Name: implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms
Uploaded: 2015-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
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The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.

1. Valutare GI 50 per Compound (s) of Interest <ol><li> Generare curva di crescita (s) per linee cellulari di interesse per valutare la appropriata densità di semina. Trama del numero di cellule in vari momenti dopo la semina (giorni 2, 4, 6 e 8) rispetto al giorno 0. Questo fornirà un tasso di crescita relativo della linea di cellule di interesse e dovrebbe essere utilizzato per valutare la densità di semina iniziale, in modo tale che confluenza non è raggiungibile in piastre da 96 pozzetti entro 7 giorni. </li><li> Una volta che le curve di crescita sono stati determinati, seme numero adeguato di cellule in chiaro, piastre a 96 pozzetti fondo non trasparenti in 100 ml di supporti cellulari per valutare GI 50. Seme il numero di cellule in base alle linea cellulare utilizzata e determinato in 1.1. In genere, semi di 3x10 3 celle per le linee in rapida crescita di celle con un raddoppio del tempo di ~ 24 ore, ad es., HCT116. <ol><li> Preparare una piastra di dosaggio (giorno-1). Per la piastra di analisi, le cellule di sementi a densità desiderata in 100 ml di coltura in pozzi ombreggiata in blu (Figura 1). Wells evidenziata in bianco contengono solo i supporti. </li><li> Preparare una piastra di controllo (giorno-1). Per la piastra di controllo, seminare la stessa densità di cellule come al punto 1.2.1 in 100 ml di coltura in una piastra da 96 pozzetti separati. Questa lettura &#39;Giorno 0&#39; vi aiuterà a interpretare la natura citotossica / citostatici dei composti in fase di analisi (Figura 2). </li></ol></li><li> Il giorno successivo (giorno 0), leggere la piastra di controllo. Equilibrare luminescenti reagente vitalità cellulare (substrato CellTiter-Glo mescolato con tampone secondo le istruzioni del produttore) di RT e mescolare delicatamente capovolgendo il contenuto per ottenere una soluzione omogenea. Aggiungere 80 ml di reagente ai 100 ml di cellule / media mix e agitare il contenuto per 30 minuti per indurre la lisi cellulare. <ol><li> Record luminescenza con un luminometro impostato un&#39;esposizione di 0,1-1,0 sec e rilevamento lunghezza d&#39;onda di 560 nm. </li></ol></li><li> Aggiungere composti di prova (compostidi interessi) per saggiare le piastre (giorno 0). Effettuare una diluizione 1: 4 serie di composti in DMSO a 200x la concentrazione finale per un totale di 10 concentrazioni (9 diluizioni contenenti composti e uno solo DMSO, piatto composto). Come un punto di partenza iniziale, puntare ad una dose più bassa di 0,03 200x micron e una dose superiore di 2.000 micron (ultimo volume 200 l). </li><li> Aggiungere composti diluite in serie per mezzo di fare un mix composto medio a 10x concentrazione finale (ultimo volume 100 l, piastra intermedia). Conservare la piastra di composti a -20 ° C per l&#39;uso il giorno 3 del test. Aggiungere 10 ml di miscela di composti a medio cellule in triplicato tale che la dose massima è 10 mM (ad es., Righe B, C e D, il giorno 0) (Figura 1). Incubare le piastre test per 3 giorni a 37 ° C. Scartare piastra intermedia (s) dopo l&#39;uso. </li><li> Il giorno 3, preparare un mix composto medio 1x 400 microlitri utilizzando le piastre composto preparato 1.4. Capovolgere le piastre test di estrarre il supporto e asciugateli su autotovaglioli di carta claved 2-3x per rimuovere i media residua. Aggiungere compound / media (100 l / pozzetto) per i pozzi d&#39;ombra in blu e aggiungere 100 ml di media per perimetro pozzi per impedire l&#39;evaporazione (Figura 1). Re-incubare le piastre di saggio a 37 ° C per altri 3 giorni. </li><li> Il giorno 6, valutare il numero relativo di cellule vitali eseguendo una lettura luminescenza come descritto al punto 1.3. </li><li> Utilizzare il giorno 0 lettura per valutare la natura statica / tossicità dei composti. Agenti tossici inducono l&#39;apoptosi mentre citostatici inducono arresto del ciclo cellulare. Se composto è tossico (giorno 6 lettura è sotto giorno 0 lettura), considerare la scelta di GI 50 e GI di 50 x 5 concentrazioni per test di resistenza. Tuttavia, se il composto induce stasi (pari o superiori al d0), considerare GI 100 e GI 100 x5 per test di resistenza (Figura 2). </li></ol> 2. Impostazione Drug Resistance Assays <ol><li> Se il motto di spirito di lavoroah agente citostatico, le cellule di semi in una confluenza del 30-40% in 150 mm 2 piatti di coltura tissutale (volume = 30 ml) per il test di resistenza. Se si lavora con un agente tossico, seminare ad una confluenza del 70-80%. </li><li> Per le linee di cellule che ospitano un meccanismo intatto mismatch repair (MMR), incubare cellule dal punto 2.1 O / N a 37 ° C con l&#39;agente cancerogeno N-etil-N-nitrosourea (ITA). Il trattamento di cellule con 30 ml di una soluzione stock di 50 mg / ml ITA (concentrazione finale 50 mg / ml) per aumentare l&#39;instabilità genomica. Per le linee di cellule che hanno un difettosi MMR (Tabelle 2 e 3), il trattamento con ENU o altre sostanze cancerogene non può essere necessario. <ol><li> Per le altre linee cellulari, determinare MMR-deficit da criteri NCI utilizzando microsatelliti instabilità 12, o sulla base della caratterizzazione pubblicato mediante saggi di instabilità microsatelliti o profilazione genomica / epigenomico dei geni MMR 13-15. </li></ol></li><li> Cellule Trattare con il composto in esame (s) diinteresse alla concentrazione determinata nel passo 1.8. Per composti altamente tossici che causano la morte delle cellule in una tipica di tre giorni vitalità test 10, iniziare con un trattamento a basso dosaggio (cioè, GI 50) e gradualmente aumentare la concentrazione (multipli di GI 50) di composto, ogni 2-3 settimane fino robusto resistenza si osserva. Rifornire i media e composti ogni 3 d. </li><li> Una volta che è stata avviata la selezione, variazione media / mix composto ogni 3-4 giorni fino a cloni resistenti emergono. Resistenza per definizione emerge quando le cellule trattate mostrano una maggiore crescita / sopravvivenza durante il trattamento farmacologico rispetto al trattamento acuto di cellule di controllo