Ringraziamo Janice Fischer per la fornitura del plasmide UAS-EGFP :: Msp-300 KASH. L&#39;anticorpo mAB24B10 è stato ottenuto dal Developmental Studies Ibridoma Banca sviluppato sotto gli auspici del NICHD e mantenuto dalla University of Iowa, Dipartimento di Biologia. Lo stock repo-GAL4 (BL7415) è stato ottenuto dal Bloomington Stock Center presso l&#39;Indiana University. Supporto dalla American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG # 58-006-53) alla Purdue University Center for Cancer Research è riconosciuto con gratitudine. Jingqun Ma è supportato da una ricerca agricola presso la Purdue assistentato in alimentazione e l&#39;agricoltura presso la Purdue University.

1. Generazione e caratterizzazione di EGFP :: KASH Drosophila <ol><li> Autista Croce Gal4 vola UAS-EGFP :: Msp-300 KASH vola. In alternativa, mosche ricombinanti che portano sia il driver GAL4 e il transgene UAS-EGFP :: Msp-300 KASH possono essere generati utilizzando tecniche genetiche standard. Questo secondo approccio è vantaggioso se sono necessarie grandi quantità di progenie. </li><li> Caratterizzare l&#39;espressione del marcatore EGFP :: KASH utilizzando tecniche di microscopia standard. Nota: espressione EGFP può essere osservato mediante tecniche di microscopia normali in sezionati, fissi tessuti di Drosophila, o in tutta larve, e non richiede l&#39;uso di un anticorpo. <ol><li> Determinare il modello di espressione della EGFP :: marcatore KASH in tutto l&#39;organismo sotto un microscopio a fluorescenza dissezione (vedi Materiali PDF). Nota: Molti piloti GAL4, compreso il conducente repo-GAL4 illustrato nella figura 1, mostra nmodelli onspecific di espressione in altri tessuti larvali come la ghiandola salivare (vedi risultati). </li><li> Analizzare il pattern di espressione EGFP :: KASH nel tessuto sezionato di interesse utilizzando la microscopia confocale. <ol><li> Fissare il tessuto di interesse utilizzando formaldeide ad una concentrazione finale del 4%, e macchia DNA utilizzando DAPI ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml di visualizzare la localizzazione della EGFP :: KASH tag rispetto al DNA. </li><li> Acquisire immagini utilizzando un obiettivo 40X / 1,30 olio per immersione o un obiettivo 20X / 0,75 olio di immersione, a seconda delle dimensioni del tessuto di interesse. Le seguenti condizioni di eccitazione / emissione possono essere usate per l&#39;acquisizione delle immagini: 408 nm/425-475 nm (DAPI); 488 nm / 525-550 nm (GFP). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Isolare Nuclei di Drosophila larvali tessuti <ol><li> Preparare attrezzature per la dissezione dei tessuti larvale e successivo isolamento nuclei. Si noti cheinteri embrioni dechorionated potrebbero anche essere utilizzati come materiale di partenza se desiderato. Si raccomanda di usare tessuti larvali parzialmente sezionato anziché intero larve se il tipo cellulare di interesse è presente in un tessuto specifico quale il disco immaginale. Questo riduce il legame non specifico, ed elimina anche i problemi che possono essere causati da espressione di alcuni driver GAL4 nelle cellule non bersaglio. <ol><li> Preparare due paia di pinze taglienti (vedi Materiali PDF), una lastra di vetro siliconato 9-bene (vedi Materiali PDF) e PBT (1x PBS, pH 7.4, 0.1% Tween-20). </li><li> Prebind l&#39;anticorpo GFP alle biglie magnetiche. Questo passaggio deve essere avviato prima di iniziare la dissezione. Aggiungere 10 ml di biglie magnetiche (Invitrogen, vedere Materiali PDF) e 2 mg di anticorpo GFP (Roche, vedi Materiali PDF) a 400 ml di tampone di lavaggio (1x PBS, pH 7,4; 2,5 mM MgCl 2) in una provetta da 1,5 ml . La quantità di perline e anticorpo utilizzato può essere ottimizzato se necessario, in base alla quantità di destinazione nel samPLE e l&#39;affinità di legame dell&#39;anticorpo ai talloni. </li><li> Incubare le perline e anticorpo con rotazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Posizionare il tubo da 1,5 ml contenente le perline e anticorpi nel rack magnetico (vedi Materiali PDF) e permettere le perle di legarsi magnetico per circa 1-2 min. Rimuovere il surnatante contenente l&#39;anticorpo non legato e tampone di lavaggio usando una pipetta 1 ml. Le perle resteranno vincolati alla parete della provetta da 1,5 ml sul lato adiacente al magnete. </li><li> Sciacquare le perle due volte con 1 ml di soluzione di lavaggio ogni volta come descritto nella sezione 2.1.4. Rimuovere la provetta da 1,5 ml dal rack magnetico e invertire brevemente per mescolare le perline e tampone di lavaggio durante ogni fase di lavaggio. </li><li> Conservare le perle anticorpo legato a tampone di lavaggio fino al momento di continuare con la fase 2.7. Le perle non dovrebbe essere permesso di asciugare in qualsiasi fase del protocollo. </li></ol></li><li> Sezionare tessuti larvali in PBT e trasferire i tessuti dissezionati diun pozzetto del piatto 9-bene. Tipicamente, la dissezione del lobo ottico e l&#39;occhio disco immaginale da 100 larve terzo instar fornisce materiale sufficiente per downstream analisi di espressione genica in seguito isolamento nuclei. </li><li> Risciacquare il tessuto isolato in tampone di estrazione nucleare (10 mM HEPES-KOH, pH 7,5; 2,5 mM MgCl 2; KCl 10 mM) in una provetta da 1,5 ml. Trasferire isolati tessuti larvali a un 1 ml Dounce Omogenizzatore (vedi Materiali PDF) sul ghiaccio che contiene 1 ml di tampone di estrazione nucleare fresco. Incubare in ghiaccio per 5 min. Non è necessario aggiungere inibitori della proteasi se RNA deve essere estratto dopo isolamento nuclei. </li><li> Distruggere il tessuto da 20 colpi con il pestello sciolto e poi incubare il campione in ghiaccio per 10 minuti per consentire alle cellule a gonfiarsi. Estrarre i nuclei delle cellule utilizzando 15 colpi con il pestello stretto. Il numero di colpi con i pestelli allentato e stretto deve essere ottimizzato per diversi tessuti e tipi di cellule; eccesso omogeneizzazione può provocarenuclei tosata, mentre omogeneizzazione insufficiente