Name: protocol for studying extinction of conditioned fear in naturally cycling female rats
Uploaded: 2015-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats at JoVE.com

Mohammed R. Milad is supported by NIMH grant R01 MH097880 and institutional funds from the Department of Psychiatry at MGH.

NOTA: Tutte le procedure di questo protocollo sono stati approvati dalla sottocommissione per la ricerca cura degli animali, che serve come la cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) per il Massachusetts General Hospital, e sono in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute. 1. Animal Housing e procedura Handling <ol><li> All&#39;arrivo, casa adulti Sprague Dawley femmine circa 8-10 settimane di età (del peso di 200-225 g) in gruppi di bidoni di plastica 3-4 pollici con biancheria da letto di cippato. A mantenere una dieta ad libitum accesso a Chow e acqua e un 12 hr luce / buio ciclo. Lasciare ratti per ambientarsi alla condizioni abitative e animali struttura per un minimo di 1 settimana. NOTA: Tutte le procedure di questo manoscritto sono condotti durante il ciclo di luce. </li><li> In seguito a questo periodo di acclimatazione, di gestire tutti gli animali per 5 minuti ciascuno per 2-3 giorni. Correttamente prendere i topi uno alla volta (sostenuto dal torso e non per la coda),tenerli saldamente, e li animali durante questo tempo. Maneggiare animali che appaiono più stressati, nervosi, ansiosi o per periodi di tempo più lunghi. Fate questo per ridurre al minimo la manipolazione dello stress, che possono incidere sui seguenti operazioni in questo protocollo. NOTA: Il numero di giorni e la quantità di gestire gli animali può variare tra i diversi laboratori di tempo; tuttavia, questi dovrebbero essere coerenti tra esperimenti all&#39;interno dello stesso laboratorio. </li></ol> 2. Monitoraggio del ciclo estrale: tamponi vaginali sbavature e Procedura di colorazione <ol><li> Preparare la soluzione salina allo 0,9% (cloruro di sodio sciolto in acqua distillata). Inumidire un cotton fioc in questa soluzione. Asciugare la punta con un tovagliolo di carta per evitare di sovrasaturazione, che potrebbe portare il campionario inadeguata o la perdita di cellule. Tenendo la coda verso l&#39;alto dalla apertura vaginale, inserire delicatamente la punta di cotone nel canale vaginale e tirare intorno alle mura di catturare le cellule vaginali sciolti. </li><li> Se l&#39;animale urina sul lettinoTip Ton, sostituirlo con uno nuovo, come la contaminazione delle urine sarà difficile per l&#39;identificazione di fase. Fare molta attenzione per non causare disagi all&#39;animale durante questa procedura, perché l&#39;esposizione allo stress sarà interrompere il ciclo estrale. Quando tampone, mirare a raggiungere un inserimento rapido e il ritiro che non sia troppo profonda da ridurre al minimo stimolo in più per la cervice, che può indurre pseudogravidanza. NOTA: Pseudopregnancy può essere identificato come un ciclo estrale aciclico che in genere dura per circa 12 giorni, cioè giorni consecutivi di diestrus 25. </li><li> Rimuovere con attenzione la punta dell&#39;applicatore e rotolare su un vetrino da microscopio pre-etichettati. Evitare premendo troppo duro come troppo liquido sul vetrino può rendere l&#39;identificazione fase difficile, una volta asciutta. NOTA: Una diapositiva può contenere più giorni per ogni animale, anche se questo può essere fatto in base alle preferenze individuali. </li><li> Assicurarsi che i trasferimenti del campione sul vetrino. Raccogliere campioni per severAL giorni consecutivi in ​​una diapositiva per poter meglio traccia e identificare quotidiane fasi estro modifiche. NOTA: Se possibile, è ideale anche se le persone che raccolgono campioni rimangono le stesse per tutti gli animali. </li><li> Una volta che la slitta è asciutto, iniziare il protocollo di colorazione per l&#39;identificazione di fase. Utilizzando il kit di colorazione (vedi Tabella dei Materiali), immergere i vetrini 10 volte in fissativo (azzurro), 10 volte in soluzione colorante (rosa), e 5 volte in soluzione di contrasto (viola). Sciacquare scivola delicatamente con acqua