DMSO-trattata. </li></ol> 3. Isolamento di cloni di cellule singole <ol><li> Esaminare piatto cultura usando la microscopia a contrasto di fase (ingrandimento 40x) per i cluster di cellule vitali. </li><li> Mark cloni soddisfacenti sul fondo del recipiente con un pennarello. Scegli cloni che sono di dimensione media (le colonie più grandi possonoprovengono da più celle) e ben isolata dalle altre colonie. Scegli cloni che usano uno dei due approcci descritti al punto 3.3. </li><li> Approccio 1: Utilizzando una pipetta (Figura 3) <ol><li> Rimuovere i supporti di crescita e risciacquare con PBS 1x per rimuovere tutte le cellule galleggianti. </li><li> Usa segni neri come guida &quot;raccolta&quot; cloni con punta pipetta (allegato alla pipetta, preferibilmente p200). </li><li> Trasferire cloni entro piastre 48 pozzetti con 200 microlitri mezzi freschi (con la concentrazione a metà composto per consentire un recupero ottimale delle cellule). </li><li> Consentono alle cellule di recuperare per 2-3 giorni prima di aggiungere 200 ml di mezzi freschi / concentrazione componente ideale. </li><li> Continuare a cambiare supporto / composto ogni 3-4 giorni e continuare ad espandere cloni. </li></ol></li><li> Approccio 2: Uso Clonazione di dischi (Figura 3) <ol><li> Segnare cloni come descritto al punto 3.2. </li><li> Posizionare 3 dischi mm clonazione in un piatto di coltura di tessuti 10 cm contenente 5 ml di 0,25% trypsin-EDTA per 2 min. </li><li> Aspirare mezzi di piatto contenente cloni resistenti e sovrapporre cloni con tripsina imbevuto dischi clonazione con pinze sterili monouso. </li><li> Lasciare agire per 1-2 minuti, a seconda di quanto facilmente cloni sollevano i piatti, in un incubatore a 37 °. </li><li> Pick up dischi clonazione con pinza sterile e trasferire in piastre 48 pozzetti con i media 200 ml fresche e mezzo concentrazione di composto. </li><li> Pipetta su e giù delicatamente per sloggiare le cellule dai dischi di clonazione e incubare O / N a 37 ° C (lasciare la clonazione dei dischi in pozzi). </li><li> La mattina seguente, rimuovere i dischi di clonazione da piastre 48 pozzetti e ricostituire pozzetti con 200 ml fresco media / composto (concentrazione del composto a metà ideale). </li><li> Tre giorni dopo, ricostituire i media con la concentrazione ideale di composto. </li><li> Continuare a cambiare il supporto / compound ogni 3-4 giorni e continuare ad espandere cloni. </li></ol></li></ol> 4. Valutare Grado di Resistance di isolati cloni <ol><li> Una volta 10-20 colonie sono espansi, generare GI 50 curve come descritto al punto 1 per valutare il grado di resistenza. </li><li> Includere sempre popolazioni di controllo trattati con DMSO durante il processo di selezione. E &#39;molto probabile che lo spettro della resistenza sta per essere grande (alcuni mostrando parziale mentre altri mostrando piena resistenza). Raccogliere alcuni cloni ciascuna di queste classi come il meccanismo di resistenza può variare tra i due gruppi. </li></ol> 5. sequenziamento di prossima generazione <ol><li> Spin giù 2 milioni di cellule (controllo e cloni resistenti) (500 g per 5 minuti) a 15 ml fiale coniche sia gDNA e la raccolta di RNA (quindi 2 x 2 milioni). </li><li> Lavare due volte con PBS 1x e congelare pellet nel -80 ° C fino al momento per l&#39;isolamento. </li><li> Utilizzare un kit di estrazione commerciale per isolare RNA o gDNA secondo il protocollo del produttore. </li><li> Inviare campioni per sequenziamento di prossima generazioneutilizzando il protocollo del venditore 10. </li></ol> 6. Bioinformatica analisi di campioni (intero-exome sequencing) <ol><li> Preprocess sequenza di dati secondo una prassi DNA-ss gasdotto migliori 16. <ol><li> Segna tutte le letture di riferimento GRCh37 genoma umano utilizzando BWA 17. Convertire compressi allineamenti SAM formattati in formato compresso con BAM Samtools 18. Ordina allineamenti da coordinare con Samtools. Aggiungere i gruppi di lettura che utilizzano Picard. (Per le specifiche BWA, Samtools e Picard comandi, vedi testo aggiuntivo 1, le linee 1-4) </li><li> Segna tutti i duplicati legge utilizzando il comando MarkDuplicates dallo strumento Picard set 19. Indice questo file con Samtools. (Testo supplementare 1, le linee 5-6) </li><li> Per ridurre al minimo le basi corrispondenti in tutti letture, riallineare legge localmente a regioni che ospitano piccole inserzioni o delezioni usando un realigner indel 20. (Testo supplementare 1, le linee 7-8) </li><li> Per migliorare ulteriormente la accuracy di chiamata variante, i punteggi di qualità di base empiricamente ricalibrare utilizzando uno strumento di punteggio di ricalibrazione qualità di base. Lo strumento di calibrazione della qualità di base dovrebbe non solo corretta punteggio iniziale di qualità, ma anche tener conto di covarianza delle diverse caratteristiche, incluso il gruppo di leggere, ciclo della macchina, posizione di base, e il contesto dinucleotide (precedente + basi attuali). Generare BAM ricalibrato con PrintReads Picard. (Per i comandi specifici per questo passaggio, vedere Testo supplementare 1, linee 9-10) </li><li> Ripetere i passaggi 6.1.1 tramite 6.1.4 (Testo supplementare 1, linee 1-10) per ogni campione sequenziato. </li></ol></li><li> Identificare variazione singolo nucleotide (SNV) in ogni clone utilizzando una variante abbinato chiamando tool19, 21-23. Per ogni clone sequenziato, eseguire variante abbinato chiamare utilizzando il clone dei genitori come l&#39;abbinata &quot;normale&quot;. (Testo supplementare 1, riga 11) </li><li> Filtro ricorrenti, varianti di alta qualità e prepararsi per annotazioni con un strumento di annotazione variante 24. Deprioritize variants non è comune a tutti i cloni resistenti. (Vedi lo script R nel testo aggiuntivo 2) </li><li> Annotate varianti con uno strumento di annotazione 25, 26. Molti strumenti di annotazione variante hanno un web app di accompagnamento che permette ai dati di essere caricati e trattati da un server remoto. </li><li> Utilizzare uno strumento di previsione impatto funzionale 27-29 dare priorità le varianti previste di avere elevato impatto funzionale. Come variante di annotazione, diversi strumenti sono disponibili per la previsione di impatto funzionale attraverso una interfaccia web. </li></ol>