non estrarrà tutti i nuclei dal tessuto. </li><li> Filtrare l&#39;omogeneizzato, che contiene i nuclei e detriti cellulari, attraverso una dimensione dei pori del filtro 40 micron (vedi Materiali PDF) che è stato prerinsed con tampone di omogeneizzazione nucleare. Raccogliere il omogenato filtrato in una nuova provetta. </li><li> Raccogliere campioni di pre-isolamento per successive analisi per determinare la resa nuclei, l&#39;integrità nuclei, e di determinare livelli di trascrizione dei geni bersaglio prima di nuclei isolamento. <ol><li> Trasferire 50 ml di omogenato filtrata in una fiala da 1,5 ml con una pipetta. Questo è il campione pre-isolamento. Aggiungere 500 ml di Trizol reagente (vedi Materiali PDF, ATTENZIONE), miscelare e conservare a -20 ° C per il successivo isolamento di RNA (punto 3.1). </li><li> Trasferire 20 ml di omogenato filtrata in una fiala da 1,5 ml. <ol><li> Aggiungere DAPI ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml, e inccampione Ubate in ghiaccio per 10 min. </li><li> Trasferimento nuclei DAPI colorati con un coprioggetto rivestito poli-lisina, e mettere su un vetrino da microscopio. Sigillare il coprioggetto con smalto trasparente. </li><li> Verificare l&#39;integrità nuclei, e la presenza di nuclei GFP-tagged di interesse utilizzando microscopio a fluorescenza. Nota: Non è necessario fissare i nuclei, o colorare per GFP se queste diapositive sono analizzate in tempi ragionevolmente rapidi dopo la preparazione (entro 24 ore). </li></ol></li><li> Trasferimento 10 ml di omogenato filtrata in una fiala da 1,5 ml e aggiungere 90 ml di tampone di lavaggio (PBS 1x, pH 7,4; 2,5 mM MgCl 2). Aggiungere DAPI ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml, e incubare in ghiaccio per 10 min. Determinare la resa nuclei nel campione pre-isolamento con un emocitometro per contare i nuclei DAPI-positivi con epifluorescenza sotto un obiettivo 10X aria. </li></ol></li><li> Posizionare il tubo da 1,5 ml contenente le perline anticorpo-bound (preparati nella sezione 2.1.6) in un rack magnetico,e consentire alle sfere magnetiche di legarsi magnete per almeno 2 minuti come descritto nella sezione 2.1.4. Rimuovere il tampone di lavaggio dai branelli legata all&#39;anticorpo usando una pipetta 1 ml, e aggiungere l&#39;omogenato filtrato dal punto 2.5 al provetta da 1,5 ml con una pipetta 1 ml. </li><li> Capovolgere delicatamente la provetta diverse volte per mescolare e incubare a 4 ° C per 30 minuti con end-over-end agitazione. Evitare bolle nel tubo se possibile, in quanto questi possono causare aggregazione dei nuclei. </li><li> Posizionare il tubo da 1,5 ml contenente le perline anticorpo-bound e omogenato in un rack magnetica, e permettono le sfere magnetiche di legarsi al magnete per almeno 2 minuti come descritto nella sezione 2.1.4. Rimuovere l&#39;omogeneizzato contenente la frazione non legata nuclei con una pipetta 1 ml. </li><li> Lavare il campione 3x con 1 ml di soluzione di lavaggio ogni volta. Rimuovere il tubo da 1,5 ml contenente le perline, nuclei legati e lavare tampone dal rack e miscelare diverse volte, quindi inserire il tubo nel rack magnetico come descrittonel passo 2.9 e rimuovere il surnatante con una pipetta 1 ml. </li><li> Aggiungere 150 ml di tampone di lavaggio per le perline, che dovrebbero essere legati ai nuclei bersaglio. Questo è il campione post-isolamento. Preparare i campioni per le analisi di microscopia e di estrazione di RNA successiva. <ol><li> Trasferire 20 ml di campione post-isolamento per una nuova provetta da 1,5 ml e macchia con DAPI e analizzare come descritto nella sezione 2.6.2. Contare il GFP + / DAPI + e + GFP-/DAPI nuclei catturate da perline magnetiche per determinare la purezza della GFP + arricchito nuclei nel campione post-isolamento. </li><li> Aggiungere 1 ml di Trizol reagente al resto del campione post-isolamento, miscelare, e conservare a -20 ° C per il successivo isolamento dell&#39;RNA (passo 3.1). Nota: I campioni in Trizol possono essere conservati per diverse settimane, se necessario, a -20 ° C. Non è necessario per eluire i nuclei dalle perline magnetiche prima estrazione di RNA utilizzando Trizol reagente, because le perline non interferiscano con il successivo isolamento dell&#39;RNA. </li></ol></li></ol> 3. Determinare livelli di trascrizione nei nuclei isolati da tessuti larvali <ol><li> Isolare l&#39;RNA dai campioni pre-e post-isolamento isolamento preparati in sezioni 2.6.1 e 2.11.2 utilizzando il protocollo standard descritto per l&#39;estrazione di RNA-based Trizol (vedi Materiali PDF) con le seguenti modifiche: <ol><li> Dopo precipitazione del pellet di RNA, aggiungere 19,2 ml di acqua priva di RNasi e 0,8 ml di reagente RNASecure (vedi Materiali PDF) al pellet e incubare a 60 ° C per 20 minuti per inattivare RNasi. </li></ol></li><li> Determinare la concentrazione di RNA con un colorante fluorescente vincolante-RNA, come il kit Qubit saggio RNA (vedi Materiali PDF) usando l&#39;2.0 Fluorometro QubitR seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Sintetizzare cDNA utilizzando una trascrittasi inversa amplificando come il EpiScript Reverse kit trascrittasi e primer oligodT seguendo le istruzioni del produttore. Nota: in genere, 50 a 100 ng di RNA genera cDNA sufficiente per eseguire le analisi di espressione genica aerei. Quantità equivalenti di pre-isolamento e post-isolamento dell&#39;RNA dovrebbero essere usati per generare cDNA. </li><li> Aggiungere 180 ml di acqua priva di nucleasi al campione di cDNA 20 microlitri per diluire questo 10 volte prima di real-time PCR quantitativa (qPCR) analisi. Questa diluizione è un passo importante, perché campioni di cDNA non diluiti possono inibire la qPCR. </li><li> Preparare una master mix qPCR con polimerasi e dNTP, 4 pmoli ciascuno di avanti e indietro innesco, fatta con acqua sterile al volume finale di reazione di 20 microlitri. <ol><li> Disegnare primer qPCR per indirizzare geni suscettibili di essere espresso nel tipo cellulare di interesse, e allo stadio di sviluppo in cui il tessuto viene raccolto. Primer design per attraversare un introne, se possibile, in modo che genomica eprodotti cDNA PCR possono essere distinti. Nota: Se il profilo di espressione genica del tipo di cellula bersaglio non è noto, primers contro eGFP, che deve essere espressa specificamente nella popolazione nuclei targhetta, possono essere usati per ottimizzare il protocollo per un tipo particolare e tessuti (Tabella 1) cellule. </li></ol></li><li> Determinare i livelli di trascrizione relative di ciascun gene di interesse nei campioni pre-e post-isolamento isolamento rispetto ad una serie di diluizioni di cDNA preparato da tutto il tessuto. Livelli di trascrizione dei geni bersaglio dovrebbero essere normalizzati a un gene di riferimento, come Rpl32 (o, preferibilmente, più geni di riferimento). </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo può essere utilizzato per isolare o altamente arricchire specificamente nuclei contrassegnati da popolazioni di cellule miste in Drosophila embrionale o tessuti larvali. Usando questo protocollo, i nuclei possono essere isolate dai tessuti sezionati in circa 1 ora. La purezza e resa dei nuclei isolati devono essere determinati sperimentalmente per ogni tipo di cellula. Può essere difficile quantificare i nuclei del tallone con associazione nella fase post-isolamento del protocollo utilizzando un emocitometro causa delle perline presenti nel campione. Pertanto, se sono necessarie numero esatto di nuclei per un&#39;applicazione a valle, sarà necessario stimare rendimento nuclei basato su un metodo alternativo come contenuto di DNA. Calcoli esatti di rendimento nuclei non sono necessari per l&#39;analisi di espressione genica se RNA può essere isolato e quantificato correttamente. Si consiglia di utilizzare un metodo basato sulla fluorescenza per quantificare la resa di RNA, abbiamo trovato che la determinazione spettrofotometrica della concentrazione di RNAin questi campioni a bassa concentrazione è molto variabile. Ci sono due aspetti importanti del protocollo che influenzeranno il suo successo: la scelta di sfere magnetiche e anticorpi. Sfere magnetiche che sono accoppiati a proteina G GFP o sono disponibili in commercio da diverse fonti. Tuttavia, si raccomanda vivamente di utilizzare le proteine ​​G sfere magnetiche disponibili da Invitrogen per la procedura descritta in questo protocollo per due ragioni principali. In primo luogo, le dimensioni delle perline Invitrogen a 2,8 micron è leggermente inferiore alla dimensione media dei nuclei nei tipi cellulari esaminati, che è di circa 5 micron (Figura 2D). Sfere magnetiche che sono più piccoli (per esempio 50 nm, μMACS α-GFP, Miltenyi Biotech) non legano rapidamente a magneti stile lotto-wash, e le colonne di cui queste perle può inceppare con estratti di tessuti larvali. Sfere magnetiche più grandi (ad esempio 10 micron, proteine ​​PureProteome G magnetico BEADS, Millipore) non lega bene ai nuclei nei nostri test preliminari, e questi anche esporre una forte autofluorescenza negli stessi canali sia DAPI e GFP, che rende difficile individuare i nuclei nel campione tallone-vincolato da tecniche di microscopia standard. Oltre alla scelta di perline magnetiche, è importante usare un anticorpo GFP che funziona bene per immunoprecipitazione ma che non hanno un alto fondo non specifica. Per facilitare la riproducibilità di questo protocollo, abbiamo usato un anticorpo monoclonale di topo contro GFP. Anticorpi policlonali di coniglio contro GFP sono stati sperimentati con successo nei nostri studi preliminari, ma questi tendono ad avere sfondo superiore aspecifica. Altri anticorpi monoclonali sono stati testati (ad es Developmental Studies Ibridoma Bank), con vari livelli di successo. Così, la scelta anticorpo è un fattore importante nell&#39;isolamento successo di nuclei etichettati. Anche se in questo protocollo si descrivono i metodi per determellino livelli di gene trascritto in nuclei isolati, si prevede che l&#39;approccio descritto nei passaggi 2,1-2,11 sarà anche adatto per isolare i nuclei che possono essere utilizzati per la successiva analisi immunoprecipitazione della cromatina. Se il tessuto è fissato in 1% di formaldeide prima di omogeneizzazione (punto 2.3), quindi i tessuti dissezionati possono essere raccolti nell&#39;arco di diversi giorni e materiale sufficiente isolato per eseguire l&#39;analisi della cromatina immunoprecipitazione. Sulla base di conteggi ottenuti usando l&#39;emocitometro, che forniscono solo stime approssimative come discusso sopra, tipicamente ottenuto 1,3 x 10 4 e 2,7 x 10 4 nuclei gliali dall&#39;occhio disco immaginale e lobo ottica di 100 larve (Tabella 2). Così, utilizzando il nostro approccio, dovrebbe essere possibile avere materiale sufficiente per eseguire analisi di immunoprecipitazione della cromatina, a seconda della abbondanza del tipo di cellula bersaglio, e l&#39;epitopo di interesse. Un&#39;applicazione genetica utile di questa tecque è che può essere utilizzato per etichettare positivamente nuclei in specifici tipi cellulari in embrioni o larve che sono omozigoti per un allele mutante recessivo letale. Per fare questo, due stock fly distinte devono essere generati in cui l&#39;allele mutante di interesse viene ricombinato con un driver specifico GAL4, o con il transgene UAS-EGFP :: Msp-300 KASH il terzo cromosoma. Se le mosche che trasportano l&#39;allele mutante e il driver Gal4 sono incrociate per le mosche trasportano alleli mutanti e il transgene UAS-EGFP :: Msp-300 KASH, solo la progenie che hanno entrambe le copie dell&#39;allele mutante saranno etichettati con GFP nel tessuto in cui il driver GAL4 è espresso. Così, effetti specifici di cellule del recessivi alleli letali possono essere esaminate nelle fasi embrionali o larvali, prima della fase di letalità. Questa tecnica genetico è stato precedentemente utilizzato per etichettare positivamente cellule muscolari embrionali che erano omozigoti per mutazioni in subunità SAGA, sgf11 1 &lt;/ Sup&gt;.