corrente. Lasciate asciugare completamente le diapositive prima visione al microscopio. NOTA: Il lungo ciclo estrale tipicamente 4-5 giorni è composto da (in questo ordine): estro (E), metestrus (M), diestrus (D), e proestrus (P) 26. Estrus è caratterizzata da blu, cellule corneo, metestrus dai leucociti e una combinazione di cellule nucleate e cornified, diestrus è simile a metestrus in presenza di tipi cellulari eccetto quando sono molto scarse, e proestrus da aggregati viola tintocellule nucleate di (figura 1). Ci sono varie procedure di colorazione, oltre a quelli sopra descritti, che sono ugualmente efficaci per striscio vaginale citologia. </li><li> Raccogliere i campioni per almeno due cicli completi (~ 8-10 giorni) al fine di monitorare le fasi accuratamente prima sperimentazione. Essere coerente con l&#39;ora del giorno del prelievo del campione. Raccogliere campioni striscio vaginale giornaliero durante e fino alla fine dell&#39;esperimento. </li></ol> 3. Pre-esposizione <ol><li> Prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento, pre-esporre gli animali al condizionamento camere consentono agli animali di acclimatarsi al contesto (camere di condizionamento) prima di ogni prova comportamentale. <ol><li> Pre-esporre le femmine alle camere di condizionamento (che si trova in scatole-attenuazione del suono) con le luci di casa avanti per 20-30 minuti al giorno per 3 giorni prima di ogni sperimentazione. Assegnare scatola sono pre-esposta come loro camera per lo studio. Pulire accuratamente tlui scatole (pareti e vassoi) tra le sessioni e gli animali per eliminare gli odori in quanto possono influenzare il comportamento e ciclo estrale. </li></ol></li></ol> 4. Giorno 1: assuefazione / Paura condizionata <ol><li> Una volta che gli animali sono stati verificati per essere nella fase estro dei cicli di estro, inizia la fase di assuefazione / condizionamento dell&#39;esperimento 3 giorni. <ol><li> Prendere pre-tone misure basali di congelamento precedenti allo stimolo primo tono condizionata (CS) presentazioni ogni giorno dell&#39;esperimento. A tale scopo, l&#39;acquisizione di punteggi per cento di congelamento (calcolato dividendo i secondi trascorsi immobile per la durata della prova, moltiplicato per 100) durante l&#39;intervallo di tempo stimolo assente all&#39;inizio della prima prova CS-alone prima dell&#39;inizio CS. NOTA: Queste misure possono essere utilizzati per valutare e confrontare i livelli di congelamento basali con quelli durante assuefazione, condizionata, l&#39;estinzione, e richiamo. </li><li> Per condurre la formazione di estinzione durante la fase metestrus,condizionare i topi nel loro ultimo giorno di estro. Tampone e identificare fase estrale (step 2) ogni giorno prima di iniziare il protocollo sperimentale (condizionata / estinzione / richiamo). Poiché la fase di estro può durare più a lungo di un giorno, la storia del ciclo uso per predire la lunghezza delle fasi per determinare quando gli animali sono pronti per iniziare l&#39;allenamento. </li></ol></li><li> Nelle camere di condizionamento, collegare il piano rete foot-shock per un generatore di stimolazione elettrica. Usare un livello di stimolazione di 0,5-0,6 mA come stimolo incondizionato (US). Utilizzare un 4 kHz, 80 dB tono come stimolo condizionato (CS). NOTA: Questi parametri possono variare tra i laboratori e possono essere modificati per il condizionamento ottimale. <ol><li> Se il programma di analisi congelamento richiede segnali visivi (a differenza temporale), co-attivare una luce LED con il tono. Posizionare la luce all&#39;esterno della camera operante, all&#39;interno del fotogramma video. All&#39;inizio di ogni prova, attivare la luce LED e tenerlo accesa finché l&#39;estremità di The di prova. NOTA: Questa luce non è visibile da animali e serve solo come marcatore per l&#39;inizio e la fine del processo entro i file video registrati (da utilizzare per misurare il comportamento di congelamento). </li></ol></li><li> Mettere gli animali nelle camere di condizionamento per 5 studi CS-alone di assuefazione. Subito dopo la sessione di assuefazione, eseguire 7 coppie prove CS-USA del condizionamento