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Spese di pubblicazione per questo articolo sono a carico H3 biomedicina.

Selezione della linea di cellule (s): Caratterizzazione dello stato genetico e instabilità genomica Senza dubbio, il fattore più importante nello scoprire con successo clinicamente rilevanti meccanismi di resistenza è la selezione iniziale linea cellulare. Due fattori devono essere considerati. In primo luogo, l&#39;obiettivo di selezionare la riga cellulare (s) dello stesso lignaggio / sottotipo ospitare i tratti genetici che definiscono della malattia (ad es., BRAF V600E nel melanoma). Interrogatorio di dati pubblicamente disponibili trascrittomica e mutazione per entrambe le linee di cellule 30-32 e tumori primari / metastasi per una serie di indicazioni 33,34 faciliterà il processo di selezione. Sebbene l&#39;identificazione di linee cellulari con clinicamente rilevanti alterazioni genetiche è ideale, in alcuni casi questo può non essere possibile a causa della mancanza di linee cellulari disponibili o fattibile a causa di fattori come la difficoltà e la lunghezza del processo di screening. <p class="jove_content"&gt; Per quanto riguarda il punto di cui sopra, un secondo fattore da considerare poi durante la selezione della linea cellulare è la facilità o la fattibilità della resistenza screening utilizzando la linea desiderata. Per esempio, fattori quali la proliferazione e tassi di mutazione intrinseci possono influire notevolmente sulla velocità di scoperta. A tal fine, le linee cellulari possono essere utilizzati con cinetica di crescita più veloci e carente nei meccanismi MMR DNA nella speranza che emergere della resistenza spontanea può essere accelerata 35. Sulla base del database di COSMIC, esistono diverse linee cellulari candidato con deficit in uno dei due geni mutati spesso MMR, MSH2 o MLH1 (Tabelle 2 e 3). In alternativa, se non esistono linee di cellule di interesse difetti tenendo MMR, trattamento acuto con mutageni chimici o fisici DNA reattivi come l&#39;agente alchilante N -ethyl- N -nitrosourea (ENU) può essere utilizzato per migliorare instabilità genomica. Sebbene entrambi gli approcci possono s in modo significativoHorten il tempo per ottenere cloni resistenti e follow-up di sequenziamento, test funzionali rigorosi dovrebbe essere eseguita su geni candidati come un maggior numero di non-funzionale, le mutazioni passeggeri rischiano di emergere. SNVs può essere rango ordinato di massimizzare le possibilità per l&#39;identificazione di mutazioni funzionalmente rilevanti. In primo luogo, la scelta di quelle mutazioni che sono ricorrenti nei cloni indipendenti aumenterà la probabilità che queste mutazioni sono i driver di resistenza. Nel caso ricorrenti mutazioni non sono identificate, concentrandosi su SNVs che si adattano il meccanismo di azione del farmaco (per esempio, il bersaglio farmaco o un effettore noto valle del bersaglio di farmaci) possono essere significative. In ultima analisi, il gold standard è sempre valutazione sperimentale di attività di resistenza-conferimento dei SNVs candidati di espressione cDNA ectopica nelle cellule parentali droga sensibili. DNA vs RNA sequenziamento Una volta cloni resistenti sono stati generati, DNA e / o RNApuò essere sequenziato a seconda della necessità. Sequenziamento del DNA, o exome o tutto il sequenziamento del genoma, consentirà l&#39;identificazione di linea germinale e somatici varianti, come SNPs, indels e numero di esemplari varianti. Considerando che il rapporto costo-amichevole sequenziamento dell&#39;esoma concentra sulla generazione di legge da regioni codificanti note, tutto il sequenziamento del genoma genererà dati di sequenziamento per l&#39;intero genoma, che possono facilitare l&#39;identificazione delle mutazioni in elementi non codificanti, come esaltatori o miRNA 36. Tuttavia, poiché i dati di espressione genica non è misurato durante il sequenziamento del DNA, è difficile prevedere quale mutazione (s) è probabile che sia un driver funzionale. A questo proposito, la sequenza di RNA, quanto più costosi, offre questo vantaggio. Il fatto che la mutazione chiamante viene eseguita solo su specie di RNA espressi aumenta la probabilità che la mutazione di interesse può essere un driver funzionale. Oltre a consentire un sondaggio più mirato di mutazioni per i test funzionali di follow-up, l&#39;RNA sequenza ancheoffre il vantaggio di essere in grado di identificare le alterazioni del gene di espressione, lo splicing