Name: administering and detecting protein marks on arthropods for dispersal research
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
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Il finanziamento è stato fornito da USDA CRIS 5347-22620-021-00D e, in parte, dalla dell&#39;agricoltura e dell&#39;alimentazione iniziativa di assegno di ricerca competitiva no. 2011-67009-30141 dal National Institute USDA di alimentazione e l&#39;agricoltura. Siamo grati per il supporto tecnico di Johanna Nassif. Ringraziamo anche Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, e Frances Sivakoff per la fornitura di alcune delle immagini usate in figura 3.

1. Mark interno, di conservazione, e procedura di rilevazione <ol><li> Procedura marcatura interna <ol><li> Raccogliere insetti di interesse (n ≈ 100 individui) da una colonia di laboratorio allevati con una dieta artificiale o dal campo e dividere in due contenitori di allevamento puliti. </li><li> Collocare un normale pacchetto di dieta 20 ml (trattamento di controllo negativo non marcato) in uno dei contenitori. Supplemento un secondo 20 ml pacchetto dieta artificiale con 1,0 ml di una / IgG pollo ml di soluzione 1,0 mg / IgY, mescolare accuratamente, e inserirlo in un altro contenitore. Nota: se l&#39;insetto di interesse non ha una dieta artificiale, il marchio può essere posizionato su o in qualunque dieta sono normalmente sostenuti su (ad esempio, fagiolini, uova falena, acqua, zucchero, miele). </li><li> Consentire agli insetti di riprendere la loro attività di alimentazione per 24 ore. </li></ol></li><li> Marchio interno Procedura ritenzione <ol><li> Rimuovere i pacchetti di dieta di ogni contenitore e fornire gli insetti with un&#39;altra fonte di cibo per sostenerli tutta la durata dell&#39;esperimento (ad esempio, fagiolini). </li><li> Raccogliere una coorte (n = 20) di insetti giornaliera (o in qualsiasi intervallo di tempo desiderato) da ciascun trattamento e congelare immediatamente a -20 ° C. </li></ol></li><li> Sandwich procedura ELISA <ol><li> Aggiungere 50 ml di coniglio anti-pollo IgY anticorpo primario diluito 1: 500 in Tris Buffered Saline (TBS) a ciascun pozzetto di una micropiastre ELISA pulito e incubare per un minimo di 1 ora a temperatura ambiente (nota: i micropiastre può anche essere incubate O / N a 4 ° C). </li><li> Scartare l&#39;anticorpo dalla piastra e bloccare ogni pozzetto con 300 ml di una soluzione non grasso secco 1,0% per 30 min. </li><li> In attesa che le fasi di incubazione precedenti, posizionare insetti congelati singolarmente in 1,6 ml microprovette con 1,0 ml di TBS. </li><li> Grind ogni insetto con un pestello pulito fino al completo omogeneizzato e aggiungere 100 ml di ciascun campione di un bene individuale del ELISApiatto. Lasciare i campioni incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Aggiungere 100 pl di negativo (solo TBS) e positivi (albumi in TBS) controlli nei pozzetti nella prima colonna di ciascuna piastra ELISA. Inoltre, aggiungere 100 ml di controlli negativi insetti (insetti non marcati) per le 8 pozzetti nell&#39;ultima colonna di ciascuna piastra (Figura 1). Lasciare i campioni di controllo per incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Si noti che il modello fornito nella figura 1 è il modello che utilizziamo per i nostri test standardizzati. Il posizionamento dei campioni nei pozzetti è a discrezione del ricercatore. </li><li> Lavare i pozzetti tre volte con tampone fosfato salino (PBS) -tween e poi aggiungere 50 ml di IgG di coniglio anti-pollo / IgY coniugato con perossidasi diluito 1: 10.000 in 1% soluzione di latte e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween e aggiungere 50 ml di tetrametilbenzidina (TMB) substrato in ogni pozzetto. </li><li> Dopo 10 min, leggere i pozzetticon uno spettrofotometro per micropiastre impostato alla lunghezza d&#39;onda di 650 nm. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> Figura 1. Un diagramma schematico che illustra le denominazioni e standardizzati utilizzati per un tipico 96 ben ELISA micropiastra. Ciascuna piastra contiene 7 pozzetti dedicate ai controlli negativi salina tamponata con Tris (TBS), un pozzo dedicato a un controllo positivo proteine ​​(Pos Ctrl), 80 singoli pozzetti dedicati agli insetti ricatturati (campione 1 ... 