alla paura. Assicurarsi che il tono CS dura 30 secondi e coterminates con il 0,5 sec Uniti shock. Eseguire le prove in tutte le sessioni (assuefazione, condizionata, l&#39;estinzione, e richiamo) con un intervallo tra le prove variabile in media 3 minuti. </li><li> Alla fine della sessione di condizionamento, rispedire gli animali loro gabbie a casa e al stabulario fino al giorno successivo. </li></ol> 5. Giorno 2: Estradiolo Preparazione <ol><li> Tampone e identificare la fase estrale per tutti gli animali sottoposti Day 1 di questo protocollo. Preparare estradiolo (noto anche come E2, 17-beta-estradiolo, obeta-estradiolo) per una dose di 15 mcg kg / iniezione sottocutanea con olio di sesamo o 0,9% soluzione salina come veicolo. </li><li> Per calcolare la quantità di estradiolo per prepararsi per le iniezioni, usare i pesi del corpo di tutti gli animali, che sono stati misurati e registrati quando sono stati condizionati al Day 1 del presente protocollo. </li><li> Fare i calcoli di standardizzare il volume somministrato di estradiolo (cioè 0,2 ml) per ratto. Poiché estradiolo è difficile da sciogliere per la sua insolubilità in acqua e richiede un grande volume di solvente per la piccola dose, preparare una soluzione madre mescolando estradiolo in olio di sesamo a fuoco fino a dissoluzione. La soluzione può quindi essere fatto passare attraverso un filtro di 0,22 micron per rimuovere i contaminanti. Ad esempio, aggiungere un volume calcolato di un / 1 ml di soluzione di olio di sesamo magazzino 3.000 mg estradiolo al volume totale di olio di sesamo necessaria per ottenere una dose di 15 mg / kg in un volume di 0,2 ml di iniezione per animale. NOTA: In alternativa, utilizzare altre forme di estrogeni tha<html> t è solubile in acqua e più facile da dissolvere. </li></ol> 6. Giorno 2: Estradiolo Amministrazione / Estinzione Training <ol><li> Amministrare il sottocutanea estradiolo. Sollevare la pelle flaccida tra la scapola per il collo in una presa dolce e inserire l&#39;ago della siringa nel triangolo che si forma dalle pieghe cutanee. </li><li> 30 minuti dopo iniezioni sottocutanee di estradiolo, mettono gli animali nelle camere di condizionamento di nuovo e iniziano la formazione di estinzione. In questa sessione di estinzione, effettuare 20 prove CS-alone, con ogni prova consistente in un 30 secondi, 4 kHz, 80 dB tono, presentato in un intervallo tra le prove variabile in media 3 min. NOTA: L&#39;effetto dell&#39;estradiolo sul richiamo si verifica quando l&#39;estradiolo viene somministrato prima formazione estinzione o immediatamente dopo l&#39;estinzione. L&#39;effetto non è stato osservato 4 ore post-estinzione, per cui si consiglia di iniettare vicino in tempo per l&#39;inizio o alla fine della sessione di allenamento 15. </li></ol>. Le &quot;&gt; 7 Giorno 3: Extinction Recall <ol><li> 24 ore dopo l&#39;allenamento di estinzione, tampone gli animali che hanno completato giorno 1 e 2 del presente protocollo. </li><li> Mettere gli animali nelle loro camere di condizionamento assegnati (stessi come giorno 1 e 2). Iniziare la sessione di richiamo di estinzione con la presentazione di 3 studi CS-alone (le tre prove di richiamo di estinzione), che consiste di soli 3,80 dB prove CS-alone con intervalli tra le prove simili a 20 prove somministrate per la formazione di estinzione come descritto al punto 6.2. </li><li> Al termine della sessione di richiamo, rispedire gli animali loro gabbie a casa. </li></ol> Analisi 8. Dati <ol><li> Acquisire dati comportamentali attraverso il video e analizzarli utilizzando il software del computer. NOTA: Congelamento punteggi possono anche essere contati manualmente uno sperimentatore che è cieco al trattamento farmacologico cronometrando attacchi congelamento durante la presentazione CS di ogni prova, espresso come percentuale del tempo speso congelamento durante il tono. Congelamento èdefinita dalla completa mancanza di movimento con l&#39;eccezione di respirazione durante le prove 30 sec CS-USA. Calcolare cento congelamento dividendo i secondi trascorsi congelamento (immobile) per 30 secondi (durata della prova) moltiplicato per 100. </li></ol>