alternativo e nuove specie di RNA chimerici, tra cui fusioni geniche che possono anche servire come potenti fattori di resistenza. Bioinformatica gasdotto Comandi di esempio sono forniti a scopo illustrativo, ma la documentazione più dettagliata e tutorial sono disponibili presso il Broad Institute 16 e devono essere letti attentamente prima di iniziare l&#39;analisi NGS. I seguenti comandi sono progettati per un ambiente di shell UNIX su un sistema su cui sono pre-installati tutti gli strumenti ei dati di riferimento. Questi comandi presuppongono anche file FASTQ contenente sequenza accoppiato-end legge da due campioni, il nome di &quot;genitori&quot; e &quot;resistente&quot;, sono stati ricevuti dal fornitore e inserito nella directory &quot;data&quot;. Nella maggior parte dei casi questi comandi devono essere adattati o ottimizzati per una specifica applicazione utilizzando aggiuntivo di argomenti da riga di comandocumenti (ad esempio, l&#39;aggiunta di &quot;-t 8&quot; al comando BWA permette il funzionamento multithreaded su 8 core CPU). Gruppi di lettura (che assegnano allineamenti di campioni biologici), spesso devono essere aggiunte ai file BAM anche se vi è un solo campione per file bam, al fine di soddisfare i requisiti di formato di file per alcuni strumenti. Leggi parametri del gruppo rgid, RGSM, RGPL, RGPU, e RGLB può essere stringhe arbitrarie che descrivono il nome del campione, la piattaforma di sequenziamento, e la strategia biblioteca. In vitro vs test in vivo Anche se diversi meccanismi di resistenza individuati dalla selezione in vitro sono stati verificati per essere clinicamente rilevante, esiste la possibilità che i meccanismi non possono servire meccanismi come rilevanti o predominanti di resistenza clinica. Una ragione di ciò può includere un ruolo essenziale per il microambiente in guida resistenza alla terapia, un componente che è privo del protocollo sperimentale / setup discussed finora. Infatti, diversi studi hanno dimostrato che gli agenti anti-cancro che sono in grado di uccidere le cellule tumorali vengono rese inefficaci quando le cellule tumorali sono coltivate in presenza di cellule stromali che implicano meccanismi di resistenza innata conferite dal stroma 37,38. Per identificare questi meccanismi di resistenza acquisita stroma-indotta, si può prendere in considerazione l&#39;esecuzione di co-coltura in vitro o in saggi di resistenza del tumore in vivo. Dal momento che il primo test è abbastanza complesso, molti hanno fatto ricorso a generare xenotrapianti tumorali resistenti ai farmaci per affrontare il potenziale ruolo dello stroma di resistenza all&#39;avanzamento. Tali studi hanno scoperto entrambi identici 5 e 39 uniche meccanismi di resistenza rispetto alla selezione in vitro, il che implica che il stroma può effettivamente giocare un ruolo in quest&#39;ultimo. Tuttavia, si deve essere consapevoli del periodo di tempo ci vorrà per generare tali tumori resistenti e la complessità del follow-up genomica analisi complexities dovute alla eterogeneità molecolare e cellulare intra-tumorale. Identificazione del target Oltre a scoprire i meccanismi di resistenza ai farmaci, questo approccio profiling genomico basato NGS può essere applicato anche per identificare bersagli cellulari di sonde chimiche. Storicamente, più metodi imparziali sono stati utilizzati per identificare i meccanismi cellulari di azione e obiettivi di sostanze chimiche a basso peso molecolare con attività biologiche, tra cui la purificazione di affinità accoppiato con la proteomica quantitativa, lievito metodi genomici, lo screening RNAi, e l&#39;inferenza computazionale approcci 40. Come estensione di delucidazione dei meccanismi di farmaco-resistenza con sede a NGS profilo genomico o trascrittomica di popolazioni cellulari fenotipicamente resistenti, l&#39;identificazione di varianti uniche ricorrenti a singolo nucleotide (SNVs) o alterazioni di espressione che consentono di resistenza in grado di offrire approfondimenti obiettivi funzionali cellulari di composti. Tla sua è basato sull&#39;idea che un sottoinsieme di meccanismi di resistenza osservati può comportare ricorrenti mutazioni nei geni che codificano le proteine ​​bersaglio diretti della piccola molecola. Recentemente, diverse segnalazioni convalidato l&#39;utilità del metodo, in particolare combinando con altri approcci, tra cui su larga scala linea di cellule di cancro sensibilità profilatura, a rivelare i bersagli cellulari di piccole molecole sonde 9,10.

