Name: a guide to in vivo single-unit recording from optogenetically identified cortical inhibitory interneurons
Uploaded: 2014-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons at JoVE.com

This work was funded by the Whitehall Foundation and the NIH. We thank Clifford Dax (University of Oregon Technical Support Administration) for his help and expertise in designing a circuit for light delivery.

NOTA: Il seguente protocollo è conforme con il National Institutes of linee guida per la salute, come approvato dalla University of Oregon Animal Care and Use Committee. 1. Chirurgia acuta <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale con un cocktail di ketamina-medetomidina, via intraperitoneale (ip) iniezione (Tabella 1). NOTA: I topi utilizzati in questi esperimenti sono generati attraversando un cre-dipendente ChR2-EYFP transgenico line10 di interneuroni linee conducente (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Consegna virale di ChR2 o opsine correlati dovrebbe funzionare altrettanto bene, assumendo livelli di espressione simili si ottengono. </li><li> Prima di iniziare l&#39;intervento, in modo che le esibizioni di animali non risposta ad un pizzico punta dolce. Ri-somministrare anestetici durante l&#39;esperimento come necessario per mantenere questa profondità dell&#39;anestesia. Se si utilizza anestetici iniettabili, eventualmente impiantare un catetere ip per preparazioni iniettabili di manutenzione. </li><li> Mantenere l&#39;animale idratato con soluzione salina o di Ringer lattato durante l&#39;esperimento (circa 3 ml / kg / ora), per esempio usando un cocktail anestetico opportunamente diluito per preparazioni iniettabili manutenzione (Tabella 1). </li><li> Posto l&#39;animale in un apparato porta-teste stereotassico o altro. Assicurarsi che il cranio è ben protetto,. Ciò è essenziale per mantenere registrazioni monocellulari stabili. </li><li> Applicare una pomata opthalamic agli occhi per prevenire la secchezza. Mantenere la temperatura corporea a 36,5-37 ° C. </li><li> Eseguire uno scarico della cisterna per la stabilità ulteriore registrazione. Usando un bisturi, rimuovere il tessuto dalla faccia posteriore del cranio per esporre la cisterna magna. Fare un piccolo nick nella dura per drenare il liquido cerebrospinale. Utilizzare solo la punta della lama, ed evitare qualsiasi contatto il gambo cervelletto o del cervello. </li><li> Utilizzando il bisturi, eseguire una piccola craniotomia (~ 2 mm 2) sopra la zona corticale di interesse (per l&#39;acusticacorteccia, circa -2.3 mm posteriormente di bregma, 4,5 millimetri laterale della linea mediana). </li><li> Rimuovere la dura e coprire la corteccia esposta con uno strato di agarosio calda 0,5 - spessore di 1 mm (1,5% agarosio in soluzione salina, 0,9% di NaCl; applicare a ~ 37 ° C). Mantenere l&#39;umido agarosio tutto l&#39;esperimento applicando periodicamente alcune gocce di soluzione salina. </li></ol> 2. Registrazione Set-up <ol><li> Preparare un elettrodo di tungsteno (7-14 MW, 127 micron di diametro, 12 ° punta affusolata, rivestimento epossidico). Superglue l&#39;elettrodo di un tubo capillare di vetro e aggiungere termorestringente per una presa (figura 1). </li><li> Montare l&#39;elettrodo su un micromanipolatore motorizzato (o idraulico), impostare viaggiare ortogonale alla superficie corticale. Far scorrere un filo di terra sotto la pelle, contro il cranio. Evitare il contatto con i muscoli sul lato della testa e la parte posteriore del collo, in quanto possono generare artefatti elettromiografici. </li><li> Amplificazione del segnale elettrico utilizzando un amplificatore extracellulareli fi catore adatto per la registrazione singola unità, preferibilmente dotata di una modalità di controllo dell&#39;impedenza. Monitorare l&#39;attività chiodare in corso (banda passante di 300 - 5.000 Hz) con due oscilloscopi e un set di altoparlanti amplificati. Qui, i dati registrati vengono digitalizzate continuo ad una frequenza di campionamento di 10 kHz; picchi vengono estratti in linea. </li><li> Avanzare l&#39;elettrodo attraverso l&#39;agarosio finché la punta raggiunge la superficie della corteccia. Osservare questo passaggio attraverso un microscopio. &quot;Zero&quot; questa posizione sul micromanipolatore. </li><li> Per meglio approssimare la profondità della registrazione, confermare visivamente che la punta dell&#39;elettrodo esce dalla superficie corticale ad una profondità di zero quando ritirare l&#39;elettrodo al termine di una penetrazione. NOTA: Una discrepanza tra la lettura manipolatore e la posizione dell&#39;elettrodo osservato indica che è spostata rispetto al tessuto. Questo può essere causato da instabilità del cervello o animale, o manipolatore deriva. <ol><li> Come un ulteriore controllo per garantire chequesto set-punto zero corrisponde alla superficie della corteccia, monitorare potenziali di campo evocati stimolo mentre avanza attraverso le prime diverse centinaia di micrometri di tessuto. Durante il monitoraggio potenziali di campo, abbassare il più basso filtro passa-banda di taglio dell&#39;amplificatore extracellulare a 10 Hz. Verificare che la polarità del potenziale campo locale inverte intorno una profondità di circa 100 micron, in prossimità dello strato di confine I / II 13. Questo è un punto di riferimento affidabile per la corteccia uditiva, ma può essere diverso per le altre aree corticali. </li></ol></li><li> Montare una fibra ottica accoppiata ad una sorgente di luce blu (figura 2) su un micromanipolatore manuale. Utilizzando il microscopio, posizionare la punta della fibra più vicino alla superficie del agarosio possibile. Centrare il fascio in cui l&#39;elettrodo si entra il tessuto. </li><li> Regolare l&#39;uscita della sorgente di luce con una unità di controllo in grado di erogare un TTL (transistor-transistor logic) treno di impulsi di larghezza e duratio specificaton- esempio, un Arduino (figura 3), una scheda PC I / O (come mostrato), o un generatore di impulsi disponibile in commercio. <ol><li> Monitorare il segnale su entrambi oscilloscopi. </li></ol></li><li> Misurare potenza luminosa totale (mW) sulla punta della fibra ottica utilizzando un misuratore di potenza. Utilizzare questo valore per calcolare irradianza (mW / mm 2) dividendo per l&#39;area della sezione trasversale del nucleo della fibra. Iniziare con un valore di intensità nell&#39;intervallo 10 - 15 mW / mm 2 e regolare verso il basso se necessario, fino artefatti sono eliminati. </li><li> Verificare la presenza di manufatti leggeri con l&#39;elettrodo nella agarosio, pronta a entrare nel tessuto. Avviare la ricerca treno di impulsi (ad esempio, 30 impulsi di luce msec, 500 msec intervallo interstimulus (ISI)). <ol><li> Eliminare manufatti leggeri transitori (Figura 4) per riposizionare la fibra ottica rispetto all&#39;elettrodo per cambiare l&#39;angolo della luce incidente. Se artefatti persistono, provare a diminuire la potenza luminosa. In the caso raro che gli artefatti non possono essere completamente eliminati (solo ridotto al minimo), estendere la durata dell&#39;impulso di ricerca. Questo può aiutare a identificare i veri picchi neuronali. </li></ol></li></ol> 3. Dritto PINP-in &#39; <ol><li> Avanzare l&#39;elettrodo lentamente attraverso il cervello ad una velocità di circa 1 micron / sec. Utilizzare un oscilloscopio per monitorare l&#39;attività in corso. Dall&#39;altro, scatenare gli impulsi laser. </li><li> Attendere il &#39;hash&#39; deboli di picchi luce evocata sul monitor audio, che indica che l&#39;elettrodo si avvicina una cella ChR2 + e spesso può essere percepito ben prima del segnale elettrico risulta sull&#39;oscilloscopio. Rallentare la velocità di avanzamento. NOTA: Se la cella si trova direttamente nel percorso dell&#39;elettrodo, l&#39;attività di luce evocata crescerà più grande (e più forte). Come l&#39;elettrodo si avvicina un singolo interneuroni, l&#39;hash risolverà in piccoli ma ben definiti picchi di forma e dimensione uniformi. </li><li> Appena lipicchi GHT-evocato sono grandi abbastanza per innescare della singolarmente sull&#39;oscilloscopio, cominciano