Tessuti Drosophila come il sistema nervoso centrale contengono una miscela complessa di tipi cellulari. Così, per analizzare profili di espressione genica specifica-cellulari da tessuti di Drosophila, è prima necessario isolare una popolazione omogenea di cellule specifiche in quantità sufficienti per consentire applicazioni a valle. Metodi per isolare cellule da tessuti intatti includono microdissezione laser e cella fluorescenza-attivato (FACS) di cellule intere. Mentre FACS è stato usato per isolare cellule e nuclei da embrioni di Drosophila e da Caenorhabditis elegans per l&#39;espressione genica e cromatina profiling 1-3, FACS e microdissezione laser possono essere difficili da eseguire con successo nei tessuti che contengono tipi cellulari altamente mescolati tra loro o che le cellule contengono con morfologia irregolare, come i neuroni. Per superare questa difficoltà, nuclei piuttosto che cellule possono essere isolate da specifici tipi cellulari e utilizzati per la successiva generazionee profili di espressione. È importante sottolineare che, in base microarray-mRNA analisi di espressione utilizzando campioni di RNA nucleari mostra i risultati generalmente comparabili con quelli eseguiti utilizzando RNA totale 4, 5. Inoltre, l&#39;analisi di espressione genica utilizzando RNA nucleare è stato usato con successo per studiare l&#39;espressione genica in organismi multipli compresi C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila, e gli esseri umani 4, 5 2, 3. Diversi approcci sono stati recentemente descritto per l&#39;isolamento di specifiche popolazioni di nuclei etichettati da tessuti di Drosophila che sono adatti per l&#39;analisi di espressione genica e / o immunoprecipitazione della cromatina. L&#39;isolamento lotto di cromatina tessuto-specifico per il metodo di immunoprecipitazione (bit-Chip) utilizza FACS per isolare nuclei fissati sulla base di cellula-tipo particolare espressione di GFP nucleare localizzata 2. Questo approccio è stato successfully utilizzato per analizzare la distribuzione delle modificazioni degli istoni e fattori di trascrizione con cromatina immunoprecipitazione di nuclei isolati dal mesoderma di Drosophila embrioni 2. Tuttavia, gli approcci basati FACS possono essere meno adatti per isolare nuclei etichettati che costituiscono solo una piccola parte di una popolazione mista a causa della maggiore tempo liste necessario avere numeri adatti per applicazioni a valle. Per superare queste limitazioni, diversi gruppi hanno utilizzato tecniche di isolamento a base di affinità per purificare nuclei che sono etichettati con un epitopo specifico in un particolare tipo di cellula. L&#39;isolamento dei nuclei contrassegnati in tipi cellulari specifici metodi (intatto) sviluppati per l&#39;utilizzo in Arabidopsis thaliana 6, 7 è stato recentemente adattato per l&#39;uso in Drosophila 8. In questo metodo, una proteina dell&#39;involucro fusione nucleare che è un substrato per in vivo biotinylation è coexpressed con l&#39;Escherichia coli biotina ligasi Bira in tipi cellulari specifici. Nuclei marcati con biotina possono essere successivamente purificati da popolazioni miste che utilizzano basato streptavidina-isolamento affinità. Usando questo approccio, i nuclei sono stati etichettati con successo e isolato dal mesoderma di embrioni di Drosophila in cui una proteina dell&#39;involucro fusione nucleare è stato espresso sotto il controllo di un potenziatore specifico mesoderma 8. Gli autori hanno anche generate proteine ​​dell&#39;involucro di fusione nucleare che possono essere espressi in qualsiasi tipo di cellula sotto il controllo della sequenza regolatrice GAL4, UAS 9. Questo approccio è in grado di isolare rapidamente sottoinsiemi di nuclei etichettati da popolazioni miste, ma richiede tre costrutti transgenici separati e può quindi essere inadatto per applicazioni particolari genetici. Recentemente, un approccio è stato descritto in cui SUN (S AD1 e C-84 ONU)-dominio contenente proteine ​​che localizzano alla membrana interna dell&#39;involucro nucleare sono stati contrassegnati conproteine ​​fluorescenti ed espresso sotto il controllo del sistema Gal4/UAS 10. I nuclei sono stati isolati in presenza di detergente non ionico per rimuovere la membrana esterna della membrana nucleare, e purificati per affinità utilizzando biglie magnetiche accoppiate ad anticorpi anti-GFP. Questo approccio è stato utilizzato con successo per isolare piccole popolazioni di nuclei etichettati da specifici sottotipi neuronali all&#39;interno del cervello adulto di Drosophila 10. Qui, un protocollo per l&#39;isolamento di nuclei etichettati da una popolazione mista di cellule di Drosophila tessuto larvale è descritto. Questo metodo è stato sviluppato in modo indipendente, ma è simile a quello descritto da Henry et al. 10 In primo luogo, i nuclei sono stati etichettati con un tag fluorescente che viene espresso solo in specifici tipi cellulari in Drosophila melanogaster per facilitare il successivo isolamento di nuclei contrassegnate da popolazioni miste utilizzando un approccio basato affinità. Per etichettare nuclei,il dominio KASH (K larsicht / A nc-1 / S ino h omologia) è stato utilizzato. Il dominio KASH è un dominio transmembrana che localizza alla membrana esterna della busta nucleare, in parte attraverso le interazioni con SUN-dominio contenenti proteine ​​all&#39;interno dello spazio perinucleare 11. Il dominio KASH C-terminale delle proteine ​​come Drosophila Msp-300 e Klarsicht ancore queste proteine ​​alla membrana nucleare esterno, mentre i loro domini N-terminale interagiscono con proteine ​​del citoscheletro actina o come microtubuli nel citoplasma 12-14. Costrutti sono stati generati in cui il dominio KASH di Drosophila Msp-300 è stata fusa al C-terminale della EGFP, sotto il controllo della sequenza regolatrice GAL4, UAS nel vettore pUAST-attB 15, 16. Utilizzando integrazione sito-specifica phiC31, sono stati generati moscerini transgenici in cui le UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgene è stato inserito nel attP2 loci sul cromosoma3L 17. Il UAS-EGFP :: Msp-300 KASH aria può essere attraversato con le mosche che esprimono il conducente GAL4 in un particolare tipo di cellula, con conseguente espressione mirata di EGFP sulla membrana nucleare esterno nel tipo cellulare di interesse. Nuclei etichetta possono essere purificati da popolazioni di cellule miste che utilizzano anticorpi contro GFP accoppiati a sfere magnetiche. In questo approccio, l&#39;uso di detergente non ionico non è necessaria perché il tag EGFP è localizzato sul lato citoplasmatico della membrana nucleare esterno, ed è quindi accessibile agli anticorpi. Il protocollo descritto di seguito può essere utilizzata per isolare / arricchire nuclei EGFP-etichettata specifici tipi cellulari in Drosophila tessuti larvali, per quantificare la purezza e resa di nuclei isolati, e per estrarre RNA nucleare adatto per trascrizione inversa reazione polimerasica a catena quantitativa (qRT -PCR) analisi di espressione genica. L&#39;isolamento e l&#39;affinità purificazione dei nuclei (esclusi Tissue dissezione) può essere eseguito in meno di un&#39;ora. I risultati sono presentati mostrando che i nuclei gliali possono essere isolati con successo dal lobo ottica larvale e occhio disco immaginale, e utilizzati per la successiva analisi di espressione genica. Si prevede che questo approccio possa essere utile per l&#39;isolamento / arricchimento di nuclei etichettati da tessuti embrionali e larvali in cui le cellule bersaglio costituiscono meno del 5% della popolazione totale. Tutte le scorte Drosophila e plasmidi ottenuti da questo studio sono disponibili su richiesta degli autori.