80), e 8 pozzetti dedicati alla non marcati (negativi) di controllo degli insetti (Neg Ctrl 1 ... 8). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2. Mark esterno, di conservazione, e procedura di rilevazione <ol><li> Procedura marcatura esterna <ol><li> Raccogliere insetti di interesse (n ≈ 100individui) da una colonia laboratorio o dal campo e posto in due contenitori di plastica 1.0 L con un foro di diametro 2.5 cm perforato del lato di ciascun contenitore. </li><li> Spray insetti nel primo contenitore con 1,0 ml di dH 2 O (trattamento di controllo negativo) utilizzando un nebulizzatore medico. Spray insetti nel secondo contenitore con 1,0 ml di una soluzione 5,0% di albumi pollo usando un nebulizzatore medico. </li><li> Attaccare il tubo del nebulizzatore ad una presa d&#39;aria di laboratorio standard e quindi inserire la bocca del nebulizzatore nel foro 2.5 cm del contenitore. Quindi, accendere l&#39;uscita dell&#39;aria gradualmente fino il nebulizzatore produce un vapore. </li><li> Continuare a spruzzo (marcatura) fino a quando la soluzione albumi è stato erogato (ca. 2-5 minuti). </li><li> Rimuovere il nebulizzatore e posizionare un tappo nel foro del contenitore di plastica. Lasciare gli insetti di stare a temperatura ambiente fino a quando la soluzione si è asciugato completamente. </li></ol></li><li> Contrassegno esterno Procedura ritenzione<ol><li> Mettere ogni trattamento degli insetti secchi in un contenitore pulito allevamento separato per evitare ulteriore esposizione al marchio. </li><li> Aggiungere cibo e acqua ai contenitori puliti per sostenere gli insetti per tutta la durata dello studio. </li><li> Raccogliere una coorte (n = 20) di insetti di ogni trattamento giornaliero e congelare immediatamente a -20 ° C. </li></ol></li><li> Procedura indiretta ELISA <ol><li> Posizionare gli insetti congelati singolarmente in 1,6 ml microprovette e aggiungere 1,0 ml di TBS. </li><li> Mettere a bagno i campioni per 1 ora su un set agitatore orbitale a 120 giri al minuto. </li><li> Aggiungere i controlli negativi e positivi come descritto al punto 1.3.5. </li><li> Dopo l&#39;immersione, pipettare un&#39;aliquota di 100 microlitri di ciascun campione in uno dei 80 pozzetti del campione designati su un nuovo 96 pozzetti ELISA come mostrato in Figura 1 consentire ai campioni di incubare per 1 ora a RT (nota:. Micropiastra può anche essere incubati O / N a 4 ° C). </li><li> Lavare i pozzetti tre volte conPBS-Tween e poi aggiungere 300 ml di tampone fosfato salino contenente 1% di albumina sierica bovina (BSA PBS-) a ciascun pozzetto. </li><li> Dopo 30 min a RT lavare due volte con PBS-Tween. </li><li> Aggiungere 50 ml di coniglio anti-albumina d&#39;uovo anticorpo primario diluito 1: 8000 in PBS-BSA-Silwet (0,05%) in ogni pozzetto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween e poi aggiungere 50 ml di IgG anti-coniglio di capra coniugato con perossidasi diluito 1: 2000 in PBS-BSA-Silwet (0,05%) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween e aggiungere 50 ml di substrato TMB in ogni pozzetto. </li><li> Dopo 10 min, leggere i pozzetti con uno spettrofotometro per micropiastre impostato alla lunghezza d&#39;onda di 650 nm. </li></ol></li></ol> Analisi 3. Dati <ol><li> Calcolare il valore medio delle 8 insetti di controllo negativo su ogni piastra ELISA e poi calcolare la deviazione standard in base ai controlli negativi pool from tutte le piastre ELISA di un dato studio 12. </li><li> Aggiungere sei volte la deviazione standard aggregata al medio ottenuto per ogni piastra ELISA per ottenere un valore di soglia positivo ELISA. Ogni campione insetto ottenendo un valore di assorbanza uguale o superiore a questo valore è considerato positivo per la presenza del marchio proteine. </li></ol>

Menzione di marchi o prodotti commerciali in questa pubblicazione è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Dipartimento dell&#39;Agricoltura degli Stati Uniti. USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.