a farlo. Regolare la scala sull&#39;asse orizzontale per osservare la forma esatta della forma d&#39;onda di picco. </li><li> Fermarsi e attendere per il tessuto di stabilirsi. Resistete alla tentazione di spostare l&#39;elettrodo più vicino alla cella. Questo passaggio è fondamentale per una registrazione stabile. Se dopo alcuni minuti il ​​rapporto segnale-rumore non è migliorata - cioè, il tessuto è costante, ma non ha portato la cella più vicino alla punta dell&#39;elettrodo - avanzamento 5 micron ulteriormente e attendere. <ol><li> Ripetere questo processo fino a quando la punta o la depressione del potenziale d&#39;azione possono essere catturati in modo affidabile con una soglia di tensione impostata ben al di sopra del rumore di fondo (ad esempio, +/- 300 mV o superiore). NOTA: C&#39;è poco rischio di falsi positivi o ambiguità quando PINPing interneuroni inibitori. La maggior parte delle cellule in grado di seguire facilmente un treno di impulsi di durata di 30 msec e inter-pulIntervallo SE 500 msec, o più veloce, con una certa latenza primo picco di 2-5 msec (Figura 5). La maggior parte delle cellule fotovoltaiche +, in particolare, può sostenere cottura per un totale di 1 sec (Figura 6). Perché questi sono neuroni inibitori, disynaptic attivazione (indiretto) non è una preoccupazione importante. </li></ol></li><li> Durante la registrazione, monitorare l&#39;attività in corso sul primo oscilloscopio. Tieni d&#39;occhio le dimensioni e la forma del picchi utilizzando il secondo oscilloscopio. Si noti la qualità del loro suono sull&#39;altoparlante. <ol><li> Ascoltate con attenzione per i cambiamenti improvvisi, che indicano che la cella è sia volge troppo vicino all&#39;elettrodo (dove rischia di essere impalato o danneggiato), o è alla deriva. Se le punte si allargano e distorta, tornare indietro; se crescono più piccolo, far avanzare l&#39;elettrodo. Si muovono lentamente in 2 micron passi. </li><li> Verificare la qualità della registrazione post-hoc sovrapponendo tutte le forme d&#39;onda di picco, allineati a picco o depressione. Variare le THRES tensionetenere. Attraverso una vasta gamma di valori di soglia, ci dovrebbe essere solo una forma coerente picco di altezza uniforme (figura 5a). </li></ol></li><li> Se in qualsiasi momento il segnale venga contaminato con punte da un neurone vicino, andare avanti. Avanza lentamente, sulla remota possibilità che l&#39;elettrodo passerà fuori dalla portata della cella vicina, ma rimanere nel raggio d&#39;azione del neurone bersaglio. (Questo è di solito senza successo.) </li><li> Spostare l&#39;elettrodo attraverso l&#39;intera profondità della corteccia (900 + micron) in ogni penetrazione. Se non ci sono i neuroni di luce-sensibili si incontrano dopo molti penetrazioni o, al contrario, le registrazioni sono regolarmente contaminati con punte di cellule ChR2- vicini, provare un nuovo elettrodo. NOTA: Anche all&#39;interno di una stessa partita, la geometria impedenza e punta di singoli elettrodi può variare considerevolmente. Entrambi i fattori contribuiscono alla effettiva &quot;ascolto raggio&quot; dell&#39;elettrodo, che deve essere sufficientemente grande per rilevare i picchi di luce evocati whricerca ile, ma limitato sufficiente per permettere la registrazione di un singolo interneuroni in isolamento. </li><li> Testare l&#39;impedenza degli elettrodi lo desideri. Per evitare di danneggiare il tessuto, farlo con la punta dell&#39;elettrodo nella parte superiore dello strato di agarosio, ben al di fuori del cervello. All&#39;interno della gamma di 7-14 MW, l&#39;impedenza esatta non è un sicuro indicatore delle prestazioni, o cedere, per questa applicazione. Detto questo, si tratta di un proxy ragionevole per l&#39;ascolto radio: elettrodi più bassa impedenza raccogliere più unità; elevata impedenza, meno. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, eutanasia dell&#39;animale mediante istituzionalmente approvati, quali overdose di anestetico, o dislocazione cervicale sotto un profondo piano di anestesia. </li></ol>

