescente FtsZ (verde) e DivIVA (rosso) sono riportati fotogrammi selezionati delle immagini fuse (pannello superiore: RFP-YFP-DIC, pannello inferiore: DIC). visualizzazione del ciclo di vita Streptomyces tra cui la germinazione, crescita vegetativa e la sporulazione. Le immagini sono state prese da film 1. Il tempo è in h: min. Scala bar = 5 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53863/53863fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> d / 53863 / 53863fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4: Risultati rappresentativi per una serie time-lapse con successo il ciclo di vita Streptomyces (A) Localizzazione di DivIVA-mCherry.. vengono riportati istantanee di due successivi punti temporali da Film 1 con immagini unite della richiesta di offerta e canali DIC. DivIVA-mCherry segna nuovi siti filiali ifale (testa freccia piena) e localizza sulla punta ifale per dirigere la crescita polare (aperto punta di freccia). Barra di scala = 10 micron (B) FtsZ-YPet localizzazione durante la crescita vegetativa (punta di freccia). FtsZ-YPet forma strutture ad anello-come singoli (pannello superiore) che non restringono (DIC, pannello inferiore). (C) FtsZ-YPet (verde) di localizzazione durante la sporulazione septation. foci DivIVA-mCherry sono mostrati in rosso, con il tempo trascorso illustrato di seguito (h: min). barra della scala: 5 micron. (D) corrispondenti immagini DIC della ife sporulanti da (C) che mostra la formazione di compartimenti prespore con setti sporulazione visibile (immagine a sinistra), che alla fine maturano in una catena di spore (immagine a destra). Il tempo è in h: min. Scala bar = 5 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53863/53863fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Frame da Film 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863mov1.jpg" /> Film 1: Time-lapse serie microscopia a fluorescenza delle Streptomyces venezuelae ciclo di vita Il film è composto da immagini unite RFP-YFP (a sinistra) e le immagini corrispondenti contrasto interferenziale differenziale (DIC) (a destra).. DivIVA-mCherry è mostrato in rosso e FtsZ-YPet in verde. L&#39;intervallo di tempo tra singoli fotogrammi è di 40 min. Barra di scala = 10 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53863/movie1.mov" target="_blank">Cliccate qui per vedere Thi</a>s film.

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Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Fluorescenza Time-lapse imaging del Complete<em&gt; S. venezuelae</em&gt; Ciclo di vita Uso di un dispositivo a microfluidi

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

13.8K Views.  John Innes Centre, Norwich Research Park. Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Video: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Semplici dispositivi microfluidici per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Ricerca

Bioingegneria

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

Imaging di fluorescenza Live-cella del completo ciclo cellulare vegetativo della lenta crescita sociale batterio xanthus di Myxococcus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Biochimica

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embrioni

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Biologia dello sviluppo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Stabilimento di larvale Zebrafish come modello animale per indagare Trypanosoma cruzi motilità In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biologia

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Utilizzando un dispositivo di microfluidica per stimolazione meccanica e alta risoluzione Imaging di c. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Neuroscienze

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Formazione di sferoidi multicellulari per analisi metaboliche e ipossia basate su FLIM

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Autore in primo piano: Standardizzazione dei metodi di formazione degli sferoidi per l'analisi metabolica e dell'ossigenazione mediante microscopia per imaging a fluorescenza

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

Fluorescenza Time-lapse imaging del Complete

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Semplici dispositivi microfluidici per

Imaging di fluorescenza Live-cella del completo ciclo cellulare vegetativo della lenta crescita sociale batterio xanthus di Myxococcus

Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate

Stabilimento di larvale Zebrafish come modello animale per indagare Trypanosoma cruzi motilità In Vivo

Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila

Utilizzando un dispositivo di microfluidica per stimolazione meccanica e alta risoluzione Imaging di c. elegans

Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari