The authors have nothing to disclose.

Questo studio è stato condotto in conformità con le politiche contenute nel Manuale per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (NIH) approvate dal Comitato Etico dell&#39;Iran dell&#39;Università di Scienze Mediche (Teheran, Iran). 1. Gli animali, Chirurgia e campioni preparati NOTA: Preparare il tessuto cerebrale per il 3D confocale analisi microscopica. <ol><li> Animali Dividere casualmente in due gruppi: Ap 1-40 -injection (n = 8), e Ap 1-40 -injection con trattamento genisteina (n = 8); amministrare genisteina (10 mg / kg diluito in un veicolo come olio di ricino polietossilato) mediante sonda gastrica 1 ora prima dell&#39;intervento chirurgico. </li><li> Anestetizzare gli animali con ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Verificare il corretto anestesia dalla mancanza di recesso reflex dopo la presa la punta. Usare pomata sugli occhi durante l&#39;intervento chirurgico per prevenire la secchezza. </li><li> Mettere animali in apparato stereotassico e la testa rasatura. Applicare iodsoluzione ine per pulire il cuoio capelluto prima incisione e mantenere il sito dell&#39;operazione sterile durante l&#39;intervento chirurgico per ridurre il rischio di infezione. Iniettare Ap 1-40 stereotassica (4 pl) nell&#39;ippocampo a -3.5 mm posteriormente al bregma, ± 2 mm lateralmente alla linea mediana, e -2.8 mm al di sotto dura, secondo ratto cervello atlante 8. Per il metodo stereotassico consultare pubblicazione precedente 9. </li><li> Fornire post-operatorio di osservazione / cura fino a quando gli animali sono pienamente consapevoli per garantire il comfort degli animali. Tenere gli animali al caldo durante il recupero, e non li tornare a una gabbia con altri animali fino al pieno recupero. Prestare attenzione a eventuali segni di infezione negli animali dopo l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Anestetizzare gli animali profondamente da ketamina (150 mg / kg) tre settimane dopo l&#39;intervento. Eseguire la fissazione transcardial mediante perfusione degli animali con soluzione fisiologica 0,9% seguito dal 4% paraformaldeide in 0,1 M PBS (pH = 7,4), quindi rimuovere e riparare il cervello come descritto in 10 &lt;/ sup&gt;. </li><li> Post-fissare i cervelli in paraformaldeide al 4% per 2-3 giorni a 4 ° C. </li><li> Incorpora il tessuto in blocchi di paraffina mediante l&#39;uso di apparecchiature tessuti embedding, ed evitare di sotto-riempimento o over-riempire la cassetta in quanto potrebbe interferire con il corretto allineamento o sezionamento. Fare attenzione all&#39;orientamento del tessuto nel blocco di paraffina. NOTA: L&#39;ippocampo di ratto, per esempio, si trova vicino al posteriore parte dell&#39;emisfero cerebrale. Pertanto, il tessuto deve essere incorporato in modo che inizia il sezionamento a posteriori parte del cervello. Utilizzare l&#39;atlante Paxinos 8 come guida per raggiungere la struttura anatomica desiderata. </li><li> Posizionare il microtomo lontano da correnti d&#39;aria o porte da movimenti d&#39;aria rendono la gestione delle sezioni difficili. </li><li> Utilizzare le sezioni con uno spessore ≥20 micron a questo fondo con essere necessario per produrre immagini Z-Stack di astrociti complete. Non utilizzare i primi due sezioni, in quanto potrebbero avere spessore indesiderata causa e termicoXpansion. </li><li> Posizionare le sezioni sulla superficie di acqua calda (5 ± 2 C, al di sotto della temperatura di fusione per paraffina) il tempo sufficiente per appiattire sezioni. NOTA: Oltre espansione della sezione può disturbare la morfologia della struttura. Utilizzare piccolo pennello per trasferire accuratamente sezioni. Raccogliere due o tre sezioni su ogni diapositiva. </li><li> Conservare i vetrini in un rack in posizione verticale e lasciarle asciugare a 37 ° C per diverse ore o O / N. </li></ol> 2. immunoistochimica <ol><li> Deparaffinare sezioni in xilene, 2 x 10 min, e reidratare attraverso gradiente alcol (99,8%, 95% e 70%, 10 minuti ciascuna) e PBS. </li><li> Incubare con anticorpi contro la proteina gliale fibrillare acida (GFAP) diluito 1: 1500 in PBS contenente 0,25% di albumina di siero bovino (BSA), 0,25% Triton X-100 e siero normale 3,5% (O / N a 4 ° C). </li><li> Lavare le sezioni in PBS per 3 x 5 min. </li><li> Incubare con alcaline antibodie fosfato-coniugato secondarios per 1h (1: 100, 21 C, diluito in PBS). </li><li> Lavare le sezioni in PBS per 3 x 5 min. NOTA: E &#39;importante lavare sezioni correttamente dopo anticorpi secondari per ridurre al minimo la colorazione di fondo. </li><li> Incubare sezioni in oscurità con Liquid Permanent Red Cromogeno (15-20 minuti). Nota: Preparare la soluzione non più di 30 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Lavare le sezioni in PBS per 3 x 5 min. </li><li> Infine, macchiare i nuclei con 4-6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 1: 500, diluito in PBS) prima di coprire antiscivolo. Conservare i vetrini in frigorifero 24-48 ore prima di microscopia. </li></ol> 3. Microscopia confocale NOTA: Per la valutazione quantitativa (vedi sotto), selezionare un astrociti con un nucleo DAPI tinto chiaramente visibile con un minimo di sovrapposizione rami per ridurre il rischio di errori. Producendo immagini Z-Stack è molto tempo. Siate pazienti e non si fermano durante la lavorazione. Laser confocale microscopio a scansione verticale è used per creare immagini 3D da astrociti. <ol><li> Mettere il vetrino sul microscopio palco, e selezionare l&#39;obiettivo 63x. </li><li> Aprire il software di imaging e fare clic sul sistema Start. Fare clic sulla scheda Locate. Vai a assegnare e selezionare GFP per regolare la giusta luce. </li><li> Aprire l&#39;otturatore per riflettere la luce. Trova il riflettore Revolver sul lato destro di Shutter e scegliere il colore che dovrebbe essere riflessa da astrociti (verde, rosso o viola); colore rosso (FSet20 wf) è stato utilizzato qui. NOTA: Non dimenticate di mettere a fuoco l&#39;immagine direttamente nel oculare del microscopio. </li><li> Per trovare la migliore messa a fuoco, fare clic su All chiuso, mettere il perno microscopio in modalità a schermo, e fare clic sulla scheda di acquisizione. </li><li> Clicca su Smart Setup nella scheda di acquisizione; apre una finestra. Selezionare il fluoroforo corretto (cioè DAPI e Alexa Fluor 555, nel progetto attuale) dalla lista. Il colore viene selezionato automaticamente. </li><li> Clicca su Best segnale, e su Applica, quindi fare clic su Imposta Esposizione; il computer sarà quindi impostare automaticamente i parametri di esposizione. </li><li> Per ottimizzare l&#39;immagine, passare alla finestra Canali. Deselez Track2, evidenziare Track1 e fare clic su Live. Mettere a fuoco l&#39;immagine, se necessario. </li><li> Nella finestra Canali regolare le seguenti chiavi; cliccare su 1AU per ottimizzare automaticamente il foro stenopeico. E &#39;molto importante fare questo passo altrimenti le immagini confocale saranno non ottimale. Regolare il guadagno di avere la migliore intensità (mantenere questa impostazione non superiore a 800 per ridurre il rumore extra). Infine, impostare il guadagno digitale tra 2 e 3. </li><li> Deselez Track1, cliccare su Track2 e ripetere il punto 3.8 per Track2. Poi fermare Live. </li><li> Andare alla finestra Modalità di acquisizione. Migliorare l&#39;immagine ottimizzando Frame Size e una media di. Per cambiare dimensione del frame andare a X * Y e selezionare 1.024 x 1.024. Scegli una bassa velocità per creare una migliore immagine. </li><li> Vai a della media e selezionare un numero di ≥4. Questo valore indica la media del numero di scansioni che saranno mediati per PRODUCvia e l&#39;immagine acquisita. Ora cliccate sul pulsante di scatto, e salvare l&#39;immagine 2D catturata. </li><li> Per l&#39;imaging 3D, contrassegnare l&#39;elemento Z-Stack sotto Smart Setup causando la finestra di Z-Stack per aprire. </li><li> Impostare la prima e l&#39;ultima di Z-Stack, cioè la profondità della cella. Prima clicca su Live. Quindi utilizzare l&#39;unità di messa a fuoco del microscopio di concentrarsi sulla posizione più alta di astrociti nel tessuto, dove la Z-Stack è quello di iniziare. Clicca su Imposta prima. Poi fuoco fino alla posizione più bassa del astrociti nel tessuto, dove scansione Z-Stack deve essere interrotto. Clicca su Imposta Ultimo. Poi fermare Live. </li><li> Scegliere l&#39;intervallo; 1.01 micron viene utilizzato in questo studio; Intervallo di scelta può essere fatta cliccando su ottimale per impostare il numero di fette. </li><li> Fare clic su Start Experiment. Salvare le immagini una volta che la scansione è completata. Questa immagine verrà utilizzata per la misura dei seguenti parametri: area superficiale e volume del territorio astrociti, il reggiseno intera astrociti compresonches, corpo