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The authors have no competing financial interests.

Anche se PINP è concettualmente semplice, può essere difficile in pratica. Un fattore determinante del successo è la scelta dell&#39;elettrodo. Il raggio di ascolto elettrica è il parametro critico. Deve essere sufficientemente grande per rilevare i picchi di luce evocata quando la punta è ancora lontano da una cella ChR2 +, in modo che si può regolare la velocità di avanzamento di conseguenza. Allo stesso tempo, deve essere limitato sufficiente a consentire un buon isolamento singola unità. Cioè, l&#39;elettrodo non deve anche prendere picchi dalla vicina unità ChR2-. Trovare il giusto equilibrio in termini di ascolto raggio sarà una sfida per qualsiasi tipo di cellula bersaglio, ma è particolarmente vero per interneuroni inibitori, che sono sparse, piccole, e spesso si trovano in prossimità di piramidale cellule, che che hanno relativamente grande extracellulare picchi. Anche usando le strategie espresse, il rendimento atteso non è elevato. Il nostro rendimento tipico è 0-2 PV + neuroni / animale, data la nostra criteria di eccellente isolamento singola unità e le registrazioni della durata di oltre mezz&#39;ora. Quando PINPing neuroni inibitori, disynaptic attivazione (indiretto) non è una preoccupazione importante, perché i neuroni inibitori sono relativamente improbabili per attivare indirettamente cellule post-sinaptiche. Per PINPing i neuroni eccitatori, l&#39;attivazione disynaptic è comune; molti neuroni che si attivano in risposta alla luce non esprimono ChR2, ma ricevono potente eccitazione sinaptica da quelli che lo fanno. Strategie per directly- discriminante dai neuroni indirettamente attivati ​​sono discusse in dettaglio a Lima et al. 1. Considerazioni elettrodi Abbiamo sistematicamente esplorato una varietà di elettrodi e tecniche di registrazione: pipette patch di vetro con punte di diverse dimensioni, microelettrodi di tungsteno di varia impedenza e geometria della punta, e array multicanale (ad esempio, tetrodi). Angolari, ad alta impedenza microelettrodi di tungsteno(Come suggerito qui) ha dato, di gran lunga, il miglior rendimento. Una discussione dei problemi incontrati con ciascuna di queste tecniche segue. Usando gli array tetrodo a bassa impedenza e le sonde multi-canale, abbiamo regolarmente rilevato picchi di luce evocati; Tuttavia, essi sono raramente abbastanza grandi per ordinare affidabile. In altre parole, il rapporto segnale-rumore (SNR) era insoddisfacente. Abbiamo fatto tanto in tanto ottenere eccellenti registrazioni con tetrodi, ma la resa asintotico era più alta con i microelettrodi singoli tungsteno, e la qualità delle registrazioni era molto meglio. Punte tetrodo sono relativamente smussato pure, che limita il numero totale di penetrazioni possibili per animale. I problemi che abbiamo incontrato con sonde multi-canale sono stati probabilmente esacerbati dall&#39;uso di ampia illuminazione di superficie. A differenza di mira, la stimolazione a bassa potenza da una fibra impiantato, l&#39;illuminazione di superficie causerà cottura sincrono in ChR2 + neuroni al di là del sito di registrazione, che porta a forme d&#39;onda picco sovrappostiche sono più difficili da risolvere. Elettrodi di patch di vetro, come quelli utilizzati per le registrazioni standard di cellulari-attached sciolti, sono stati, inoltre, non particolarmente adatti al compito, ma per ragioni diverse. Una resistenza bassa (&lt;5 MW) elettrodi di patch sono fortemente orientate verso le cellule piramidali, che rende difficile per indirizzare interneuroni inibitori. Anche se questo può essere corretto in una certa misura, utilizzando una maggiore resistenza (punta più piccolo) elettrodi, il problema più grande con elettrodi di patch è il loro raggio di ascolto estremamente limitato. Anche se le registrazioni di patch di cellule-attached forniscono un elevato SNR, le cellule luce-sensibili non possono essere rilevati al di fuori della modalità cellulare iscritti. La strategia con elettrodi di patch è, inevitabilmente, per ottenere in modo casuale e sequenziale registrazioni cellulari-attached, pochissimi dei quali sono ChR2-esprimono interneuroni inibitori. Con l&#39;alta impedenza elettrodi di tungsteno si puòsia di rilevare picchi di luce evocata da lontano, e raggiungere un buon isolamento singola unità. La geometria della punta è probabilmente il fattore più importante. Abbiamo provato elettrodi di tungsteno da due produttori, con impedenze che vanno 2-14 MW, e gli angoli punta 5-12 °. Abbiamo trovato che 12 ° angoli di punta erano superiori, ma che l&#39;impedenza precisa era meno importante, nell&#39;intervallo di 7 - 14 MW. Abbiamo scoperto che gli elettrodi di vetro rivestite erano più suscettibili di manufatti leggeri rispetto agli elettrodi con rivestimento epossidico, quindi si consiglia di quest&#39;ultimo. Non abbiamo tentato di fare le nostre elettrodi di tungsteno personalizzato. Come con qualsiasi tipo di elettrodo, modi comuni di errore sono a perdere l&#39;isolamento o ferire un neurone. Diversi parametri di ribaltamento non sembrano avere molta influenza su questo. Piuttosto, in attesa che il tessuto si depositino è il fattore più importante nel mantenere registrazioni di alta qualità. Consegna Luce Poiché la luce è utilizzato solosa dire di identificare cellule ChR2-positivi - piuttosto che regolare la loro produzione in modo specifico - nella gamma di intensità utilizzabili per questo esperimento è ampia. Un limite inferiore è impostato dal fatto che l&#39;intensità deve essere sufficiente ad attivare le cellule ChR2-positivi alla profondità massima di cellule di interesse. Abbiamo scoperto che irradianze punta&gt; 5 mW / mm 2 (misurata a 470 nm) sono stati sufficienti per ottenere risposte robuste da PV + cellule in strato profondo 6. Irraggiamento a profondità specifiche all&#39;interno del cervello può essere stimata utilizzando una calcolatrice sulla base di misure dirette a mammiferi tessuto cerebrale (ad esempio, <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php</a> ), ma si consiglia vivamente di determinare il minimo per i propri esperimenti empiricamente, utilizzando un microelettrodo bassa impedenza (1 - 3 MW, per l&#39;attività dell&#39;unità multipla). Un limite superiore è impostato dal fatto che l&#39;alta intenle piazzole possono causare artefatti leggeri, che possono complicare il rilevamento di picchi evocati. Negli animali transgenici, di alta intensità può anche causare artefatti elettromiografici attivando ChR2 in PV esposto + muscoli sul collo e la testa. Nel costruire il nostro sistema di erogazione di luce, abbiamo trovato che un accoppiamento di un LED con una fibra ottica è in definitiva più conveniente di piazzare il LED direttamente sopra il cervello. Quest&#39;ultimo è un modo molto efficace per fornire la luce, ma ha alcuni inconvenienti pratici. La corrente che attraversa il dispositivo produce artefatti elettrici che devono essere protette, e il LED genera calore sostanziale che deve essere dissipata con una grande dissipatore. Inoltre, manufatti leggeri (sia fotovoltaici e elettromiografici) sono molto più difficili da controllare con l&#39;ampio schema di illuminazione dei LED. Accoppiamento fibra risolve tutti questi problemi.