Caratterizzazione molecolare dettagliata dei genomi tumorali di tecnologie di sequenziamento robuste e strumenti analitici migliorata dati ha portato alla scoperta di alterazioni genetiche chiave per specifici tipi di cancro 1,2. Sviluppo di terapie mirate per queste lesioni genetiche, come l&#39;HER2, BCR-ABL, EGFR e ALK, hanno notevolmente migliorato la qualità di vita dei pazienti 1,2. Tuttavia, nonostante la specificità di questo approccio, la risposta clinica alla maggior parte delle terapie singole è stato sub-ottimale come resistenza emerge in definitiva. Recentemente, sono stati compiuti progressi significativi nella comprensione delle basi molecolari di resistenza a terapie mirate. Curiosamente, sta diventando evidente che un meccanismo di spicco della resistenza comporta persistente attività di destinazione / percorso. Come un caso in questione, il recettore degli androgeni (AR) -directed trattamento enzalutamide del cancro alla prostata porta ad un arricchimento di attivare mutazioni nel AR sé, mantenendo-AR segnalazione output in presenza dell&#39;inibitore 3-5. Questa conoscenza ha portato ad una campagna aggressiva per 1) sviluppare antagonisti di terza generazione che possono continuare a sopprimere sia WT e la funzione mutante-AR in enzalutamide resistenti PCa 3 e 2) identificare potenziali nodi a valle della segnalazione AR che possono essere mirati per intervento terapeutico . Allo stesso modo, la resistenza ad altre classi di inibitori come quelli di targeting EGFR, BRAF e ABL spesso portano a mutazioni che riattivano l&#39;originale avvincente chinasi 1. Con la consapevolezza che la resistenza emerge inevitabilmente maggior parte dei pazienti, sviluppare approcci per portare rapidamente questi meccanismi alla luce permetterà lo sviluppo di terapie di follow-up efficaci. Un approccio che viene ampiamente utilizzato è quello di analizzare la genomica dei tumori refrattari clinici relativi a tumori non pretrattati o sensitive per identificare arricchimenti / esaurimento nelle lesioni genetiche che possono essere suscettibili di dscoperta tappeto. Nonostante la sua promessa, ci sono due principali responsabilità di questo approccio che ostacolano la scoperta rapida. In primo luogo, l&#39;accesso tempestivo a materiale tumorale per l&#39;interrogatorio genomica può servire come un ostacolo significativo nel passaggio da una terapia per curare. In secondo luogo, deconvoluzione della miriade di lesioni genetiche in ambito resistente può essere difficile dato che i tumori possono presentare significative intra-tumorale eterogeneità 6,7. Alla luce di queste sfide, c&#39;è stato un aumento dipendenza scoperta preclinico di meccanismi di resistenza. Questo approccio può consentire l&#39;identificazione di meccanismi di resistenza importanti prima degli studi clinici 1 che possono guidare le strategie di gestione clinica alternative in quei pazienti che portano questi meccanismi sia prima della terapia oa seguito di insorgenza di resistenza. Uno di questi strumenti scoperta preclinica che viene ampiamente utilizzato è quello di applicare imparziali schermi RNAi funzionali. Per l&#39;esamepio, Whittaker e colleghi hanno applicato uno schermo RNAi genoma scala per identificare che la perdita di NF1 media resistenza agli inibitori della RAF e MEK attraverso MAPK pathway di attivazione sostenuta 8. Questi risultati sono stati trovati per essere clinicamente rilevante come la perdita-di-funzione mutazioni in NF1 sono stati osservati in BRAF cellule tumorali -mutant che sono intrinsecamente resistenti alla inibizione RAF e nei tumori melanoma resistenti a vemurafenib attivazione 8. Tuttavia, nonostante il successo di questo approccio, molti obiettivi di rilevanza clinica sono spesso non identificati, probabilmente a causa dei pregiudizi perdita-di-funzione di questo approccio. Per contro, uno strumento meno parziale per la scoperta preclinica di meccanismi di resistenza comporta la generazione di linee cellulari resistenti di esposizione prolungata a composti di interesse accoppiato con base-NGS profilo genomico o transcriptomic. Questo approccio è stato implementato con successo da diversi gruppi per identificare spontanearicorrenti varianti nucleotide o espressione alterazioni singole che consentono la resistenza 5,9,10. Ad esempio, una mutazione F876L ricorrente in AR è stato recentemente scoperto in cloni resistenti in vitro 3-5 e nei tumori xenotrapianto in vivo 5 prima di identificazione di questa mutazione nella clinica 4. Molto recentemente, Bhang e colleghi (2015) 11 usato ClonTracer in due modelli clinicamente rilevanti per dimostrare che la maggior parte dei cloni resistenti che si presentano durante l&#39;esposizione prolungata del farmaco facevano parte di un pre-esistente sottopopolazione suggerendo che più funzionalmente rilevanti mutazioni sono probabilmente già preesistente che diventano selezionati per durante la selezione 11. In contrasto con il profilo genomico di tumori discussi precedentemente, questo approccio beneficia meno eterogeneità cloni resistenti &quot;omogenei sono usati per l&#39;analisi genetica facilitare la dissezione più accurata dei potenziali conducenti. Furthermminerale, eccitante, oltre alla possibilità di scoprire meccanismi di resistenza, questo metodo può essere applicato anche per identificare i meccanismi cellulari di azione e obiettivi di piccole molecole bioattive per cui questa informazione è sconosciuta 10. Dati i chiari vantaggi e le molteplici usi di questo approccio, qui vi presentiamo un protocollo dettagliato successo di un tale schermo preclinico per massimizzare il potenziale di scoperte clinicamente significativi.