cellulare, e il nucleo. </li><li> Acquisire un&#39;immagine 2D utilizzando un obiettivo 10X o 20X come descritto nei passaggi 3.6-3.11. Questa immagine può essere usata per la misura l&#39;intensità della fluorescenza immunoreattività di anticorpi, e la densità astrociti (numero / 1.000 micron 2). </li></ol> 4. astrociti Densità e GFAP + fluorescenza intensità <ol><li> Aprite l&#39;immagine 20X 2D. Clicca su Histo (Hisogram) sul lato sinistro della finestra dell&#39;immagine. </li><li> Per calcolare la densità astrociti, selezionare tre campi visivi consecutivi sotto obiettivo 20X. Contare il numero di astrociti che presentano un chiaro soma con un minimo, filiali nei campi si sovrappongono. </li><li> Per quantificare l&#39;intensità di fluorescenza, selezionare uno strumento adeguato (rettangolo o un cerchio) sul footer della finestra dell&#39;immagine, e scegliere una zona per la misurazione. Nota il valore medio e la deviazione standard vengono visualizzati automaticamente sotto l&#39;immagine. In questo studio, un&#39;area rettangolare 0,7 millimetri 2 tra strè stato utilizzato iatum e lama mediale del giro dentato. </li></ol> 5. Filiali astrociti <ol><li> Per quantificare la lunghezza e il numero complessivo delle filiali, utilizzare le immagini 3D (acquisite con 20X) nel software di analisi dell&#39;immagine. Tracciare una linea manualmente lungo la lunghezza di ogni ramo del astrociti selezionato. Quindi selezionare la misura, strumento che è specializzata per misurare la linea di lunghezza. Al fine di quantificare il numero di rami, selezionare il numero di utensili per contare il numero di elementi selezionati. </li></ol> 6. Volume e Superficie NOTA: Marcatura una struttura manualmente in software di analisi dell&#39;immagine 3D richiede concentrazione e la formazione. Pratica più volte prima di iniziare un esperimento. <ol><li> Per quantificare il volume e la superficie del astrociti nucleo, soma, corpo cellulare e territorio, trasferire le immagini 3D (acquisite nei passaggi 3.1-3.16) per una immagine software di analisi 3D come Volocity 6.1. </li><li> Aprire il software e creare un nuovobiblioteca. Trascinare tutte le immagini alla colonna grigia a sinistra nella nuova libreria. Quindi, selezionare un&#39;immagine 3D. Sulla destra, esistono diversi canali con colori diversi. Attivare un canale di interesse; per esempio, il canale blu per DAPI quando si misura il nucleo. Modificare la luminosità manualmente per ottenere un contrasto ottimale. </li><li> Selezionare il menu Strumenti, andare a fare Volume e produrre una singola immagine 3D di immagini Z-stack. Fare clic su Proprietà nel menu Modifica e assicurarsi che X, Y e Z proprietà sono presentati; altrimenti è impossibile effettuare analisi 3D. </li><li> Clicca su Freehand sull&#39;icona strumento RIO nella barra degli strumenti. Per misurare il volume e la superficie di astrociti nucleo tracciare una linea intorno al nucleo DAPI marcato. </li><li> Per misurare il volume e la superficie del corpo cellulare astrociti tracciare una linea intorno alla soma escluso rami. </li><li> Per misurare il volume e la superficie di tutto il astrociti (corpo cellulare incluse le filiali) tracciare una linea intorno alla soma in seguito allala superficie di tutte le filiali. </li><li> Per valutare il volume e la superficie di territorio astrociti tracciare una linea tra le punte dei rami. NOTA: Premere il tasto Canc sulla tastiera per cancellare disegni indesiderati. </li><li> Fare clic sul menu Misurazioni nella parte superiore della finestra dell&#39;immagine per creare un protocollo di misura; Si apre una finestra contenente diversi strumenti. </li><li> Trascinare Trova oggetti alla parte superiore della finestra (riquadro). Dare un nome descrittivo per la popolazione 1, selezionare il colore associato e fare clic su Misura. Si apre un&#39;altra finestra. </li><li> Scegliere una zona parametro vale a dire, il volume o di superficie. Fare clic su OK. I dati vengono visualizzati in una tabella. </li><li> Per salvare i dati, fare clic sul menu di misura e selezionare Rendi Misura dell&#39;articolo. </li><li> Selezionare un nuovo elemento di misura chiamato dalla finestra aperta. Poi dare un nome ai dati e fare clic su OK. </li><li> Infine, esportare i dati al software statistiche come pad grafico o excel programma. Usa t-test per analizzare i dati, quindi tracciare 2D grAPHS. </li></ol>