Characterizing the myriad cell types that comprise the mammalian brain has been a central, but long-elusive goal of neurophysiology. For instance, the properties and function of different inhibitory cell types in the cerebral cortex are topics of great interest but are still relatively unknown. This is in part because conventional blind in vivo recording techniques are limited in their ability to distinguish between different cell types. Extracellular spike width can be used to separate putative parvalbumin-positive inhibitory neurons from excitatory pyramidal cells, but this method is subject to both type I and type II errors2,3. Alternatively, recorded neurons can be filled, recovered, and stained to later confirm their morphological and molecular identity, but this is a pain-staking and time-consuming process. Recently, genetically identified populations of inhibitory interneurons have become accessible by means of calcium imaging or visually guided patch recordings. In these approaches, viral or transgenic expression of a calcium reporter (such as GCaMP) or fluorescent protein (such as GFP) allows identification and characterization of cell types defined by promoter expression. These approaches use 2-photon microscopy, which requires expensive equipment, and are also limited to superficial cortical layers due to the light scattering properties of brain tissue. 
Recently, Lima and colleagues1 developed a novel application of optogenetics to target electrophysiological recordings to genetically identified neuronal types in vivo, termed &#8220;PINP&#8221; &#8211; or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. Unlike many other optogenetic applications, the goal is not to manipulate circuit function but simply to identify neurons belonging to a genetically-defined class, which can then be characterized during normal brain function. The technique can be implemented with standard extracellular recording equipment and can therefore serve as an accessible and inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching. Here we describe an approach to PINPing specific cell types in the anesthetized auditory cortex, with the expectation that the more general points can be usefully applied in other preparations and brain regions.
In cortex, PINP holds particular promise for investigating the in vivo response properties of inhibitory interneurons. GABAergic interneurons comprise a small, heterogeneous subset of cortical neurons4. Different subtypes, marked by the expression of particular molecular markers, have recently been shown to perform different computational roles in cortical circuits5-9. As genetic tools improve it may eventually be possible to distinguish morphologically- and physiologically-separable types that fall within these broad classes. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. This strategy was developed specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but we have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons. Although PINPing is conceptually straightforward, it can be surprisingly unyielding in practice. We learned a number of tips and tricks through trial-and-error that may be useful to others attempting the method.

<table><tbody><tr><td>ChR2-EYFP Line</td><td>Jackson Colonies</td><td>12569</td><td></td></tr><tr><td>Pvalb-iCre (PV) Line</td><td>Jackson Colonies</td><td>8069</td><td></td></tr><tr><td>Sst-iCre (SOM) Line</td><td>Jackson Colonies</td><td>13044</td><td></td></tr><tr><td>Cr-iCre (CR) Line</td><td>Jackson Colonies</td><td>10774</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td>Type III-A, High EEO</td></tr><tr><td>Micro Point (dural hook)</td><td>FST</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>FST</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>FST</td><td>10003-12 (handle), 10011-00 (blades)</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Ophthalmic Ointment</td><td>Foster &amp;amp; Smith</td><td>9N-76855</td><td></td></tr><tr><td>Homeothermic Blanket</td><td>Harvard Apparatus</td><td>&lt;a name=&quot;RANGE!C11&quot;&gt;507220F&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Microelectrodes</td><td>A-M Systems</td><td>577200</td><td>12 M&amp;Omega; AC resistance, 127 &amp;mu;m diameter, 12&amp;deg; tapered tip, epoxy-coated</td></tr><tr><td>Capillary Glass Tubing</td><td>Warner Instruments</td><td>G150TF-3</td><td></td></tr><tr><td>Heat Shrink Tubing</td><td>DigiKey</td><td>A332B-4-ND</td><td></td></tr><tr><td>Zapit Accelerator</td><td>DVA</td><td>SKU ZA/ZAA</td><td>Use with standard Super Glue.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microelectrode AC Amplifier 1800</td><td>AM Systems</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>MP-285 Motorized Micromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>4-channel Digital Oscilloscopes</td><td>Tektronix</td><td>TDS2000C</td><td></td></tr><tr><td>Powered Speakers</td><td>Harman</td><td>Model JBL&amp;nbsp;Duet</td><td></td></tr><tr><td>Manual Manipulator</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7</td><td></td></tr><tr><td>800 &amp;micro;m Fiber Optic Patch Cable</td><td>ThorLabs</td><td>FC/PC BFL37-800</td><td></td></tr><tr><td>Power Meter</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)</td><td></td></tr><tr><td>475 nm Cree XLamp XP-E</td><td>DigiKey</td><td>XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND</td><td>LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).</td></tr><tr><td>Arduino UNO</td><td>DigiKey</td><td>1050-1024-ND</td><td></td></tr></tbody></table>