<table><tbody><tr><td>48-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-86&amp;nbsp;</td><td>Expanding clones</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-588</td><td>Generating GI&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; curves</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Viability testing</td></tr><tr><td>Cloning discs (3 mm)</td><td>Sigma</td><td>Z374431</td><td>Picking clones</td></tr><tr><td>Sterile forceps</td><td>Unomedical</td><td>DF8088S</td><td>Picking clones</td></tr><tr><td>RNeasy Plus RNA extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Isolating RNA</td></tr><tr><td>Blood and Tissue DNeasy extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>69581</td><td>Isolating gDNA</td></tr><tr><td>GATK</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Indel realigner</td></tr><tr><td>MuTect</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Paired variant calling tool</td></tr><tr><td>Oncotator</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Variant annotation tool</td></tr><tr><td>MutationAccessor</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Functional impact prediction tool</td></tr></tbody></table>

implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Per massimizzare il potenziale per scoprire i conducenti funzionali chiave di resistenza, selezionare cloni di cellule singole per l&#39;espansione, i test fenotipici e sequenziamento. Come illustrato nella Figura 4A, cellule HCT116 trattati per un periodo prolungato con composto citotossico # 1 portato alla nascita spontanea di cloni resistenti che ha continuato a crescere durante il trattamento (cerchi neri tratteggiate). Questi cloni sono stati raccolti usando approccio # 1 evidenziata in figura 3 e successivamente ampliato per l&#39;analisi fenotipica. Come mostrato in Figura 4B, cloni resistenti 1-3 tutti mostravano resistenza significativa al composto # 1 e la sua stretta composto analogica # 2 (maggiore redditività / crescita), mentre tutti i cloni hanno mostrato sensibilità a un estraneo VELCADE composto citotossico. A seguito della conferma della resistenza fenotipica, gDNA è stato isolato e presentato per intero-exome analisi di sequenziamento. Strumenti bioinformatici sono stati applicati a restringere in su quelle varianti strutturali chesono 1) ricorrenti e 2) hanno il potenziale di impatto funzionale (Figura 5A). Varianti strutturali che hanno incontrato questi due criteri sono stati confermati da uno strumento di sequenziamento indipendente. Come illustrato nella figura 5B, una mutazione missenso eterozigote che è stato identificato utilizzando intero exome sequenziamento è stata confermata usando il metodo di sequenziamento Sanger (pannello superiore, sequenza WT; pannello inferiore, sequenza mutante). Dopo la conferma di sequenza, la linea cellulare parentale originariamente utilizzato per il test di resistenza è stata geneticamente per esprimere il cDNA mutante per confermare funzionalmente il ruolo della mutazione. Come illustrato in figura 6, mentre sovraespressione del cDNA WT omesso di conferire resistenza, espressione del cDNA mutante conferito significativamente la resistenza fenotipica forzato al composto 1 #, confermando il ruolo funzionale di questa variazione strutturale come driver di resistenza. Tutti i reagenti utilizzati per questo esperimento sono riportati nella tabella 1 </s<html> trong&gt;. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> Figura 1. Disposizione di piatti dosaggio e controllo. Tonalità blu, pozzi di trattamento composti. Ombra bianca, solo medio. Composti vengono diluiti 1: 4 e vengono somministrati in triplice copia (BD o EG). 2 composti possono essere applicati per piastra. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> Figura 2. Curve vitalità Rappresentante. Red linea tratteggiata rappresenta il giorno 0 lettura. Ascisse indica dosi crescenti del composto a destra e asse y rappresenta redditività rispetto ai pozzetti di controllo DMSO. GI 100 = dose utilizzata per ottenere l&#39;inibizione della crescita del 100%; GI 50 = dose utilizzata per ridurre la vitalità al 50% del controllo DMSO. _upload / 52879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Due approcci per la raccolta cloni resistenti per l&#39;espansione. Approccio 1- uso pipetta per raccogliere e trasferire i cloni ben definiti a piastre 48 pozzetti. Approccio 2- uso tripsina-imbevuto dischi clonazione per sollevare cloni e trasferire alle piastre 48 pozzetti. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> Figura 4. Conferma della resistenza raggiunta per i cloni HCT116 al composto # 1 in vitro. (A) Composto # cloni HCT116 1-resistenti emersa a seguito continuo selezione di tre settimane. (B) La vitalità di cloni di controllo e resistenti è stato testato dopo il trattamento 72 ore con vari composti. Compound # 2 è uno stretto analogo di composto # 1. Velcade è stato utilizzato come agente di controllo citotossico. I dati sono mostrati come media + deviazione standard delle tre repliche biologiche. Figura 5. Identificazione di un unico, ricorrenti mutazione (varianti a singolo nucleotide, SNVs) del gene A nel composto # cloni HCT116 1-resistenti. Flusso (A) I lavori per identificare SNVs presenti in tutti i cloni resistenti e prevede di avere un alto impatto funzionale per MutationAssessor. (B) La conferma della mutazione nel gene Un dal Sanger sequenziamento. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> Figura 6. Re-espressione del gene mutato Una resistenza conferita al composto # 1 in vitro. La vitalità delle linee cellulari HCT116 ingegnerizzate è stato testato dopo il trattamento 72 ore con mescola # 1. Linee di cellule mutanti HCT116-WT o sono stabilmente esprimendo WT o cDNA mutanti del gene A, rispettivamente. I dati sono mostrati come media + deviazione standard of tre repliche biologiche. <table><tbody><tr><td> Nome di esempio </td><td> Amminoacido </td><td colspan="2"> Tessuto primario </td><td> Zigosità </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2"> cervice </td><td> Eterozigote </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2"> cervice </td><td> Eterozigote </td></tr><tr><td> CML-T1 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2"> pelle </td><td> Eterozigote </td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.Q130fs * 2 </td><td colspan="2"> ovaia </td><td> Eterozigote </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> ovaia </td><td> Eterozigote </td></tr><tr> &lt;td&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2"> seno </td><td> Eterozigote </td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> LNCaP </td><td> p.? </td><td colspan="2"> prostata </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> LoVo </td><td> p.? </td><td colspan="2"> intestino crasso </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> MOLT-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> NALM-6 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2"> intestino crasso </td><td> Eterozigote </td></tr><tr><td> Skut-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2"> endometrio </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> Skut-1B </td><td> pL787fs * 11 </td><td colspan="2"> endometrio </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Omozigote </td></tr></tbody></table> Tabella 1. MSH2 linee cellulari -mutated. Linea cellulare (nome del campione), aminoacido sostituzione, il lignaggio di origine e il zigosità sono indicati. <table><tbody><tr><td> Nome di esempio </td><td> Amminoacido </td><td colspan="2"> Tessuto primario </td><td> Zigosità </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Eterozigote </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Eterozigote </td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2"> intestino crasso </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> p.? </td&gt; <td colspan="2"> prostata </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2"> intestino crasso </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2"> ovaia </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2"> stomaco </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> P30-OHK </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> PR-Mel </td><td> p.? </td><td colspan="2"> pelle </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> REH </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td&gt; <td> Omozigote </td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> ovaia </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> SNU-1544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2"> intestino crasso </td><td> Eterozigote </td></tr><tr><td> SNU-1746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2"> intestino crasso </td><td> Omozigote </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2"> pancreas </td><td> Eterozigote </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> pancreas </td><td> Eterozigote </td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> pancreas </td><td> Eterozigote </td></tr></tbody></table> Tabella 2. MLH1 linee cellulari -mutated. Linea cellulare (nome del campione), aminoacido sostituzione, il lignaggio di origine e il zigosità sono indicati.