La procedura immunomarking proteina artropodi è stato descritto quasi un quarto di secolo fa 9. Da allora, la procedura è stato adattato per studiare i modelli di dispersione di una vasta gamma di artropodi utilizzando sia internamente che esternamente amministrati IgG / IgYs. Queste proteine ​​sono rivelati marcatori risoluti per la grande varietà di specie di insetti testati finora. Tuttavia, come già detto, la principale limitazione per l&#39;utilizzo di IgG / IgYs è che sono molto costosi. Di con...

Registrazione della movimentazione dei parassiti artropodi, nemici naturali (parassitoidi e predatori) e degli impollinatori in natura è essenziale per una migliore comprensione su come migliorare i servizi ecosistemici. La componente chiave per la maggior parte dei tipi di ricerca dispersione sta avendo un metodo affidabile per contrassegnare il artropodi (s) di interesse. Una varietà di materiali (ad esempio, vernici, coloranti, polveri colorate, etichette, elementi rari, proteine) sono stati utilizzati per marcare artropodi per valutare le loro dinamiche di popolazione, capacità di dispersione, l&#39;alimentazione, i comportamenti e altre interazioni ecologiche 1,2. L&#39;adeguatezza di un marcatore utilizzato per una qualsiasi ricerca dispersione dipenderà dal tipo di studio condotto. Ci sono tre categorizzazioni di massima per marcatura artropodi: (1) mark-release-ricattura (MRR), (2) mark-capture, e (3) auto-mark-capture. Per ricerche mark-release-ricattura, l&#39;investigatore segna in genere i artropodi collettivamente alla laboratory e li rilascia in un punto nel campo centrale. Gli artropodi sono poi ripresi a vari intervalli spaziali e temporali con diversi dispositivi di raccolta (ad esempio, al netto spazzata, il vuoto, appiccicoso trappola) 3,4,5. I campioni ricatturati vengono esaminate per il marchio specifico di distinguere la liberato da individui nativi. Per ricerche mark-cattura, l&#39;investigatore di solito si applica il marchio direttamente nel spruzzo campo usando (per esempio, zaino spruzzatore, braccio e l&#39;ugello spruzzatore). I migliori marcatori per la ricerca mark-cattura sono poco costosi e facilmente applicata al habitat della artropodi. Per la ricerca di auto-mark-capture, l&#39;investigatore si applica di solito segni di un artropode esca 6,7 o nido ingresso 8. A sua volta, il artropodi si contraddistingue all&#39;interno divorando l&#39;esca marcata o esternamente da &quot;spazzolatura&quot; contro il marchio come esce il nido. Come accennato in precedenza, molti tipi di marcatori ci sono statied al tag una varietà di specie di artropodi. Tuttavia, molto pochi sono utili per tutte e tre queste categorie di ricerca di dispersione. Lo sviluppo della procedura proteine ​​immunomarking era un importante passo avanti per la marcatura insetti. Immunomarking mette un&#39;etichetta di proteine ​​su artropodi sia internamente che esternamente, che, a sua volta, viene rilevato da una specifica immunosorbent assay anti-proteina enzimatica (ELISA). I primi marcatori proteici come usati erano immunoglobulina coniglio (IgG) e IgG pollo / IgY 9,10. Hanno dimostrato di essere i marchi molto efficaci per la MRR e di ricerca di auto-mark-capture (vedi la discussione). Purtroppo, le proteine ​​IgG / IGY sono costosi e non sono quindi pratico per la ricerca mark-cattura e la maggior parte dei tipi di ricerca auto-mark-capture. Successivamente, ELISA di rilevamento di proteine ​​di seconda generazione sono stati sviluppati per le proteine ​​contenute nel albumi pollo (albumina), latte vaccino (caseina) e latte di soia (tripsina proteina inibitrice). Ciascun test è altamente sensibile, specifico, e, piùimportante, utilizza proteine ​​che sono molto meno costoso rispetto alle proteine ​​IgG / IGY 11. Queste proteine ​​si sono dimostrati efficaci per MRR, mark-cattura, e la ricerca di auto-mark-capture (vedi la discussione). In questo articolo, si descrive e dimostrare come condurre marchio proteina studi di ritenzione di laboratorio. Tali studi sono la prima fase di ricerca necessaria per ogni tipo di studio sul campo dispersione. In particolare, è fondamentale che gli investigatori sanno quanto tempo il marchio sarà mantenuto sulle specie di artropodi bersaglio prima di intraprendere gli studi di campo di dispersione. Qui, descriviamo e dimostrare come contrassegnare internamente ed esternamente insetti per MRR, mark-cattura, e studi di settore di tipo auto-mark-capture. Abbiamo poi dimostrare come rilevare la presenza dei marchi con ELISA indiretta e sandwich.