<table><tbody><tr><td>Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>mAB24B10</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.</td></tr><tr><td>2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX</td><td>MidSci</td><td>BEQPCR-R</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)</td><td>Biotium</td><td>40011</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Homogenizer (1 ml)</td><td>VWR</td><td>62400-595</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Tweezers, 11 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.</td></tr><tr><td>EpiScript Reverse Transcriptase</td><td>Epicentre</td><td>ERT12910K</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf&quot;&gt;http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Falcon cell strainers, 40 &amp;mu;m pore size</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.</td></tr><tr><td>Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mini tube rotator</td><td>Genemate</td><td>H-6700</td><td></td></tr><tr><td>Qubit starter kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32871</td><td>Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. &lt;a href=&quot;http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf&quot;&gt;http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RNAsecure (Ambion)</td><td>Life Technologies</td><td>AM7010</td><td>The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.</td></tr><tr><td>RT-PCR machine Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>CFX Connect Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>Siliconized 9-well glass plate</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-134</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440-460 nm) excitation + yellow barrier</td><td>Nightsea</td><td></td><td>This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)</td></tr><tr><td>StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. &lt;a href=&quot;http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf&quot;&gt;http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

affinity-based isolation of tagged nuclei from drosophila tissues for gene expression analysis

Tessuti embrionali e larvali Drosophila melanogaster spesso contengono una miscela altamente eterogeneo di tipi di cellule, che può complicare l&#39;analisi di espressione genica in questi tessuti. Così, per analizzare profili di espressione genica specifica-cellulari da tessuti di Drosophila, potrebbe essere necessario isolare specifici tipi cellulari con elevata purezza e con rese sufficienti per applicazioni a valle come profiling trascrizionale e cromatina immunoprecipitazione. Tuttavia, la morfologia cellulare irregolare in tessuti come il sistema nervoso centrale, insieme con la rara popolazione di specifici tipi cellulari in questi tessuti, può porre problemi per i metodi tradizionali di isolamento cellulare come microdissezione laser e cella fluorescenza-attivato (FACS) . Qui, un approccio alternativo alla caratterizzazione dei profili di espressione genica specifica delle cellule utilizzando a base di affinità isolamento dei nuclei con tag, piuttosto che cellule intere, è descritto. Nuclei in c specificatipo ell di interesse sono geneticamente etichettati con un tag EGFP busta localizzato nucleare utilizzando il sistema di espressione binario Gal4/UAS. Questi nuclei EGFP-tag possono essere isolate utilizzando anticorpi contro GFP che sono accoppiati a biglie magnetiche. L&#39;approccio descritto in questo protocollo consente un isolamento uniforme di nuclei di specifici tipi cellulari nel sistema nervoso centrale larvale Drosophila ad elevata purezza ed a livelli sufficienti per l&#39;analisi di espressione, anche quando questi tipi cellulari rappresentano meno del 2% della popolazione totale di cellule nella tessuto. Questo approccio può essere utilizzato per isolare i nuclei da un&#39;ampia varietà di Drosophila embrionale e tipi cellulari larvali utilizzando specifici driver di GAL4, e può essere utile per isolare i nuclei da tipi di cellule che non sono adatti per FACS o microdissezione laser.