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Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

La resistenza ai farmaci per terapie mirate è molto diffusa e la necessità di individuare meccanismi di resistenza - prima o dopo l&#39;insorgenza clinica - è fondamentale per guidare le strategie alternative di gestione clinica. Qui, presentiamo un protocollo per accoppiare derivazione di linee farmaco-resistenti in vitro con sequenziamento per accelerare scoperta di questi meccanismi.

Implementazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance saggi: massimizzare il potenziale per scoprire clinicamente rilevanti Resistenza Meccanismi

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

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Medicine

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

10.5K Views.  H3 Biomedicine.  La resistenza ai farmaci per terapie mirate è molto diffusa e la necessità di individuare meccanismi di resistenza - prima o dopo l'insorgenza clinica - è fondamentale per guidare le strategie alternative di gestione clinica. Qui, presentiamo un protocollo per accoppiare derivazione di linee farmaco-resistenti in vitro con sequenziamento per accelerare scoperta di questi meccanismi. 

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Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

Utilizzando RNA-sequenziamento per rilevare Novel Splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli di cancro

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

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Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to overcome this challenge. Here, a 2-step dose-escalation method for establishing dual-resistance to an epidermal growth factor receptor (EGFR)-tyrosine kinase inhibitor (TKI), gefitinib, and a MET-TKI, PHA665752, is described. This method is based on simple stepwise dose-escalation of inhibitors for inducing acquired resistance in cell lines. The alternate method for generating resistant sublines involves exposing the cells to high concentrations of the inhibitor in one step. The stepwise dose-escalation method has a higher possibility of successfully inducing acquired resistance than this method. Activating EGFR mutations are biomarkers of a response to treatment with EGFR-TKI, which is an applied first-line treatment for non-small cell lung cancers (NSCLC) that harbor these mutations. However, despite reports of effective responses, the use of EGFR-TKI is limited because tumors inevitably acquire resistance. The major mechanisms behind EGFR-TKI resistance include a secondary mutation at the gatekeeper site, T790M in exon 20 of EGFR, and a bypass signal of MET. Thus, a potential solution for this issue would be a combination of EGFR-TKI and MET-TKI. This combined treatment has been shown to be effective in an in vitro study model. Acquired gefitinib-resistance was established through MET-amplification by stepwise dose-escalation of gefitinib for 12 months, and a cell line named PC-9MET1000 was generated in a previous study. To further investigate the mechanisms of acquired MET-TKI and EGFR-TKI resistance, a MET-TKI, PHA665752, was administered to these cells with stepwise dose-escalation in the presence of gefitinib for 12 months. This protocol has also been successfully applied for a number of combination therapies to establish acquired resistance to other inhibitor molecules.

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

An in vitro method for establishing dual resistance to an EGFR-TKI and a MET-TKI in cancer cells is described. This method is useful for developing treatments for patients with EGFR-mutations, who exhibit disease progression despite EGFR-TKI treatment with MET-amplification. It can also be modified for inhibitors targeting other molecules.