<table><tbody><tr><td>Food storage container (for insect rearing)</td><td>Rubbermaid/Tupperware</td><td>Various sizes</td><td>Various manufacturers &amp;amp; vendors. Mesh fabric is glued in a window</td></tr><tr><td>Small volume nebulizer (Micro Mist)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap</td><td>Continental Lab Products</td><td>4445.X</td><td>Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.</td></tr><tr><td>Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>This design is nice because it doesn&#039;t crowd the tubes.</td></tr><tr><td>Dispenser, repeater</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Anything similar will help speed up the dispensing.</td></tr><tr><td>Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.</td></tr><tr><td>BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom)</td><td>BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation pipette, manual (20-200 &amp;micro;l)</td><td>VistaLab</td><td>1057-0200 or 1070-0200</td><td>Any similar type will work. This model is ergonomic.</td></tr><tr><td>Reservoirs, sterile reagent</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 &amp;micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>If you had to pick one electronic model, this size is most useful.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (10-300 &amp;micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&amp;nbsp;</td><td>Anything similar will work for manual plate washing.</td></tr><tr><td>Microplate reader with absorbance detection</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 250</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Chicken IgG/IgY</td><td>United States Biological</td><td>I1903-15R</td><td>Also available from other sources</td></tr><tr><td>Egg whites</td><td>Grocery store</td><td>&amp;ldquo;All Whites&amp;rdquo;, &amp;ldquo;Egg Beaters&amp;rdquo;, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td><td>Mix 5 ml with 95 ml dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 5% solution</td></tr><tr><td>Tris (Trizma Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42 g/L to make TBS</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22 g/L to make TBS and 8.0&amp;nbsp;g&amp;#8288;/&amp;#8288;L for PBS</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1.14 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0.2 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0.2 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Tween 20, EIA grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.</td></tr><tr><td>PBS with 1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Mix 1 packet in 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 &amp;micro;l in 50 ml TBS</td></tr><tr><td>Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%)</td><td>Grocery store</td><td></td><td>Mix 10 g with 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 1% solution</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 &amp;micro;l in 1 L of 1% milk</td></tr><tr><td>Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>Dilute 125 &amp;micro;l in 1 L PBS-BSA</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3&amp;nbsp;ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>Add as last ingredient</td></tr><tr><td>TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

administering and detecting protein marks on arthropods for dispersal research

È spesso richiesto il monitoraggio movimento artropodi per meglio comprendere dinamiche relative popolazioni, i modelli di dispersione, preferenze pianta ospite, e altre interazioni ecologiche. Gli artropodi sono solitamente monitorati in natura da loro codifica con un segno unico e poi ri-raccogliere loro nel tempo e nello spazio di determinare le loro capacità di dispersione. Oltre ai tag fisici, come polvere o vernice colorata, vari tipi di proteine ​​sono dimostrati molto efficaci per la marcatura per artropodi ricerca ecologica. Le proteine ​​possono essere somministrati internamente e / o esternamente. Le proteine ​​possono poi essere rilevate su artropodi ricatturati con un saggio di immunoassorbimento specifiche proteina enzimatica (ELISA). Qui si descrive protocolli per esternamente ed internamente la codifica artropodi con proteine. Due semplici esempi sperimentali sono dimostrati: (1) un marchio di proteine ​​interno introdotto un insetto fornendo una dieta proteici e (2) un marchio proteina esterna topicamente unapplied di un insetto con un nebulizzatore medico. Abbiamo poi rapportiamo una guida passo-passo del panino e metodi ELISA indiretti impiegati per rilevare segni di proteine ​​sugli insetti. In questa dimostrazione, vari aspetti della acquisizione e l&#39;individuazione di marcatori proteici su artropodi per mark-release-ricattura, mark-cattura, e tipi di auto-mark-cattura di ricerca sono discussi, insieme con i vari modi in cui la procedura immunomarking è stato adattata per una vasta gamma di obiettivi di ricerca.