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Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Consiglio della Contea di Östergötland, (Svezia) e il cellulare e molecolare Research Center presso l&#39;Iran Università degli Studi di Scienze Mediche (Teheran, Iran).

Nel protocollo corrente, abbiamo impiegato 3D morfometria confocale per valutare 12 parametri diversi che sono stati associati con astrociti morfologia. A questo scopo, tessuti ippocampali di ratto con Ap 1-40 - stati usati astrogliosis indotta, con o senza pretrattamento genisteina come agente anti-infiammatorio. Utilizzando le immagini 3D e software morfometriche, siamo stati in grado di mostrare l&#39;effetto di genisteina sulla astrogliosi cioè morfologia degli astrociti. I cambiamenti nell&#39;ambiente intracellulare ed extra del tessuto cerebrale possono alterare il volume e / o le dimensioni di cellule / tessuti. Queste alterazioni sono considerate caratteristiche patologiche in varie lesioni cerebrali 3,11. Per quantificare tali alterazioni, vengono utilizzati un certo numero di tecniche. La maggior parte delle ricerche si basano sull&#39;utilizzo di immagini a bassa risoluzione in 2D catturati da luce- o microscopia elettronica (EM) che danno informazioni solo un piccola frazione del cell. Per superare questo limite, 3D confocale morfometria sulle immagini ad alta risoluzione è stato sviluppato 11. Un altro vantaggio di microscopia confocale è che l&#39;architettura di una cella può essere studiata da diversi immagini 2D consecutive sono ottenute durante l&#39;esecuzione di imaging Z-Stack. Inoltre, microscopia confocale 3D aumenta la possibilità di migliorare la qualità delle immagini filtrando il rumore di fondo 11. Il metodo qui presentato è in termini di tempo; prendere le immagini Z-Stack con un microscopio confocale richiede diversi minuti per ogni singola cella. Inoltre, la marcatura manualmente una struttura in software richiede una certa pratica, e il ricercatore potrebbe essere necessario rifare i disegni più volte per essere sicuri che la struttura sia correttamente segnata. Va ricordato che la scheda &#39;Magic&#39; nel software di analisi dell&#39;immagine 3D come Volocity, può essere usato per marcare automaticamente tutti i nuclei DAPI macchiato in una singola immagine. Questa opzione può essere utilizzata quandoastrociti sono coltivati. Le sezioni di cervello, tuttavia, contengono non solo astrociti, ma anche molte altre cellule, come microglia e neuroni. Ciò significa che molti dei nuclei DAPI macchiate non appartengono astrociti. I nuclei associati con astrociti devono essere contrassegnate manualmente utilizzando le immagini che hanno entrambi i nuclei DAPI-etichettati e astrociti GFAP-immunoreattive. In questo protocollo, gli anticorpi contro GFAP sono stati usati per visualizzare i astrociti nelle sezioni di paraffina. Gli astrociti possono anche essere visualizzati utilizzando altri antigeni 12,13, o topi transgenici. I ricercatori devono essere consapevoli dei limiti dei metodi, e utilizzare il miglior design sperimentale possibile in base alle loro finalità. La limitazione di anticorpi contro GFAP utilizzando, ad esempio, è che solo il 10-15% del citoscheletro può essere rilevato. Questa limitazione, tuttavia, può diventare un vantaggio quando si studia astrogliosis; il numero aumento degli astrociti e una fitta rete di filiali astrociti &#39;cometrogliosis può rendere difficile identificare una singola cella se viene rilevata una maggiore superficie della cella. Anche se questo protocollo descrivere la quantificazione di 12 parametri diversi, ma il ricercatore può scegliere quelli che più si adattano il loro scopo. Secondo la nostra esperienza, le misure di tutti i parametri possono dare informazioni preziose sui parametri che sono significativamente influenzati in una certa condizione o da un trattamento. Il metodo di quantificazione eseguita su immagini 3D catturate in microscopio confocale può anche essere eseguita su sezioni congelate. Il problema è quello di trattare i campioni (fissazione, disidratazione, inclusione e sezionamento) in modo simile dal momento che questa procedura può portare al ritiro o gonfiore dei tessuti. In conclusione, 3D confocale, in combinazione con software morfometrico, permette di quantificare diversi parametri associati con la morfologia di una cella. Il protocollo che abbiamo presentato qui può essere utilizzato per la valutazione morfologica di ChanGE che compaiono in una cella, in diverse condizioni patologiche, o come l&#39;effetto di una strategia di intervento.