Che istituisce la doppia resistenza all'EGFR-TKI e incontrato-TKI nel polmone Adenocarcinoma cellule In Vitro con una procedura 2-passo Dose-escalation

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Protocolli per Robust erbicidi Test della resistenza in diversi Weed Specie

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

Ambiente

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more impressive clinical efficacy and minimized adverse effects than traditional treatments, drug resistance has become the main limitation to their benefits. Several preclinical in vitro/in vivo models of acquired resistance to targeted agents in clinical practice have been developed mainly by using two strategies: i) genetic manipulation for modeling genotypes of acquired resistance, and ii) in vitro/in vivo selection of resistant models. In the present work, we propose a unifying framework, for investigating the underlying mechanisms responsible for acquired resistance to targeted therapeutic agents, starting from the generation of drug-resistant cellular subclones to the description of silencing procedures used for restoring the sensitivity to the inhibitor. This simple time- and cost-effective approach is widely applicable, and could be easily extended to investigate resistance mechanisms to other targeted therapeutic drugs in different tumor histotypes.

This is a time- and cost-effective in vitro protocol investigating the mechanisms of acquired resistance to targeted therapeutic agents, which is a highly unmet medical need in cancer management.

Alla ricerca di Driver delle vie di acquisito resistenza alla terapia mirata: generazione farmacoresistenti Subclone e sensibilità ripristino di Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

Identificazione di High-throughput di combinazioni di farmaci sinergici con il metodo2 di sovrapposizione

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Genetica

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable preclinical models that can accurately predict patient responses. One of the disadvantages of existing preclinical models is the inability to contextually preserve the human tumor microenvironment (TME) and accurately represent intratumoral heterogeneity, thus limiting the clinical translation of data. By contrast, by representing the culture of live fragments of human tumors, the patient-derived explant (PDE) platform allows drug responses to be examined in a three-dimensional (3D) context that mirrors the pathological and architectural features of the original tumors as closely as possible. Previous reports with PDEs have documented the ability of the platform to distinguish chemosensitive from chemoresistant tumors, and it has been shown that this segregation is predictive of patient responses to the same chemotherapies. Simultaneously, PDEs allow the opportunity to interrogate molecular, genetic, and histological features of tumors that predict drug responses, thereby identifying biomarkers for patient stratification as well as novel interventional approaches to sensitize resistant tumors. This paper reports PDE methodology in detail, from collection of patient samples through to endpoint analysis. It provides a detailed description of explant derivation and culture methods, highlighting bespoke conditions for particular tumors, where appropriate. For endpoint analysis, there is a focus on multiplexed immunofluorescence and multispectral imaging for the spatial profiling of key biomarkers within both tumoral and stromal regions. By combining these methods, it is possible to generate quantitative and qualitative drug response data that can be related to various clinicopathological parameters and thus potentially be used for biomarker identification.

This paper describes methods for the generation, drug treatment, and analysis of patient-derived explants for assessing tumor drug responses in a live, patient-relevant, preclinical model system.

Espianti tumorali derivati dal paziente come piattaforma preclinica "live" per prevedere la resistenza ai farmaci nei pazienti

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve survival in patients with acute myeloid leukemia (AML). A small fraction of leukemic cells that survive chemotherapy have a poised epigenetic state to tolerate chemotherapeutic insult. Further exposure to chemotherapy allows these drug persister cells to attain a fixed epigenetic state, which leads to altered gene expression, resulting in the proliferation of these drug-resistant populations and eventually relapse or refractory disease. Therefore, identifying epigenetic modulations that necessitate the survival of drug-resistant leukemic cells is critical. We detail a protocol to identify epigenetic modulators that mediate resistance to the nucleoside analog cytarabine (AraC) using pooled shRNA library screening in an acquired cytarabine-resistant AML cell line. The library consists of 5,485 shRNA constructs targeting 407 human epigenetic factors, which allows high-throughput epigenetic factor screening.

High-throughput RNA interference (RNAi) screening using a pool of lentiviral shRNAs can be a tool to detect therapeutically relevant synthetic lethal targets in malignancies. We provide a pooled shRNA screening approach to investigate the epigenetic effectors in acute myeloid leukemia (AML).

Screening della libreria di shRNA in pool per identificare i fattori che modulano un fenotipo di resistenza ai farmaci

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Un metodo di monitoraggio Affordable HIV-1 resistenza ai farmaci per le impostazioni limitate risorse

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Medicina

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Valutare l&#39;efficacia delle Cancer Drug Sensibilizzazione<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the potential of targeting the kinase in cancers by effectively treating the CML patients. This observation revolutionized drug development to target the oncogenic kinases implicated in various other malignancies, such as, EGFR, B-RAF, KIT and PDGFRs. However, one major drawback of anti-kinase therapies is the emergence of drug resistance mutations rendering the target to have reduced or lost affinity for the drug. Understanding the mechanisms employed by resistant variants not only helps in developing the next generation inhibitors but also gives impetus to clinical management using personalized medicine. We reported a retroviral vector based screening strategy to identify the spectrum of resistance conferring mutations in BCR/ABL, which has helped in developing the next generation BCR/ABL inhibitors. Using Ruxolitinib and JAK2 as a drug target pair, here we describe in vitro screening methods that utilizes the mouse BAF3 cells expressing the random mutation library of JAK2 kinase.

Emergence of genetic resistance against kinase inhibitor therapy poses significant challenge for effective cancer therapy. Identification and characterization of resistant mutations against a newly developed drug helps in better clinical management and next generation drug design. Here, we describe our protocol for in vitro screening and validation of resistant mutations.

Un metodo per lo screening e validazione di mutazioni resistenti contro Kinase Inhibitors

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

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