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Gli autori di questo manoscritto non hanno interessi finanziari in competizione o altri conflitti di interesse da dichiarare.

La paura di estinzione è stata ampiamente studiata in ratti maschi con i meccanismi neurali che mediano condizionato estinzione paura individuati e valutati in diverse manipolazioni. Relativamente pochi studi hanno esaminato topi di sesso femminile o il ruolo degli ormoni gonadici nella paura di estinzione. Per studiare specificamente gli effetti degli estrogeni sulla paura estinzione, naturalmente ciclismo ratti femmine sono sottoposti ad un paradigma comportamentale di tre giorni. Questa procedura si compone di fasi ...

Differenze di sesso inerenti si osservano in vari comportamenti cognitivi e paradigmi di apprendimento in entrambi gli esseri umani e roditori. Ad esempio, è stato riportato che le donne hanno generalmente abilità verbali e orientato al dettaglio più forti, mentre gli uomini hanno migliori abilità spaziali 1-3. Queste differenze di sesso può essere dovuto in parte l&#39;influenza degli ormoni gonadici. Alti livelli di estradiolo migliorare le prestazioni in compiti in cui le donne sono migliori, ma peggiorano le prestazioni in compiti che gli uomini in genere fanno bene 4-6. Anche se questa prova è convincente, la limitata capacità di controllare completamente gli ambienti sperimentali in studi sull&#39;uomo rende difficile determinare se questi effetti sul comportamento possono essere attribuiti specificamente agli ormoni. Gli studi su animali, al contrario, permettono di circostanze completamente controllate. Anche se i meccanismi neurali di base della paura dell&#39;estinzione sono stati identificati e sono ben studiata nei maschi, non è chiaro sequesti sistemi sono gli stessi nelle femmine o come cambiano in tutto il ciclo estrale. La paura condizionata ed estinzione sono ampiamente utilizzati paradigmi comportamentali nei roditori e nell&#39;uomo per condurre studi in materia di disturbi d&#39;ansia. Dato che le donne hanno un rischio più elevato per i disturbi d&#39;ansia e maggiore durata dei sintomi e la gravità 7-13, è fondamentale per comprendere le femmine in questi studi. La sottorappresentazione delle donne in questa ricerca può essere attribuita alle sfide del monitoraggio fase estrale e contabile per gli effetti comportamentali degli ormoni sessuali. I laboratori che fanno esaminare le femmine a questo proposito le questioni di incontro che spesso vanno non dichiarata o non sono descritte nei metodi per i loro studi. Emergenti prove in roditori suggeriscono che le differenze di sesso nella paura di estinzione sono modulati dagli ormoni gonadici 14-18. In condizionamento alla paura, gli animali vengono addestrati a temere uno stimolo particolare. Dopo una serie di presentazioni di non rinforzatilo stimolo, gli animali imparano a non temere la stecca, un processo chiamato di estinzione. Quanto bene apprende l&#39;animale e consolida il ricordo di imparare questa attività si può osservare nel corso di un test di richiamo di estinzione dato qualche tempo dopo la formazione di estinzione. Espressione paura Meno durante il richiamo estinzione dimostra buon consolidamento della memoria estinzione. Recenti scoperte dal nostro laboratorio indicano che gli estrogeni possono modulare il consolidamento della memoria paura dell&#39;estinzione e migliorare richiamo estinzione. In particolare, i topi femmina che si estinguono proestrus, la fase del ciclo estrale durante il quale livelli circolanti di estrogeni picco, mostra una maggiore ritenzione della memoria estinzione. Al contrario, le donne che sono estinte nel basso-estrogeno visualizzazione della fase metestrus relativamente scarsa memoria di estinzione, che possono essere migliorati con la somministrazione di estradiolo esogeno prima o immediatamente dopo l&#39;estinzione allenamento 15,16. I meccanismi neurali di consolidamento della memoria di estinzione (inclUding il ruolo degli ormoni gonadici) nelle donne non sono chiare. Negli animali da laboratorio, il ruolo degli ormoni può essere indagato utilizzando invasive procedure di rimozione chirurgiche come la castrazione e ovariectomia. Dopo il recupero da un intervento chirurgico, ormoni gonadici sono spesso esogena manipolati durante l&#39;esecuzione di un compito comportamentale 19. Questo approccio ha fornito informazioni critiche su ormoni sessuali ed è utile perché permette di manipolazioni ben controllati di ormoni gonadici (in termini di tempi e di dose) 20-23. Questo approccio, tuttavia, non valutare l&#39;influenza delle fluttuazioni naturali che si verificano nel corso del ciclo estrale non rappresentano animali &quot;normali&quot;, limitando così il potenziale traslazionale per studi sull&#39;uomo. E &#39;stato ben documentato che i livelli di ormone sessuale femminile picco e il declino a specifiche fasi del ciclo estrale, e cambiamenti di espressione dei recettori degli estrogeni all&#39;interno del ciclo,e dopo ovariectomia 24. Quindi, vi è la necessità di condurre studi su femmine con gonadi intatti e perfezionare progetti sperimentali per studiare in modo affidabile gli effetti che gli stati alti e bassi di estrogeni possono avere su donne in tutta la loro durata di vita. Questo protocollo concentra sull&#39;effetto degli estrogeni sui sistemi neurobiologici coinvolti nella paura estinzione. Si descrive come: 1) monitorare attentamente il ciclo estrale, 2) preparare le dosi efficaci di estradiolo per somministrazione sistemica, e 3) seguire un paradigma comportamentale che include condizionamento alla paura, l&#39;estinzione, e richiamare in modo naturale in bicicletta ratti femmina. Questo protocollo può essere modificato con altre manipolazioni farmacologiche e strumenti molecolari e cellulari per aiutare gli studi per capire meglio le differenze di sesso che si osservano in condizionato temere comportamento estinzione. Si noti che le procedure descritte qui sotto sono quelli utilizzati nel nostro laboratorio, ed esistono un certo numero di varianti di queste procedure in letteratura.