Nel sano il sistema nervoso centrale (SNC), astrociti svolgono un ruolo importante nella regolazione del flusso di sangue, metabolismo energetico, la funzione sinaptica e plasticità, e ionico extracellulare e neurotrasmettitore omeostasi 1-3. Inoltre, astrociti rispondono a stimoli diversi nocive e condizioni anomale, come traumi, infezioni, ischemia o neurodegenerazione con astrogliosi reattiva che è caratterizzata da ipertrofia, la proliferazione e rimodellamento funzionale degli astrociti 4,5. Astrogliosis reattiva può progettare la risposta infiammatoria e processo di riparazione del tessuto e, quindi, può influenzare l&#39;esito clinico di interventi terapeutici. Di conseguenza, gli astrociti hanno ricevuto attenzione da neuroscienziato nel corso degli ultimi decenni come potenziali bersagli per interventi terapeutici per una varietà di malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale. Astrociti normalmente hanno una forma stellata con ben-drami efined che si diffondono in tutto il soma 6. In una condizione di malato nel cervello, rami astrociti diventare aggrovigliata e mostrano estremità gonfie 7, ad esempio in presenza di beta amiloide (Ap). Questo articolo presenta un protocollo per l&#39;analisi di immagini 3D di astrociti acquisite al microscopio confocale. Dodici diversi parametri quantitativi per ogni astrociti sono stati misurati: delle superfici e dei volumi del territorio astrociti (il tessuto coperto da un astrociti), intera cella (incluse le filiali), corpo cellulare, e nel nucleo; la lunghezza totale e il numero di sportelli; l&#39;intensità di fluorescenza di anticorpi utilizzati per la rilevazione astrociti; e la densità degli astrociti (numero / 1.000 micron 2). A questo scopo, abbiamo usato sezioni di cervello di ratti esposti a intrahippocampal iniezione di Ap 1-40 con o senza trattamento genisteina come sostanza anti-infiammatoria. Il protocollo descritto può essere utilizzato per un morfometricaANALISI DELLA diversi tipi di cellule in vitro o in vivo in condizioni diverse.