a guide to in vivo single-unit recording from optogenetically identified cortical inhibitory interneurons

Una sfida importante in neurofisiologia è stato quello di caratterizzare le proprietà di risposta e la funzione dei numerosi tipi di cellule inibitoria nella corteccia cerebrale. Siamo qui condividiamo la nostra strategia per l&#39;ottenimento di stabili, ben isolate-single-unit registrazioni da interneuroni inibitori identificati nel topo corticale anestetizzato utilizzando un metodo sviluppato da Lima e colleghi 1. Le registrazioni vengono eseguite in topi che esprimono channelrhodopsin-2 (ChR2) in specifiche sottopopolazioni neuronali. I membri della popolazione sono identificati dal loro risposta ad un breve lampo di luce blu. Questa tecnica - chiamata &quot;PINP&quot;, o Identificazione Fotostimolazione-assistita di popolazioni neuronali - possono essere implementati con equipaggiamento di serie di registrazione extracellulare. Può servire come un&#39;alternativa economica e accessibile per l&#39;imaging calcio o patch visivamente guidato, al fine di indirizzare registrazioni extracellulari alle cellule geneticamente identificati. Here mettiamo a disposizione una serie di linee guida per l&#39;ottimizzazione del metodo nella pratica di tutti i giorni. Abbiamo raffinato la nostra strategia specifica per il targeting (PV +), le cellule parvalbumin-positivo, ma abbiamo trovato che funziona per altri tipi di interneuroni, nonché, come ad esempio (CR +) interneuroni-calretinina esprimono-somatostatina che esprimono (SOM +) e.