Il driver repo-GAL4 (Bloomington archivio numero 7415) è specificamente espresso in cellule gliali del sistema nervoso Drosophila, a diversi stadi di sviluppo 18. Le mosche sono stati generati che esprimono stabilmente UAS-EGFP :: Msp-300 KASH sotto il controllo del guidatore repo-GAL4 utilizzando tecniche genetiche standard. Per caratterizzare il profilo di espressione del transgene EGFP :: KASH in queste mosche, il pattern di espressione GFP nel lobo ottica sezionato e occhio disco immaginale da larve al terzo stadio è stata esaminata mediante microscopia confocale. I tessuti sono stati sezionati di contrasto con DAPI per marcare il DNA e con α-chaoptin 19 per etichettare gli assoni dei fotorecettori (mAb24B10, vedi Materiali PDF). figura 1A mostra che la EGFP guidato repo-GAL4 :: KASH transgene è espresso in glia nei lobi ottici e occhiali disco immaginale del pattern di espressione previsto. Sotto ingrandimento maggiore,Espressione EGFP è osservato in un modello circolare che circonda il DNA DAPI-positivo, coerente con localizzazione nucleare-busta della EGFP :: tag KASH (Figura 1B). Espressione EGFP può essere rilevato sia fisso e nei tessuti non fissati senza la necessità di amplificazione del segnale utilizzando un anticorpo contro GFP; anticorpi contro GFP non sono stati usati per visualizzare il EGFP :: espressione KASH Nella immagini mostrate nelle figure 1 e 2. Per determinare se il transgene EGFP :: KASH è espresso in modo aspecifico in altri tessuti in Drosophila larve, espressione GFP è stata esaminata in tutta larve al terzo stadio fluorescenza utilizzando un microscopio da dissezione. In particolare, l&#39;espressione non specifica del EGFP :: KASH transgene è stata osservata ad alti livelli nelle ghiandole salivari delle larve terzo instar. Ciò indica che il driver repo-GAL4 ha attività in alcuni tipi cellulari diversi glia nello stadio larvale dello sviluppo. Così, per isolare specificamente GliAL nuclei, il lobo ottico e l&#39;occhio disco immaginale da larve terzo instar sono stati isolati con dissezione prima di omogeneizzazione e l&#39;affinità isolamento. Per confermare che questo protocollo è adatto per l&#39;estrazione dei nuclei da tessuti di Drosophila, e di stimare la percentuale di nuclei contrassegnati presente in un dato tessuto, il campione pre-isolamento (sezione 2.6.2) da omogenati ottenuti dal lobo ottico e occhio disco immaginale di repo-GAL4, UAS-EGFP :: Msp-300 KASH terzo instar larve è stata esaminata. Figura 2A mostra un&#39;immagine rappresentativa del campione pre-isolamento ottenuto usando la microscopia confocale. In questa immagine, la presenza di nuclei è indicata da eventi DAPI-positivo. Sono inoltre osservato un piccolo numero di scarsamente sparsi GFP-positive, nuclei gliali DAPI-positivo. Si stima che i nuclei GFP-positive rappresentano meno del 2% della popolazione totale nuclei in questacampione (Figura 2A). La resa totale di nuclei lobo ottico e occhio dischi immaginali che sono stati sezionati da 100 larve è stata determinata per il campione pre-isolamento come descritto nella sezione 2.6.3 (Tabella 2). Un tipico esempio di pre-isolamento da 100 sezionati lobo ottico dell&#39;occhio e dischi immaginali contenute tra 0,8 e 1,2 x 10 7 nuclei, di cui circa il 2% erano GFP-positive. Figura 2B mostra un&#39;immagine rappresentativa di nuclei DAPI positivi in una regione definita del emocitometro. Si noti che i nuclei sono intatte, e mantengono una forma circolare uniforme nelle condizioni estrazione impiegati nel protocollo (Figure 2A e 2B). Per determinare se questo protocollo può essere utilizzata per isolare e / o altamente arricchire specifiche popolazioni di nuclei etichettati da tessuti contenenti popolazioni cellulari miste, α-GFP biglie magnetiche rivestite con anticorpi erano utilizzod isolare nuclei con targhetta da omogenati ottenuti dal lobo ottico e l&#39;occhio disco immaginale di 100 repo-GAL4, UAS-EGFP :: Msp-300 KASH terzo instar larve. Nelle Figure 2C e 2D, si può vedere che la EGFP :: KASH etichettato gliale nuclei legano alle biglie magnetiche rivestite α-GFP e sono osservate nel campione post-isolamento (sezione 2.11.1) dopo separazione magnetica. Sebbene le biglie magnetiche presentano alcuni autofluorescenza nel canale GFP, questi possono essere facilmente differenziate da nuclei branello-bound per la loro dimensione più piccola (2,8 micron per le biglie magnetiche contro circa 5 micron per i nuclei) e la mancanza di colorazione DAPI. Le GFP + / DAPI + nuclei rappresentano oltre il 95% dei DAPI eventi positivi nel campione post-isolamento. Così, la porta etichettato popolazione nuclei sono altamente arricchito nel campione relativo post-isolamento per il pre-isolamentocampione. La maggior parte dei nuclei del campione spettacolo post-isolamento nucleare forte-busta localizzata fluorescenza GFP, e di solito sono circondato da perline. Tuttavia, è possibile che un piccolo numero di nuclei senza tag potrebbe anche essere presente in questo esempio. Così, anche se i risultati della Figura 2C e nell&#39;analisi dell&#39;espressione genica in Figura 3 (vedi sotto) indicano che la porta etichettato popolazione nuclei gliali è altamente arricchito, la possibilità che alcuni nuclei di alcuni altri tipi cellulari non specifici sono anche presenti nel campione non può essere esclusa. Si raccomanda agli utenti di ottimizzare questo protocollo per la loro particolare tipo di cellula e tessuto di interesse a massimizzare l&#39;arricchimento della popolazione target nuclei, e per eliminare nuclei aspecifici vincolante. In particolare, il rapporto tra materiale di partenza rispetto all&#39;anticorpo e perline è probabile che sia importante per l&#39;arricchimento ottimale dei nuclei bersaglio. Per questo motivo, gli intervalli di totalenumeri presenti nei nostri esempi tipici pre-isolamento nuclei sono mostrati nella Tabella 2. Sulla base dei numeri totali nuclei presenti nel campione pre-isolamento, e la percentuale stimata di cellule gliali nella popolazione mista dal lobo ottico e occhio disco immaginale, la resa massima nuclei nel campione post-isolamento è stato dovrebbe essere compreso tra 1,6 x 10 5 e 2,4 x 10 5 nuclei. Tuttavia, utilizzando il emocitometro per determinare la resa nuclei come descritto al punto 2.6.3, il rendimento effettivo nuclei ottenuti nel campione post-isolamento era tra 1,3 x 10 4 e 2,7 x 10 4 nuclei. Questi rendimenti nuclei rappresentano stime approssimative, perché le perle presenti nel campione post-isolamento sembrano influenzare il caricamento accurata del emocitometro. Alcuni nuclei GFP-positive si osservano nel omogeneizzato non legato, indica che non tutti i nuclei GFP-positive nei sampio legano ai talloni in modo efficiente alle condizioni utilizzati in questo protocollo. Aumentando il tempo di legatura o eseguito le fasi sequenziali di isolamento potrebbe potenzialmente aumentare tale rendimento, ma questo potrebbe venire a costo di entrambi purezza e integrità dell&#39;RNA. Utilizzando le condizioni descritte in questo protocollo, una quantità sufficiente di RNA possono essere ottenuti nel campione post-isolamento per downstream analisi di espressione genica mediante PCR (Tabella 2). Così, questo protocollo è in grado di rapidamente e rigorosamente isolare nuclei bersaglio da tessuti che contengono popolazioni miste di cellule. Inoltre, è in grado di isolare specificamente nuclei bersaglio che costituiscono solo una piccola