<table><tbody><tr><td>Amyloid beta 1-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79793</td><td>Keep in -70 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Genistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>446-72-0</td><td>keep in -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td><td>DAKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Permanent Chromogen</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Cremophor EL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27963</td><td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td></tr><tr><td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Perkin Elmer Inc.,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis 2000</td><td>Tekno Optic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streotaxic apparatus</td><td>Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graph pad Prism 5</td><td>Graph pad software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

Mentre le cellule gliali del cervello, astrociti hanno diversi ruoli funzionali nel sistema nervoso centrale. In presenza di stimoli nocivi, astrociti modificano le loro proprietà funzionali e strutturali, una condizione chiamata astrogliosis reattiva. Qui, un protocollo per la valutazione delle proprietà morfologiche di astrociti è presentato. Questo protocollo include quantificazione dei 12 parametri diversi cioè la superficie e il volume del tessuto coperto da una astrociti (territorio astrociti), l&#39;intero astrociti compresi rami, corpo cellulare, e nucleo, così come la lunghezza totale e il numero di rami, l&#39;intensità della fluorescenza immunoreattività di anticorpi utilizzati per il rilevamento astrociti, e la densità astrociti (numero / 1.000 micron 2). A questo scopo tridimensionali (3D) immagini microscopiche confocale sono stati creati, e immagini 3D software di analisi come Volocity 6.3 è stato utilizzato per le misurazioni. Tessuto cerebrale di ratto esposti a beta amiloide 1-40 </sub&gt; (Ap 1-40), con o senza un intervento terapeutico è stato utilizzato per presentare il metodo. Questo protocollo può essere utilizzato anche per l&#39;analisi morfometrica 3D di altre cellule da in vivo o in vitro condizioni.