<table><tbody><tr><td>Fear conditioning chamber</td><td>Coulbourn Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphic State</td><td>Coulbourn Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sound-attenuating box</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>NIR-022MD</td><td></td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1024</td><td>In sesame oil for subcutaneous injection</td></tr><tr><td>Sesame oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3547-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Freezescan</td><td>Cleversys, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dip quick stain</td><td>Jorgensen Laboratories, Inc.</td><td>J0322A1, J0322A2, J0322A3</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-tipped applicators</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-114</td><td>6-inch, sterile</td></tr><tr><td>0.9% saline</td><td>LabChem, Inc.</td><td>LC23460-2</td><td>Sodium chloride w/v</td></tr><tr><td>Selectfrost microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-003</td><td></td></tr><tr><td>Virex II 256</td><td>Diversey, Inc.</td><td>5019317</td><td>Dilute 1:256 with water</td></tr><tr><td>Luer-Lok Tip 1ml Syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic disposable needles</td><td>Exelint International, Co.</td><td>26402</td><td>26-gauge</td></tr></tbody></table>

protocol for studying extinction of conditioned fear in naturally cycling female rats

Estinzione della paura condizionata è stata ampiamente studiata nei roditori maschi. Recentemente, ci sono stati un numero crescente di studi che indicano che i meccanismi neurali per determinati compiti comportamentali e comportamenti di risposta sono diversi in femmine e maschi. Utilizzando femmine in studi di ricerca può rappresentare una sfida a causa della variazione di ormoni gonadici durante il loro ciclo estrale. Questo protocollo descrive le procedure consolidate che sono utili nelle indagini il ruolo degli estrogeni nella paura consolidamento della memoria estinzione nei ratti femmina. Fase del ciclo estrale e somministrazione di estrogeni esogeni prima formazione all&#39;estinzione può influenzare richiamo estinzione 24 ore più tardi. La tecnica swabbing vaginale per l&#39;identificazione fase estrale descritto favorisce l&#39;esame e la manipolazione di ciclismo naturalmente ormoni gonadici. L&#39;utilizzo di questo modello di roditore di base può ulteriormente delineare i meccanismi attraverso i quali gli estrogeni possono modulare paura memoria estinzionefemmine.

In questo protocollo richiamo paura dell&#39;estinzione, per cento di congelamento è stata misurata come indicatore della paura. Gli animali che estinte bene e conservate la memoria della formazione dell&#39;estinzione esposte basso paura l&#39;ultimo giorno di test comportamentali durante il richiamo di estinzione. Ratti maschi e femmine non presentano differenze significative nell&#39;espressione paura condizionata durante il condizionamento, l&#39;estinzione, e ricordano le fasi (Figura 2). Tuttavia...

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Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Protocollo per lo studio Extinction of Fear Condizionata in Naturalmente bicicletta ratti di sesso femminile

Extinction of conditioned fear has been extensively studied in male rodents. Recently, there have been an increasing number of studies indicating that ...

protocol-for-studying-extinction-conditioned-fear-naturally-cycling

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Behavior

13.3K Views.  Massachusetts General Hospital. Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

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Trace Fear Conditioning in Mice

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings between a neutral stimulus and an unconditioned stimulus. There is a 20 sec trace period that separates each conditioning trial. On the following day freezing is measured during presentation of the conditioned stimulus (CS) and trace period. On the third day there is an 8 min test to measure contextual memory. The representative results are from mice that were presented with the aversive unconditioned stimulus (shock) compared to mice that received the tone presentations without the unconditioned stimulus. Trace fear conditioning has been successfully used to detect subtle learning and memory deficits and enhancements in mice that are not found with other fear conditioning methods. This type of fear conditioning is believed to be dependent upon connections between the medial prefrontal cortex and the hippocampus. One current controversy is whether this method is believed to be amygdala-independent. Therefore, other fear conditioning testing is needed to examine amygdala-dependent learning and memory effects, such as through the delay fear conditioning.

In the following experiment we describe a protocol for trace fear conditioning in mice. This type of associative memory includes a trace period that separates the neutral stimulus and the unconditioned stimulus.

Trace paura condizionata in topi

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings ...