Interno marcatura: I risultati del test di ritenzione contrassegno interno sono mostrati nella Figura 2A. Il test ELISA valore di soglia critica calcolato era 0,054. Nel complesso (tutte e quattro le date seguenti combinati), gli insetti trattati senza proteine ​​hanno prodotto valori costantemente bassi ELISA (X = 0,038 ± 0,002, n = 80). Al contrario, tutti gli ...

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Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Amministrazione e Rilevamento di segni di proteine ​​su artropodi per Dispersione ricerca

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

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7.3K Views.  Arid-Land Agricultural Research Center. Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated. 

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A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

Un saggio di calcio bioluminescenza di analisi funzionale del Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus Microplus) G recettori accoppiati alla proteina

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

Un metodo rapido ed efficiente per sezionare Pupal ali della drosofila adatto per Immunodetections o analisi di PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Biologia dello sviluppo

A Method for Quantifying Foliage-Dwelling Arthropods

Terrestrial arthropods play an important role in our environment. Quantifying arthropods in a way that allows for a precise index or estimates of density requires a method with high detection probability and a known sampling area. While most described methods provide a qualitative or semi-quantitative estimate adequate for describing species presence, richness, and diversity, few provide an adequately consistent detection probability and known or consistent sampling areas to provide an index or estimate with adequate precision to detect differences in abundance across environmental, spatial, or temporal variables. We describe how to quantify leaf-dwelling arthropods by sealing the leaves and end of branches in a bag, clipping and freezing the bagged material, and rinsing the previously frozen material in water to separate arthropods from the substrate and quantify them. As we demonstrate, this method can be used at a landscape scale to quantify leaf-dwelling arthropods with adequate precision to test for and describe how spatial, temporal, environmental, and ecological variables influence arthropod richness and abundance. This method allowed us to detect differences in density, richness, and diversity of leaf-dwelling arthropods among 5 genera of trees commonly found in southeastern deciduous forests.

We describe how to quantify leaf dwelling arthropods by sealing the leaves and end of branches in a bag, clipping and freezing the bagged material, and rinsing the previously frozen material in water to separate arthropods from the substrate for quantification.

Un metodo per quantificare gli artropodi Foliage-Dwelling

Terrestrial arthropods play an important role in our environment. Quantifying arthropods in a way that allows for a precise index or estimates of density ...

Ambiente

Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, various technologies are being developed as control tools. A subset of these tools focuses on modifying the behavior of arthropods by attraction or repulsion. Therefore, arthropods are often the focus of behavioral investigations. Various tools have been developed to measure arthropod behavior, including wind tunnels, flight mills, servospheres, and various types of olfactometers. The purpose of these tools is to measure insect or arachnid response to visual or more often olfactory cues. The vertical T-maze oflactometer described here measures choices performed by insects in response to attractants or repellents. It is a high throughput assay device that takes advantage of the positive phototaxis (attraction to light) and negative geotaxis (tendency to walk or fly upward) exhibited by many arthropods. The olfactometer consists of a 30 cm glass tube that is divided in half with a Teflon strip forming a T-maze. Each half serves as an arm of the olfactometer enabling the test subjects to make a choice between two potential odor fields in assays involving attractants. In assays involving repellents, lack of normal response to known attractants can also be measured as a third variable.

A vertical, T-maze olfactometer is described for assaying the behavioral response of arthropods. The olfactometer allows the experimenter to measure choices performed by test subjects when subjected to two potential odor fields. Both attraction to and repulsion from odorants can be measured with this device.