Questa sezione presenta alcuni esempi delle osservazioni qualitativi e quantitativi prodotti da analisi morfometrica 3D. Per i risultati completi di tutti i 12 parametri menzionati in precedenza, si prega di consultare la nostra precedente pubblicazione 10. Osservazioni qualitative Gli astrociti esposti rami sottili o spessi che erano solitamente lunghi in Ap 1-40 ratti iniettati (Figura 1). Alcuni piccoli astrociti a forma stellate con rami corti sono stati osservati nella corteccia cerebrale, e una fitta rete di astrociti si è verificato nel corpo calloso. Gli astrociti nei tessuti cerebrali di animali con Ap 1-40 -injection seguita da trattamento genisteina mostravano una forma stellata con rami corti e sottili (Figura 2) 10. Qualche astrociti hanno mostrato un aspetto atrofico. Densità e astrociti GFAP +Intensità di fluorescenza Il numero medio di astrociti / 1.000 micron 2 era significativamente più alto nei ratti con Ap 1-40 -injection in confronto con gli animali in Ap 1-40 -injection e gruppo di trattamento genisteina (p &lt;0,0001). Inoltre, l&#39;intensità di fluorescenza GFAP + era significativamente più bassa nella sezione cervello con trattamento genisteina rispetto al non trattato Ap 1-40 iniettato animali (Figura 3). Analisi morfometrica di astrociti Volume Il volume del territorio astrociti nucleo, corpo cellulare, tutto astrociti e astrociti diminuito significativamente nel gruppo di trattamento genisteina rispetto agli animali non trattati. Questo risultato suggerisce che la genisteina migliorato astrogliosis causata dalla presenza di amiloide (Figura 4A - D). Figura 1. confocale immagine di un astrociti. Un astrociti individuo con rami spessi e lunghi (punta di freccia) e nucleo DAPI marcati (freccia) in un cervello di ratto sottoposti ad iniezione ippocampale di Ap 1-40. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53113/53113fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53113/53113fig2.jpg" /> Figura 2. confocale immagine di un astrociti. Un astrociti con rami corti (punta di freccia). In un cervello di ratto sottoposti ad dell&#39;ippocampo Ap 1-40 -injection, e pre-trattamento genisteina somministrata tramite sonda gastrica. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53113/53113fig2large.jpg" target="_blank">P</a><html> leasing clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53113/53113fig3.jpg" /> Figura 3. GFAP + fluorescenza intensità diminuito significativamente negli animali con A β 1-40 -. Iniezione che ha ricevuto il pretrattamento genisteina valori sono la media ± SEM. Cinquanta astrociti per animale sono stati valutati. P &lt;0.05 è stato considerato come significativo, e T-test è stato utilizzato per confrontare i dati tra i gruppi, con o senza trattamento. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53113/53113fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> g &quot;/&gt; Figura 4. Il volume medio di nucleo (A), corpo cellulare (B), astrociti (incluse le attività; (C), e territorio (D) in campioni cerebrali prelevati da ratti sottoposti a Ap 1-40 -injection, con o senza genisteina pre-trattamento. genisteina migliorato in modo significativo l&#39;allargamento nucleo, corpo cellulare, l&#39;intero astrociti, e il territorio astrociti (vedi rif 10). I valori sono media ± SEM. Fifty astrociti per animale sono stati valutati. P &lt;0.05 è stato considerato significativo, e T-test è stato utilizzato per confrontare i dati tra gruppi prima e dopo il trattamento. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53113/53113fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocollo per tridimensionale confocale morfometrica Analisi di astrociti

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Views.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Video: Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

Tridimensionale confocale Analisi dei marcatori microglia / macrofagi di polarizzazione in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

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Neuroscienze

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Uno strumento di analisi che quantifica Modifiche morfologia cellulare dalle immagini a fluorescenza tridimensionali

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Biologia

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

Analizzando le dimensioni, la forma e la direzionalità delle reti dei Astrocytes accoppiato

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction of high-resolution imaged stacks to reveal ultrastructural patterns that could not be resolved using 2D images. Indeed, the latter might lead to a misinterpretation of morphologies, like in the case of mitochondria; the use of 3D models is, therefore, more and more common and applied to the formulation of morphology-based functional hypotheses. To date, the use of 3D models generated from light or electron image stacks makes qualitative, visual assessments, as well as quantification, more convenient to be performed directly in 3D. As these models are often extremely complex, a virtual reality environment is also important to be set up to overcome occlusion and to take full advantage of the 3D structure. Here, a step-by-step guide from image segmentation to reconstruction and analysis is described in detail.

The described pipeline is designed for the segmentation of electron microscopy datasets larger than gigabytes, to extract whole-cell morphologies. Once the cells are reconstructed in 3D, customized software designed around individual needs can be used to perform a qualitative and quantitative analysis directly in 3D, also using virtual reality to overcome view occlusion.

Un metodo per la ricostruzione 3D e l'analisi della realtà virtuale delle cellule gliali e neuronali

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, which include neurotransmitter clearance, ion regulation, synaptic modulation, metabolic support to neurons, and blood flow regulation. Astrocytes are complex cells that have a soma, several major branches, and numerous fine processes that contact diverse cellular elements within the neuropil. In order to assess the morphology of astrocytes, it is necessary to have a reliable and reproducible method to visualize their structure. We report a reliable&#160;protocol to perform intracellular iontophoresis of astrocytes using fluorescent Lucifer yellow (LY) dye in lightly fixed brain tissue from adult mice. This method has several features that are useful to characterize astrocyte morphology. It allows for three-dimensional reconstruction of individual astrocytes, which is useful to perform morphological analyses on different aspects of their structure. Immunohistochemistry together with LY iontophoresis can also be utilized to understand the interaction of astrocytes with different components of nervous system and to evaluate the expression of proteins within the labelled astrocytes. This protocol can be implemented in a variety of mouse models of CNS disorders to rigorously examine astrocyte morphology with light microscopy. LY iontophoresis provides an experimental approach to evaluate astrocyte structure, especially in the context of injury or disease where these cells are proposed to undergo significant morphological changes.