Ricerca

Comportamento

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats 

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse. Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the neurobiology and phenomenology of relapse to drug use. Although procedural variations have emerged over the past several decades, the most conventional reinstatement procedures are based on the drug self-administration (SA) model. In this model, an animal is trained to perform an operant response to obtain drug. Subsequently, the behavior is extinguished by withholding response-contingent reinforcement. Reinstatement of drug seeking is then triggered by a discrete event, such as an injection of the training drug, re-exposure to drug-associated cues, or exposure to a stressor 1.
Reinstatement procedures were originally developed to study the ability of acute non-contingent exposure to the training drug to reinstate drug seeking in rats and monkeys 1, 2. Reinstatement procedures have since been modified to study the role of environmental stimuli, including drug-associated cues and exposure to various forms of stress, in relapse to drug seeking 1, 3, 4.
Over the past 15 years, a major focus of the reinstatement literature has been on the role of stress in drug relapse. One of the most commonly used forms of stress for studying this relationship is acute exposures to mild, intermittent, electric footshocks. The ability of footshock stress to induce reinstatement of drug seeking was originally demonstrated by Shaham and colleagues (1995) in rats with a history of intravenous heroin SA5. Subsequently, the effect was generalized to rats with histories of intravenous cocaine, methamphetamine, and nicotine SA, as well as oral ethanol SA 3, 6.
Although footshock-induced reinstatement of drug seeking can be achieved reliably and robustly, it is an effect that tends to be sensitive to certain parametrical variables. These include the arrangement of extinction and reinstatement test sessions, the intensity and duration of footshock stress, and the presence of drug-associated cues during extinction and testing for reinstatement. Here we present a protocol for footshock-induced reinstatement of cocaine seeking that we have used with consistent success to study the relationship between stress and cocaine seeking.

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the role of stress in relapse to drug seeking. Here, we report on a method for inducing the reinstatement of cocaine seeking in laboratory rats via acute exposures to mild, intermittent electric footshock.

Una procedura per lo studio della Footshock indotta Ripristino di cocaina Cerco nei ratti di laboratorio

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Neuroscienze

Quantifying Cognitive Decrements Caused by Cranial Radiotherapy

With the exception of survival, cognitive impairment stemming from the clinical management of cancer is a major factor dictating therapeutic outcome. For many patients afflicted with CNS and non-CNS malignancies, radiotherapy and chemotherapy offer the best options for disease control. These treatments however come at a cost, and nearly all cancer survivors (~11 million in the US alone as of 2006) incur some risk for developing cognitive dysfunction, with the most severe cases found in patients subjected to cranial radiotherapy (~200,000/yr) for the control of primary and metastatic brain tumors1. Particularly problematic are pediatric cases, whose long-term survival plagued with marked cognitive decrements results in significant socioeconomic burdens2. To date, there are still no satisfactory solutions to this significant clinical problem.
We have addressed this serious health concern using transplanted stem cells to combat radiation-induced cognitive decline in athymic rats subjected to cranial irradiation3. Details of the stereotaxic irradiation and the in vitro culturing and transplantation of human neural stem cells (hNSCs) can be found in our companion paper (Acharya et al., JoVE reference). Following irradiation and transplantation surgery, rats are then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. To critically evaluate the success or failure of any potential intervention designed to ameliorate radiation-induced cognitive sequelae, a rigorous series of quantitative cognitive tasks must be performed. To accomplish this, we subject our animals to a suite of cognitive testing paradigms including novel place recognition, water maze, elevated plus maze and fear conditioning, in order to quantify hippocampal and non-hippocampal learning and memory. We have demonstrated the utility of these tests for quantifying specific types of cognitive decrements in irradiated animals, and used them to show that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function3.
The cognitive benefits derived from engrafted human stem cells suggest that similar strategies may one day provide much needed clinical recourse to cancer survivors suffering from impaired cognition. Accordingly, we have provided written and visual documentation of the critical steps used in our cognitive testing paradigms to facilitate the translation of our promising results into the clinic.

Cognitive impairment resulting from the radiotherapeutic management of brain tumors represents a clinically intractable condition that adversely impacts quality of life. The capability to critically evaluate potential interventions for ameliorating radiation-induced cognitive decrements ultimately depends on the capability to undertake rigorous quantitative assessments of cognition.

Quantificare Decrementa cognitivi causati da radioterapia craniale

With the exception of survival, cognitive impairment stemming from the clinical management of cancer is a major factor dictating therapeutic outcome. For ...