parte, meno del 5%, le cellule in una data popolazione. Ad ulteriore conferma che il campione post-isolamento è stato altamente arricchito per il nostro target di popolazione nuclei gliali, i livelli di trascritti per 4 diversi geni nel pre-isolamento </strong&gt; e post-isolamento campioni sono stati confrontati mediante RT-qPCR. I livelli di trascritto di elavata, nrv2 e eGFP stati determinati nei due campioni, e normalizzato al gene di riferimento, Rpl32, che è espressa a livelli equivalenti nelle cellule gliali e nel sistema nervoso centrale circostante (Figura 3). La differenza piega nel campione post-isolamento è mostrato relativa al campione pre-isolamento, che è impostato a uno. In Figura 3, il campione post-isolamento mostra livelli di trascrizione significativamente inferiori della specifica-neuronale gene elavata relativa al campione pre-isolamento. Ciò indica che i nuclei di cellule neuronali sono sotto-rappresentate nel campione post-isolamento. In contrasto, livelli di trascritto superiori sia del gliale arricchito nrv2 gene eGFP 10 e sono presenti nel post-isolazione del campione rispetto al campione pre-isolamento. Questo risultato indica che il campione post-isolamento è altamente arricchito per la popolazione bersaglio nuclei gliali. È importante notare che i livelli di trascrizione misurati in questo protocollo rappresentano trascritti nucleari, e quindi sono suscettibili di indicare i livelli di trascrizione attivo anziché mRNA di stato stazionario. Espressione riproducibile di pronti contro termine non è stato rilevato in entrambi i nostri campioni pre-isolamento o post-isolamento, suggerendo che la proteina Gal4 espressa dal driver repo-GAL4 può persistere dopo la trascrizione attiva del gene endogeno repo è cessata. Ciò è coerente con i risultati di altri studi in cui i nuclei etichettati con il promotore twi non mostrano livelli arricchiti di trascrizioni twi, forse a causa delle differenze nei tempi di sviluppo della trascrizione rispetto stabilità proteica 8. Taken insieme, questi risultati dimostrano che il protocollo descritto può essere utilizzato con successo per arricchire altamente nuclei bersaglio da tessuti che contengono popolazioni miste di cellule, e che i nuclei isolati sono adatti per l&#39;analisi di espressione genica. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51418/51418fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51418/51418fig1.jpg" /> Figura 1. Espressione modello di repo-GAL4, UAS-EGFP :: Msp-300 KASH linea di volo. (A) In terzo instar larve, repo-GAL4 pilota l&#39;espressione del transgene UAS-EGFP :: Msp-300 KASH in cellule gliali in ottica lobo, gambo ottica (os) e l&#39;occhio del disco immaginale (ndr). La busta nucleare in cellule gliali è etichettato con EGFP :: KASH (verde). R1 - R8 assoni delle cellule fotorecettori sono etichettati con α-chaoptin (mAB24B10, rosso) per il confronto, e il DNA è stained con DAPI (viola). Nuclei gliali GFP-etichettata sono visibili lungo la lamina (la) all&#39;interno del lobo ottica (contrassegnata da frecce). Barra della scala, 50 pm. (B) ingrandimenti Superiore di gangli lamina del lobo ottico che contiene EGFP :: KASH etichettato nuclei delle cellule gliali. Barra della scala, 50 pm. Immagini confocali sono state acquisite utilizzando un &#160; 40X / 1,30 olio o un &#160; 20X / 0,75 oggettiva olio di immersione, e l&#39;utilizzo di lunghezze d&#39;onda di eccitazione / emissione di 408 nm nm/425-475 (DAPI); nm/525-550 488 nm (GFP); nm/595-620 561 nm (Alexa 5,6,8 ). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51418/51418fig1highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51418/51418fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51418/51418fig2.jpg" /> Figura 2. Caratterizzazione dei nucleiin &quot;pre-isolamento&quot; e &quot;post-isolamento&quot; campioni. (A) immagine rappresentativa da un repo-GAL4, UAS-EGFP :: Msp-300 KASH campione di pre-isolamento analizzato utilizzando un X 20 / 0,75 oggettiva immersione in olio e lo standard microscopio confocale. DNA è macchiato con DAPI (blu), e EGFP :: KASH tagged nuclei gliali sono visualizzati in verde (contrassegnata dalle frecce). Barra della scala, 50 pm. (B) immagine rappresentativa dei nuclei DAPI-macchiati da un campione pre-isolamento su un emocitometro utilizzando un obiettivo X 10 aerei e microscopio a epifluorescenza standard. Griglie emocitometro sono mostrati in grigio chiaro. Nuclei Solo DAPI-positivi sono mostrati in questa immagine, come GFP fluorescenza non era visibile nell&#39;ambito di questo obiettivo sul microscopio a epifluorescenza. (C) l&#39;immagine rappresentativa di un repo-GAL4, UAS-EGFP :: Msp-300 KASH campione post-isolamentoanalizzata come descritto per il pannello A. L&#39;EGFP isolata :: KASH tagged nuclei gliali (contrassegnati da frecce) macchia positivamente per DAPI, e sono circondati da perline, che autofluorescenza a bassi livelli nel canale GFP. Barra della scala, 50 pm. (D) ingrandimenti superiore di un EGFP tipico isolato :: KASH tagged nuclei gliali (indicata dalla freccia) circondato da perline. Barra della scala, 5 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51418/51418fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51418/51418fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51418/51418fig3.jpg" /> Figura 3. Rappresentante dei dati qRT-PCR di &quot;pre-isolamento&quot; e di campioni &quot;post-isolamento&quot;. Livelli di trascrizione dei geni bersaglio sono stati determinati da qRT-PCR di pre-isolcampioni ation e post-isolamento ottenuti da repo-GAL4, UAS-EGFP :: Msp-300 KASH lobi ottici e oculari dischi immaginali. Tutti i livelli di trascrizione sono normalizzati a livelli di trascrizione Rpl32, e il campione di pre-isolamento per ogni gene bersaglio è impostato a uno. I risultati rappresentativi da un esperimento biologico sono indicati per i seguenti geni: ELAV, nrv2 e eGFP. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gene </td><td> Sequenza Primer (5 &#39;-3&#39;) </td><td> Dimensioni PCR prodotto (bp) </td></tr><tr><td> eGFP </td><td> GAGGGATACGTGCAGGAGAG </td><td> 102 </td></tr><tr><td></td><td> GATCCTGTTGACGAGGGTGT </td><td></td></tr><tr><td> nrv2 </td><td> GGCTGGTTGTAGTCGCAGTT </td><td> 125 </td></tr><tr><td></td><td> GGCACCCAACACGAGAACTA </td><td></td></tr><tr><td> elavata </td><td> GCACCATTCGGAGCAATAAT </td><td> 153 </td></tr><tr><td></td><td> TGTGCAGCTGGATGGTGTAG </td><td></td></tr><tr><td> Rpl32 </td><td> GCTAAGCTGTCGCACAAATG </td><td> 160 </td></tr><tr><td></td><td> CGTTGTGCACCAGGAACTT </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Primer utilizzati per l&#39;analisi qRT-PCR. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Numero totale di nuclei nel campione di pre-isolamento </td><td> Numero totale stimato di nuclei in campioni post-isolamento </td><td> RNA rendimento da campione post-isolamento (ng) </td></tr><tr><td> 0,8-1,2 x 10 7 </td><td> 1,3-2,7 x 10 4 </td><td> 160-220 ng </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Nuclei rappresentativi e le rese di RNA ottenuti.Tipici gamme di nuclei e delle rese di RNA ottenuti da campioni di pre-isolamento e post-isolamento da 100 lobo ottico sezionato e occhio dischi immaginali dalla repo-GAL4, UAS-EGFP :: Msp-300 KASH genotipo, in cui le cellule gliali sono etichettati con EGFP :: KASH. I nuclei sono stati quantificati come descritto in 2.6.3 e RNA è stato quantificato come descritto in 3.1.2.