Astrocytes are morphologically complex cells, exemplified by their multiple processes and bushy territories. To analyze their elaborate morphology, we present a reliable protocol to perform intracellular Lucifer yellow iontophoresis in lightly fixed tissue.

Visualizzazione della morfologia degli astrociti utilizzando Lucifero Giallo Iontoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at adult stages. Thus far, no immunostaining strategy can single them out and segment their morphology in mature animals and over the course of corticogenesis. Cortical PrA originate from progenitors located in the dorsal pallium and can easily be targeted using in utero electroporation of integrative vectors. A protocol is presented here to label these cells with the multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) Markers strategy, which relies on piggyBac/Tol2 transposition and Cre/lox recombination to stochastically express distinct fluorescent proteins (blue, cyan, yellow, and red) addressed to specific subcellular compartments. This multicolor fate mapping strategy enables to mark in situ nearby cortical progenitors with combinations of color markers prior to the start of gliogenesis and to track their descendants, including astrocytes, from embryonic to adult stages at the individual cell level. Semi-sparse labeling achieved by adjusting the concentration of electroporated vectors and color contrasts provided by the Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers or MM) enable to individualize astrocytes and single out their territory and complex morphology despite their dense anatomical arrangement. Presented here is a comprehensive experimental workflow including the details of the electroporation procedure, multichannel image stacks acquisition by confocal microscopy, and computer-assisted three-dimensional segmentation that will enable the experimenter to assess individual PrA volume and morphology. In summary, electroporation of MAGIC Markers provides a convenient method to individually label numerous astrocytes and gain access to their anatomical features at different developmental stages. This technique will be useful to analyze cortical astrocyte morphological properties in various mouse models without resorting to complex crosses with transgenic reporter lines.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Astrocytes tile the cerebral cortex uniformly, making the analysis of their complex morphology challenging at the cellular level. The protocol provided here uses multicolor labeling based on in utero electroporation to single out cortical astrocytes and analyze their volume and morphology with a user-friendly image analysis pipeline.

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

Indagine sull'interazione spaziale tra astrociti e neuroni nel cervello eliminato

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the brain. Through these interactions, astrocytes actively regulate many critical brain functions, including synapse formation, neurotransmission, and ion homeostasis. In the rodent brain, astrocytes grow in size and complexity during the first three postnatal weeks and establish distinct, non-overlapping territories to tile the brain. This protocol provides an established method for analyzing astrocyte territory volume and astrocyte tiling using free-floating tissue sections from the mouse brain. First, this protocol describes the steps for tissue collection, cryosectioning, and immunostaining of free-floating tissue sections. Second, this protocol describes image acquisition and analysis of astrocyte territory volume and territory overlap volume, using commercially available image analysis software. Lastly, this manuscript discusses the advantages, important considerations, common pitfalls, and limitations of these methods. This protocol requires brain tissue with sparse or mosaic fluorescent labeling of astrocytes, and is designed to be used with common lab equipment, confocal microscopy, and commercially available image analysis software.

This protocol describes methods for sectioning, staining, and imaging free-floating tissue sections of the mouse brain, followed by a detailed description of the analysis of astrocyte territory volume and astrocyte territory overlap or tiling.

Analisi del volume e della piastrellatura del territorio degli astrociti in sezioni di tessuto fluttuanti spesse

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

Immunostaining of Fluorescently Labeled Astrocytes in a Mouse Brain Tissue Section

Source: Eaker, A. R., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/63804">Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for immunostaining a fixed mouse brain tissue section with fluorescently labeled astrocytes using primary and secondary antibodies and capture the images of the stained astrocytes through confocal microscopy.

Source: Eaker, A. R., et al. Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (2022)
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