Medicina

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

Stimolazione del nervo vago come strumento per indurre plasticità Percorsi rilevanti per l&#39;apprendimento Extinction

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Formazione estinzione durante la finestra di riconsolidamento impedisce il recupero della paura

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Stress-Enhanced Fear Learning, a Robust Rodent Model of Post-Traumatic Stress Disorder

Fear behaviors are important for survival, but disproportionately high levels of fear can increase the vulnerability for developing psychiatric disorders such as post-traumatic stress disorder (PTSD). To understand the biological mechanisms of fear dysregulation in PTSD, it is important to start with a valid animal model of the disorder. This protocol describes the methodology required to conduct stress-enhanced fear learning (SEFL) experiments, a preclinical model of PTSD, in both rats and mice. SEFL was developed to recapitulate critical aspects of PTSD, including long-term sensitization of fear learning caused by an acute stressor. SEFL uses aspects of Pavlovian fear conditioning but produces a distinct and robust sensitized fear response far greater than normal conditional fear responses. The trauma procedure involves placing a rodent in a conditioning chamber and administering 15 unsignaled shocks randomly distributed over 90 minutes (for rat experiments; for mouse experiments, 10 unsignaled shocks randomly distributed over 60 minutes are used). On day 2, rodents are placed in a novel conditioning context where they receive a single shock; then, on day 3 they are placed back in the same context as on day 2 and tested for changes in freezing levels. Rodents that previously received the trauma display enhanced levels of freezing on the test day compared to those that received no shocks on the first day. Thus, with this model, a single highly stressful experience (the trauma) produces extreme fear of the stimuli associated with the traumatic event.

Here we describe the detailed methodology required to conduct stress-enhanced fear learning (SEFL) experiments, a preclinical model of post-traumatic stress disorder, in both rats and mice. The model utilizes aspects of Pavlovian fear conditioning and freezing as an index of enhanced fear in rodents.

Paura lo stress-Enhanced Learning, un robusto modello del roditore del disturbo da Stress post-traumatico

Fear behaviors are important for survival, but disproportionately high levels of fear can increase the vulnerability for developing psychiatric disorders ...

Fear Incubation Using an Extended Fear-Conditioning Protocol for Rats

Emotional memory has been primarily studied with fear-conditioning paradigms. Fear conditioning is a form of learning through which individuals learn the relationships between aversive events and otherwise neutral stimuli. The most-widely utilized procedures for studying emotional memories entail fear conditioning in rats. In these tasks, the unconditioned stimulus (US) is a footshock presented once or several times across single or several sessions, and the conditioned response (CR) is freezing. In a version of these procedures, called cued fear conditioning, a tone (conditioned stimulus, CS) is paired with footshocks (US) during the training phase. During the first test, animals are exposed to the same context in which training took place, and freezing responses are tested in the absence of footshocks and tones (i.e., a context test). During the second test, freezing is measured when the context is changed (e.g., by manipulating the smell and walls of the experimental chamber) and the tone is presented in the absence of footshocks (i.e., a cue test). Most cued fear conditioning procedures entail few tone-shock pairings (e.g., 1-3 trials in a single session). There is a growing interest in less common versions involving an extensive number of pairings (i.e., overtraining) related to the long-lasting effect called fear incubation (i.e., fear responses increase over time without further exposure to aversive events or conditioned stimuli). Extended fear-conditioning tasks have been key to the understanding of fear incubation&#8217;s behavioral and neurobiological aspects, including its relationship with other psychological phenomena (e.g., post-traumatic stress disorder). Here, we describe an extended fear-conditioning protocol that produces overtraining and fear incubation in rats. This protocol entails a single training session with 25 tone-shock pairings (i.e., overtraining) and a comparison of conditioned freezing responses during context and cue tests 48 h (short-term) and 6 weeks (long-term) after training.

We describe an extended fear-conditioning protocol that produces overtraining and fear incubation in rats. This protocol entails a single training session with 25 tone-shock pairings (i.e., overtraining) and a comparison of conditioned freezing responses during context and cue tests 48 h (short-term) and 6 weeks (long-term) after training.

L'incubazione della paura utilizzando un protocollo esteso di condizionamento della paura per i ratti

Emotional memory has been primarily studied with fear-conditioning paradigms. Fear conditioning is a form of learning through which individuals learn the ...