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Isolamento basato sull'affinità di nuclei contrassegnati da tessuti di Drosophila per l'analisi dell'espressione genica | Biologia | Video

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Tessuti Drosophila spesso contengono una miscela eterogenea di tipi cellulari. Per esaminare l&#39;espressione genica in specifici tipi cellulari da un particolare tessuto, i nuclei possono essere geneticamente marcato e successivamente isolate utilizzando un approccio basato affinità. Isolato nuclei possono essere utilizzate per applicazioni a valle come l&#39;analisi dell&#39;espressione genica e della cromatina.

L&#39;isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em&gt; Drosophila</em&gt; tessuti per Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

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A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of individual cell populations often makes it difficult to obtain enough material for molecular studies. For example, the accessory gland of the Drosophila male reproductive system contains two distinct secretory cell types. The main cells make up 96% of the secretory cells of the gland, while the secondary cells (SC) make up the remaining 4% of cells (about 80 cells per male). Although both cell types produce important components of the seminal fluid, only a few genes are known to be specific to the SCs. The rarity of SCs has, thus far, hindered transcriptomic analysis study of this important cell type. Here, a method is presented that allows for the purification of SCs for RNA extraction and sequencing. The protocol consists in first dissecting glands from flies expressing a SC-specific GFP reporter and then subjecting these glands to protease digestion and mechanical dissociation to obtain individual cells. Following these steps, individual, living, GFP-marked cells are sorted using a fluorescent activated cell sorter (FACS) for RNA purification. This procedure yields SC-specific RNAs from ~40 males per condition for downstream RT-qPCR and/or RNA sequencing in the course of one day. The rapidity and simplicity of the procedure allows for the transcriptomes of many different flies, from different genotypes or environmental conditions, to be determined in a short period of time.

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Here, we present a protocol to dissociate and sort a specific cell population from the Drosophila male accessory glands (secondary cells) for RNA sequencing and RT-qPCR. Cell isolation is accomplished through FACS purification of GFP-expressing secondary cells after a multistep-dissociation process requiring dissection, proteases digestion and mechanical dispersion.

Un protocollo basato su FACS per isolare l'RNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili della Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Ricerca

Genetica

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolamento e purificazione di Drosophila Neuroni periferici da Magnetic Ordinamento Bead

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Biologia

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences that encode rRNAs, composing regions called ribosomal DNA (rDNA) loci. Many organisms' genomes contain more than one rDNA locus distributed across different chromosomes, and rRNA may be transcribed from multiple rDNA loci or only a single locus. Changes in rRNA transcription sources often indicate ribosomal distress. However, the homogeneity of rRNA obstructs distinguishing if rRNA is transcribed from multiple or a single rDNA locus. Here, we describe a method that uses single nucleotide polymorphism-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) to distinguish rRNA transcription between Drosophila melanogaster rDNA loci on the X and Y chromosomes. This method leverages locus-specific rRNA variants to enable easy detection of the source of rRNA transcription with single-cell resolution. This assay can be applied to any Drosophila cell type and may be adapted for use in other systems.

The protocol describes single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) method to distinguish ribosomal RNA transcripts derived from the X or Y chromosome ribosomal DNA locus in Drosophila melanogaster.

FISH sensibile al polimorfismo a singolo nucleotide Rilevamento della trascrizione dell'RNA ribosomiale specifico del locus in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Microdissezione laser applicata a profili di espressione genica di sottogruppo di cellule dal Drosophila Ala Disco

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Isolamento dei nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo con risoluzione a singola cellula

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene expression and chromatin state of individual cells allows the identification of the cell type and state. Single-cell sequencing approaches have revealed a number of important characteristics of cardiac progenitor cell heterogeneity. However, these methods are generally restricted to fresh tissue, which limits studies with diverse experimental conditions, as the fresh tissue must be processed at once in the same run to reduce the technical variability. Therefore, easy and flexible procedures to produce data from methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) are needed in this area. Here, we present a protocol to rapidly isolate nuclei for subsequent single-nuclei dual-omics (combined snRNA-seq and snATAC-seq). This method allows the isolation of nuclei from frozen samples of cardiac progenitor cells and can be combined with platforms that use microfluidic chambers.

Autore in primo piano: Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per la profilazione dell'epigenoma e dell'espressione genica con risoluzione di una singola cellula  

Here, we present a protocol describing cell nuclei preparation. After microdissection and enzymatic dissociation of cardiac tissue into single cells, the progenitor cells were frozen, followed by isolation of pure viable cells, which were used for single-nucleus RNA sequencing and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing analyses.

Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

Biologia dello sviluppo

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

L'isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di

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Un protocollo basato su FACS per isolare l'RNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili della Drosophila

Isolamento e purificazione di Drosophila Neuroni periferici da Magnetic Ordinamento Bead

FISH sensibile al polimorfismo a singolo nucleotide Rilevamento della trascrizione dell'RNA ribosomiale specifico del locus in Drosophila melanogaster

Microdissezione laser applicata a profili di espressione genica di sottogruppo di cellule dal Drosophila Ala Disco

Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

Tutta la Monte RNA fluorescente

Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in