Siamo qui condividiamo la nostra strategia per ottenere registrazioni singola unità da interneuroni inibitori geneticamente classificati nel topo corticale anestetizzato, utilizzando un metodo optogenetic sviluppato da Lima et al. Tabella 1 i dettagli cocktail anestetico suggerito, Ketamina-Medetomidina-acepromazina (1. &quot; KMA &quot;). La Figura 1 illustra un microelettrodo di tungsteno, preparato per la registrazione. La figura 2 contiene uno schema circuitale di una semplice unità di controllo LED. La figura 3 contiene la configurazione e il codice per gating potenza di illuminazione con un microcontrollore Arduino. Figura 4 mostra un esempio di i manufatti elettrici di luce indotta discusso nel protocollo. Gli artefatti sono a volte incontrano (pannello di sinistra), ma facilmente corretti (pannello di destra). La Figura 5 mostra esempi di registrazioni da tre tipi di interneuroni otticamente-identificati (PV +, CR + e + SOM). Il pa sinistraNel presenta tracce di tensione prima e forme d&#39;onda allineate, rappresentativo del tipo di rapporto segnale-rumore si può sperare di ottenere con questa strategia. Picchi sono catturati in modo affidabile con una soglia di tensione fissa di diverse centinaia di microvolt. Una trama raster (pannello di destra) mostra la breve latenza e l&#39;affidabilità delle risposte di luce evocata, che consentono l&#39;identificazione univoca degli interneuroni ChR2-positivi. La figura 6 mostra la tensione tracce da tre PV + interneuroni, rispondendo a un impulso di luce 1 sec. La maggior parte dei + celle fotovoltaiche in grado di sostenere ad alta frequenza di emissione per centinaia di millisecondi, che li rende particolarmente facile da identificare. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51757/51757fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Preparazione di un elettrodo. &#160; (A) Schema di un elettrodo preparato. L&#39;elettrodo è affisso ad un tubo capillare di vetro utilizzando due piccole gocce di colla eccellente e una quantità minima di acceleratore (come Zap-E). Guaina termorestringente viene aggiunto per la presa, con fuoco molto basso. Gli elettrodi vengono spediti con la. (B) Fotografia pin del connettore precedentemente montate di un microelettrodo di tungsteno preparato montato in un portaelettrodo. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51757/51757fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. Schema elettrico per un&#39;unità di controllo LED. Un circuito semplice ed economico per la consegna della luce. Un LED super luminoso (475 nm) è collegato a un dissipatore di calore ed accoppiato all&#39;altra estremità di un cavo a fibre ottiche (800 micron di diametro). L&#39;uscita del LED è recintato con un impulso TTL. L&#39;unità di controllo comprende un alimentatore di tensione-mode per intensità di luce regolabile. 2K POT: potenziometro per controllare l&#39;intensità della luce. P / S: DC supp potere<html> mente (ad esempio, caricatore del computer portatile). SUGGERIMENTO 122: transistor Darlington. 4N35: isolatore ottico. Le parti elencate qui costano &lt;$ 10. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51757/51757fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Codice e la configurazione Arduino. Un treno di impulsi TTL per gating emissione di luce possono essere generati utilizzando un microcontrollore Arduino. Il programma specifica una durata dell&#39;impulso e ISI per un treno di impulsi loop. Le istruzioni per il caricamento del programma sulla scheda possono essere trovati nella pagina di Arduino &quot;Getting Started&quot; ( <a href="http://arduino.cc/en/Guide/HomePage" target="_blank">http://arduino.cc/en/Guide/HomePage</a> ). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51757/51757fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> IGURA 4 &quot;fo: content-width =&quot; &quot;src =&quot; 6in / file / ftp_upload / 51757 / 51757fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; . Figura 4. manufatto Luce elettrodi metallici sono suscettibili di manufatti leggeri, presenti al momento della comparsa e l&#39;offset di impulsi (pannello di sinistra, segnale filtrato, 300 - 5.000 Hz). In genere possono essere completamente eliminati (pannello destro) riposizionando la fibra ottica rispetto all&#39;elettrodo per cambiare l&#39;angolo della luce incidente e / o diminuendo la potenza luminosa. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51757/51757fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5. Esempio cellule. (A) Esempio registrazioni tipici interneuroni otticamente-identificati, PV + (viola), CR + (verde), SOM + (rosso). Le cellule rispondono al treno di impulsi di ricerca (durata dell&#39;impulso 30 ms, ISI 500 ms) con una raffica affidabile di punte. Il pannello di destra mostra 100 picchi di valle-allineati e. la forma d&#39;onda media interpolato (10x sovracampionato da una frequenza di campionamento di 10 kHz) (B) Trame raster per gli stessi file mostrano la breve latenza (~ 2-5 msec). e la tempistica coerente di picchi di luce evocata (C) Media e deviazione standard delle latenze di prima Spike (5 - 10 impulsi) per un campione di 44 PV + interneuroni (media media e deviazione standard: 3.4 +/- 2.6 msec). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51757/51757fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51757/51757fig6highres.jpg" width="600" /> Figura 6. Esempi di risposte sostenuta Si può essere particolarmente fiducioso per identificare PV + interneuroni come la maggior parte di loro in grado di sostenere ad alta frequenza di emissione per centinaia di millisecondi -. Che ricorda le loro risposte a correnteiniettabile in vitro 14. Tre cellule ChR2 / PV rispondono a impulsi di luce 1 sec: due che sparano regolarmente durante tutta la durata dell&#39;impulso, ed una insolita esempio di una cella che non è così (&lt;10% delle cellule incontrate). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> KMA (20.0 ml) </td></tr><tr><td> 2 ml di 100 mg / ml di ketamina (10 mg / ml, una volta diluito) </td></tr><tr><td> 0,4 ml di 1 mg / ml DEXDOMITOR (medetomidina; 0,02 mg / ml, una volta diluito) </td></tr><tr><td> 0,05 ml di 100 mg / ml Acepromazine (0,25 mg / ml, una volta diluito) </td></tr><tr><td> 17,55 ml di soluzione salina allo 0,9% </td></tr><tr><td> Dosaggio, topo adulto (15 - 40 g) </td></tr><tr><td> Knock-down: 0.012 ml / g * massa corporea (ketamina = 120 mg / kg) </td></tr><tr><td> Manutenzione: 0,0025 ml / g * massa corporea (ketamina = 25 mg / kg) </td></tr></tbody&gt; </table> Tabella 1. La ketamina-Medetomidina-Acepromazine (&quot;KMA&quot;). Knock-down e la dose di mantenimento di un topo adulto, diluito per mantenere l&#39;idratazione. Il cocktail è ri-somministrato ogni 40-90 minuti, se necessario.

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A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Una guida per<em&gt; In vivo</em&gt; Singola unità di registrazione da Optogenetically Identificato corticale inibitorio interneuroni

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

a-guide-to-vivo-single-unit-recording-from-optogenetically-identified

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

19.1K Views.  University of Oregon. Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching. 