A Novel Pavlovian Fear Conditioning Paradigm to Study Freezing and Flight Behavior

Fear- and anxiety-related behaviors significantly contribute to an organism&#8217;s survival. However, exaggerated defensive responses to perceived threat are characteristic of various anxiety disorders, which are the most prevalent form of mental illness in the United States. Discovering the neurobiological mechanisms responsible for defensive behaviors will aid in the development of novel therapeutic interventions. Pavlovian fear conditioning is a widely used laboratory paradigm to study fear-related learning and memory. A major limitation of traditional Pavlovian fear conditioning paradigms is that freezing is the only defensive behavior monitored. We recently developed a modified Pavlovian fear conditioning paradigm that allows us to study both conditioned freezing and flight (also known as escape) behavior within individual subjects. This model employs higher intensity footshocks and a greater number of pairings between the conditioned stimulus and unconditioned stimulus. Additionally, this conditioned flight paradigm utilizes serial presentation of pure tone and white noise auditory stimuli as the conditioned stimulus. Following conditioning in this paradigm, mice exhibit freezing behavior in response to the tone stimulus, and flight responses during the white noise. This conditioning model can be applied to the study of rapid and flexible transitions between behavioral responses necessary for survival.

Defensive behavioral responses are contingent upon threat intensity, proximity, and context of exposure. Based on these factors, we developed a classical conditioning paradigm that elicits clear transitions between conditioned freezing and flight behavior within individual subjects. This model is crucial for the understanding the pathologies involved in anxiety, panic, and post-traumatic stress disorders.

Un nuovo paradigma pavloviano di condizionamento della paura per studiare il congelamento e il comportamento di volo

Fear- and anxiety-related behaviors significantly contribute to an organism&#8217;s survival. However, exaggerated defensive responses to perceived threat ...

An Inescapable Cat Odor Exposure Protocol for Studying Innate and Contextual Threat Conditioning in Rats

Animals respond to threatening situations by exhibiting a number of defensive behaviors, including avoidance, freezing, and risk assessment. An animal model with an ethological approach offers a deeper insight into the biological mechanisms underlying threat responses. This paper describes a methodology to measure defensive behaviors toward both innate and learned aversive stimuli in rats. Animals were individually exposed to predator odor in an inescapable chamber to elicit a measurable, sustained, defensive state. The experimental design involved placing a rat in a familiar chamber for 10 min followed by exposure to cat odor for another 10 min in the same context. The next day, the rats were re-exposed for 10 min to the same context chamber where cat odor exposure occurred. Sessions were video-recorded and defensive behaviors were assessed on both days. 
The behavioral test was coupled with reversible functional inactivation and c-Fos immunohistochemistry techniques to determine the role of the interoceptive cortex in threat responses. Rats exposed to cat odor on the first day and re-exposed to the context chamber on the second day displayed higher levels of defensive behaviors, and that cat odor elicited a robust increase in the neural activity of the interoceptive cortex. Moreover, muscimol inactivation of the interoceptive cortex reduced the expression of defensive behaviors in response to cat odor and impaired contextual threat memory. These results show that this behavioral assay is a useful tool for studying neural mechanisms of defensive behaviors and may offer insight into mechanisms that mediate fear in humans and its related disorders.

Cat skin/fur odor exposure provides a reliable method to investigate neural circuits and mechanisms of defensive responses in rodents and may offer insight into mechanisms that mediate fear in humans. Here, we describe a protocol for investigating the role of the interoceptive cortex in threat responses in rats.

Animals respond to threatening situations by exhibiting a number of defensive behaviors, including avoidance, freezing, and risk assessment. An animal ...

Studio dei comportamenti difensivi attivi nei topi con condizionamento della paura modificato

Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice

The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active defensive behavior, such as jumping or rapid darting, is expressed under high threat imminence or actual threat, whereas passive defensive behavior, such as freezing, is expressed when the threat is predicted, but the threat imminence is relatively low. In classical fear conditioning, subjects typically exhibit freezing as a conditioned defensive response, with little expression of active defensive behavior in most cases. Here, we introduce a modified fear conditioning procedure for mice to observe the transition from freezing to flight and vice versa, involving five repetitive pairings of conditioned stimuli (CS; continuous tone, 8 kHz, 95 dB SPL (sound pressure levels)) and unconditioned stimuli (US; foot shock, 0.9 mA, 1.0 s) over two days. This modified fear conditioning procedure requires a relatively large number of conditioning sessions and conditioning days but does not necessitate a high-intensity foot shock for modest expression of flight behavior. Using the same context for conditioning and salient CS presentations is essential to elicit flight behaviors. This modified fear conditioning procedure is a reliable method for observing active defensive behaviors in mice, providing an opportunity to elucidate the fine mechanisms and characteristics of such behaviors in a fearful context.

Autore in primo piano: Esplorazione dei correlati neurali dei comportamenti difensivi nell'apprendimento e nell'estinzione della paura

To study flight behaviors in a fearful context, we introduce a modified fear conditioning protocol. This protocol ensures that mice consistently exhibit flight behaviors during cue presentation in the fear conditioning.

Condizionamento della paura modificato per indurre comportamenti di volo nei topi

The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active ...