Verticale T-maze test di scelta per risposta artropodi di odori

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

Neuroscienze

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

A Single-fly saggio per comportamento alimentare in<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

SwarmSight: Monitoraggio in tempo reale dei movimenti di Antenna dell'insetto e proboscide estensione Reflex utilizzando una preparazione comune e Hardware convenzionali

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Bioassay Electroantennographic come strumento di screening per Volatili piante ospiti

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Biologia

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid acquisition require assessing mouthpart structure and function relationships; however, fluid uptake mechanisms are historically inferred from observations of structural architecture, sometimes unaccompanied with experimental evidence. Here, we report a novel method for assessing fluid-uptake abilities with butterflies (Lepidoptera) and flies (Diptera) using small amounts of liquids. Insects are fed with a 20% sucrose solution mixed with fluorescent, magnetic nanoparticles from filter papers of specific pore sizes. The crop (internal structure used for storing fluids) is removed from the insect and placed on a confocal microscope. A magnet is waved by the crop to determine the presence of nanoparticles, which indicate if the insects are able to ingest fluids. This methodology is used to reveal a widespread feeding mechanism (capillary action and liquid bridge formation) that is potentially shared among Lepidoptera and Diptera when feeding from porous surfaces. In addition, this method can be used for studies of feeding mechanisms among a variety of fluid-feeding insects, including those important in disease transmission and biomimetics, and potentially other studies that involve nano- or micro-sized conduits where liquid transport requires verification.

Fluid-feeding insects have the ability to acquire minute quantities of liquids from porous surfaces. This protocol describes a method to directly determine the ability for insects to ingest liquids from porous surfaces using feeding solutions with fluorescent, magnetic nanoparticles.

L'ingestione di fluorescente, nanoparticelle magnetiche per determinare la capacità di assorbimento di liquido negli insetti

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...

Raccolta dell'emolinfa da piccoli artropodi

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus transmission. Hemolymph collection is the basic technology for studying virus-vector interactions. Here, we describe a novel and simple method for the quantitative collection of hemolymph from small arthropods using Laodelphax striatellus (the small brown planthopper, SBPH) as a research model, as this arthropod is the main vector of rice stripe virus (RSV). In this protocol, the process begins by gently pinching off one leg of the frozen arthropod with fine-tipped tweezers and pressing the hemolymph out of the wound. Then, a simple micropipette consisting of a capillary and a pipette bulb is used to collect the transudative hemolymph from the wound according to the principle of capillary forces. Finally, the collected hemolymph can be dissolved into a specific buffer for further study. This new method for collecting hemolymph from small arthropods is a useful and efficient tool for further research on arboviruses and vector-virus interactions.

Autore in primo piano: un metodo preciso e quantificabile per la raccolta dell'emolinfa da piccoli artropodi  

We describe a method to collect quantifiable hemolymph efficiently from small arthropods for subsequent analysis.

Amministrazione e Rilevamento di segni di proteine su artropodi per Dispersione ricerca

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un saggio di calcio bioluminescenza di analisi funzionale del Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus Microplus) G recettori accoppiati alla proteina

Un metodo rapido ed efficiente per sezionare Pupal ali della drosofila adatto per Immunodetections o analisi di PCR

Un metodo per quantificare gli artropodi Foliage-Dwelling

Verticale T-maze test di scelta per risposta artropodi di odori

A Single-fly saggio per comportamento alimentare in

SwarmSight: Monitoraggio in tempo reale dei movimenti di Antenna dell'insetto e proboscide estensione Reflex utilizzando una preparazione comune e Hardware convenzionali

Bioassay Electroantennographic come strumento di screening per Volatili piante ospiti

L'ingestione di fluorescente, nanoparticelle magnetiche per determinare la capacità di assorbimento di liquido negli insetti

Un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi

Un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi

Amministrazione e Rilevamento di segni di proteine ​​su artropodi per Dispersione ricerca

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Un metodo per quantificare gli artropodi Foliage-Dwelling

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Bioassay Electroantennographic come strumento di screening per Volatili piante ospiti

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Un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi

Un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi

Amministrazione e Rilevamento di segni di proteine su artropodi per Dispersione ricerca