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Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic nerve. In vivo recordings of ganglion cell spike trains in several animal models have revealed much of what is known about how the early visual system processes and encodes visual information. However, such recordings have been rare in one of the most common animal models, the rat, possibly owing to difficulty in detecting spikes fired by small diameter axons. The many retinal disease models involving rats motivate a need for characterizing the functional properties of ganglion cells without disturbing the eye, as with intraocular or in vitro recordings. Here, we demonstrate a method for recording ganglion cell spike trains from the optic chiasm of the anesthetized rat. We first show how to fabricate tungsten-in-glass electrodes that can pick up electrical activity from single ganglion cell axons in rat. The electrodes outperform all commercial ones that we have tried. We then illustrate our custom-designed stereotaxic system for in vivo visual neurophysiology experiments and our procedures for animal preparation and reliable and stable electrode placement in the optic chiasm.

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Retinal ganglion cells transmit visual information from the eye to the brain with sequences of action potentials. Here, we demonstrate how to record the action potentials of single ganglion cells in vivo from anesthetized rats.

Singola unità In vivo Registrazioni dal chiasma ottico di Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Ricerca

Neuroscienze

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

Mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the identification of the neuronal type in in vivo electrophysiological experiments in broad brain regions. In optogenetics experiments, it is critical to deliver the light to the recording site. However, it is often hard to deliver the stimulation light to the deep brain regions from the brain&#39;s surface. Especially, it is difficult for the stimulation light to reach the deep brain regions when the optical transparency of the brain surface is low, as is often the case with recordings from awake animals. Here, we describe a method to record spike responses to the light from an awake mouse using a custom-made glass optrode. In this method, the light is delivered through the recording glass electrode so that it is possible to reliably stimulate the recorded neuron with light in the deep brain regions. This custom-made optrode system consists of accessible and inexpensive materials and is easy to assemble.

This work introduces a method to perform an optogenetic single-unit recording reliably from an awake mouse using a custom-made glass optrode.

Optogenetica identificazione di un tipo di un neurone con un Optrode di vetro in topi svegli

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect distinct cellular and network components of these circuits remains unclear. Ex vivo brain slices provide a means by which investigators may probe discrete components of complex networks and disentangle potential mechanisms underlying the effects of volatile anesthetics on evoked responses. To isolate potential cell type- and pathway-specific drug effects in brain slices, investigators must be able to independently activate afferent fiber pathways, identify non-overlapping populations of cells, and apply volatile anesthetics to the tissue in aqueous solution. In this protocol, methods to measure optogenetically-evoked responses to two independent afferent pathways to neocortex in ex vivo brain slices are described. Extracellular responses are recorded to assay network activity and targeted whole-cell patch clamp recordings are conducted in somatostatin- and parvalbumin-positive interneurons. Delivery of physiologically relevant concentrations of isoflurane via artificial cerebral spinal fluid to modulate cellular and network responses is described.

Ex vivo brain slices can be used to study the effects of volatile anesthetics on evoked responses to afferent inputs. Optogenetics are employed to independently activate thalamocortical and corticocortical afferents to non-primary neocortex, and synaptic and network responses are modulated with isoflurane.

Attivazione optogenetica delle vie afferenti nelle fette cerebrali e modulazione delle risposte mediante anestetici volatili

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. Traditional in vitro electrophysiological techniques use electrical stimulation to evoke synaptic transmission. A major drawback of this method is its nonspecific nature; all axons in the region of the stimulating electrode will be activated, making it difficult to attribute an effect to a particular afferent connection. This issue can be overcome by replacing electrical stimulation with optogenetic-based stimulation. We describe a method for combining optogenetics with in vitro patch-clamp recordings. This is a powerful tool for the study of both basal synaptic transmission and synaptic plasticity of precise anatomically defined synaptic connections and is applicable to almost any pathway in the brain. Here, we describe the preparation and handling of a viral vector encoding channelrhodopsin protein for surgical injection into a pre-synaptic region of interest (medial prefrontal cortex) in the rodent brain and making of acute slices of downstream target regions (lateral entorhinal cortex). A detailed procedure for combining patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study short- and long-term synaptic plasticity is also presented. We discuss examples of experiments that achieve pathway- and cell-specificity by combining optogenetics and Cre-dependent cell labeling. Finally, histological confirmation of the pre-synaptic region of interest is described along with biocytin labeling of the post-synaptic cell, to allow further identification of the precise location and cell type.

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Here we present a protocol describing viral transduction of discrete brain regions with optogenetic constructs to permit synapse-specific electrophysiological characterization in acute rodent brain slices.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

Source: Richevaux, L., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/59534">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a protocol to study synaptic interactions and neuronal responses in a transfected mouse hippocampal brain slice. It involves illuminating long-range sensory neurons to trigger action potentials and recording the resulting excitatory post-synaptic potentials in the recorded neuron using the whole-cell patch-clamp technique.

Fotostimolazione e registrazioni di patch clamp a cellule intere di neuroni in fette di ippocampo di topo

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Solutions for acute slice ...

Una guida per

Riepilogo

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